植物血凝素的提取

植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。自制的方法常用生理盐水提取法。

（A）干品制备法（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。恒温箱内24-48小时；（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。每8-12小时摇荡一次。（也可一次性加100ml生理盐水）；（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。

（B）鲜品制备法：（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。（4）效价：正式使用前先用一定量作效价测定，按效价使用。

青豌豆的提取：取青豌豆100克，加含0.15M氯化钠的0.01M pH7.0磷酸缓冲液200ml浸泡过夜，经膨胀后用组织捣碎机捣碎，倒入布袋中压榨出水提液，在沉渣中再力0入磷酸缓冲液100ml搅拌，浸泡1时，压榨出水提液，合并水提液，量出总体积。加0.01％叠氮钠防腐。2．蛋白质沉淀：边搅边加入固体硫酸铵达80％饱和（每升溶液加硫酸铵561克）冷藏过夜。吸取上清液，沉淀再用二层滤纸抽气过滤至干，即得粗制青豌豆素蛋白沉淀物硫酸铵糊。置冰箱保存。3．亲和层析分离(1)装柱：取直径为1.0 cm，长度为25 cm的层析柱，按（实验十五）操作，自顶部缓缓加入稀薄的Sephadex G25悬液，待凝胶上升至距顶柱约3-5 cm即可，用1M NaCl溶液平衡10分钟。（2）加样并收集：称硫酸铵糊0.3克溶于 3 ml IM氯化钠中，离心3000rPm10分钟，取上层悬液上柱，用1M NaCl洗脱收集每管 3.5 ml，在280 nrn紫外光上比色检测，直至吸光值下降到接近零为止。此洗脱峰为不与葡萄糖亲和的杂蛋白峰。改用含0.2M葡萄糖的1M NaCl进行洗脱。收集每管 3.5 ml，也在280nrn处检测、直至吸光值下降至接近零为止。此洗脱峰为青豌豆素峰，再用1M NaCl洗脱，再生柱，约需10分钟。4．青豌豆素生物活性测定。取新鲜兔血l ml于抗凝管中，离心去除血浆，血球用生理盐水洗涤离心1000rpm／5min三次，直至洗液无血色为止，加生理盐水稀释20倍制成兔红细胞悬液，置冰箱中备用。取点滴板一块在三孔中分别滴入对照生理盐水、280 nrn吸收峰的吸光值相同的杂蛋白和青豌豆蛋白各2滴（用生理盐水将二种蛋白质稀释到吸光值相同），再分别滴入兔红细胞悬液1滴。置37℃保温10分钟，取出后分别用玻棒在孔中轻轻搅动，比较三者红细胞的凝集情况。再将杂蛋白和青豌豆素溶液进一步用生理盐水稀释成1：5、l：25、l：125、1：625……再用上述方法检查比较它们对兔红细胞的凝集作用，求出它们最大生物活性的稀释倍数。兔红细胞的凝集作用也可用显微镜下进行观察、比较。注意事项：不同蛋白质凝集活性的比较需在以相同280 nrn 吸光值的蛋白质量作对比，故必需稀释

PHA的提取，称取200g鸡子豆，粉碎，加入1000ml蒸馏水于4度冰箱中放置，

吸胀24h.再加入200ml蒸馏水搅拌均匀，在组织捣碎匀浆机内12000r/min匀浆2次，每次5min 置4度冰箱抽提24h，然后用纱布过滤，弃掉虑渣，滤液经4800r/min离心20分钟，收集上清。将上清分成3份，一份4度保存，直接用于活性测定，一份加入(NH4)2SO4至40%饱和度，充分搅拌，置4度冰箱过夜，将过夜后的抽提液4800r/min离心20分钟，收集沉淀，在上清内加入(NH4)2SO4至40%饱和度，收集沉淀，合并两次沉淀，用适量蒸馏水溶解后作活性测定，一份用截留分子量为100KD的中空纤维超滤膜进行超滤，收集超滤液和浓缩液作活性测定

传统方法提取：将红芸豆粉碎，过60目筛，得细粉。将红芸豆脱脂，按1：8（w/v）体积比加入石油醚，4度脱脂2次，每次4 h ，温室下将石油醚挥发除去，得脱脂芸豆粉，备用。

称取5g脱脂云粉，与0.9%生理盐水按1：8（w/v）混合4度放置48h，3层纱布过滤，过滤用离心机3000r/min离心20min，收集上清液。