以动物细胞系统大量制造活性蛋白质

第十一章

以动物细胞系统大量制造活性蛋白质

Preparation of Large-scale Active Proteins

Using Animal Cell Culture System

吴灿辉

环球基因生物科技股份有限公司研发生产部经理

一, 前言

动物细胞培养技术很早即建立,初期常因微生物的污染受困扰,至1913年Carrel将外

科无菌操作技术应用在动物细胞培养上,细胞始能长期培养而不受污染.1916年Rous及

Jones利用胰蛋白(trypsin)由组织中分解细胞,发展出附著性细胞的次培养法(subculture).在1948~1952期间,mouse纤维母细胞(fibroblast)和HeLa两种细胞株先后

被Earle与Gey等学者建立.1955年Eagle开发生化学配方培养液(chemical defined

medium),使得细胞培养不必再依赖体液培养.配合分子生物与生物科技技术的进展,1975

年Kohler和Milstein研发出融合瘤(hybridoma)技术,之后被广用於单株抗体的制备.80

年代第一个由动物细胞制造的重组蛋白组织胞浆素原激活(tissue plasminogen activator;

t-PA)由美国Genentech 公司以中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary

cell,CHO)正式

生产.

在培养角瓶(T-flask)进行的小量细胞培养是确立一株新细胞或用以研究细胞形态及比较

不同试剂对细胞生长与代谢之影响的最佳细胞培养方式.但是有愈来愈多的应用需要使用大

量的动物细胞,例如:萃取细胞组成份(如109细胞可以提供 7 mg DNA);使用大量细

胞培

养病毒以制备疫苗(一般每批次使用5x1010细胞);以及许多医药用重组蛋白制剂之生产,如

干扰素(interferon),红血球生成素(erythropoietin),胞浆素原激活,酵素,贺尔蒙,快速检

验试剂与抗体,规模达到10,000 L之动物细胞培养在生物科技产业制造过程已被广泛使用.

这方面的进展已由昂贵,花费人力提升至大规模的'单元操作'系统(unit process system).虽

然单元操作系统可以节省成本且更有效果,但是将其使用於细胞培养放大生产仍需一系列的

修改以克服一些大量生产的限制因子,例如氧气限制,剪力伤害(shear damage),养分的供

给以及大量新陈代谢产物的生成与排除,在本章以下的内容将针对这些大量生产的限制因子

提出讨论.

以动物细胞做为生产活性蛋白的一个重要考量点在於动物细胞合成的蛋白质可正确折叠

(folding)形成四级结构且蛋白质释放出细胞之前会进行一系列转译后修饰作用

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(post-translational modification),其中最重要的是醣化作用(glycosylation),醣化作用对蛋白

的生物活性表现以及在人体中代谢速率有极大影响性,所以现在表现医疗用活性蛋白常使用

动物细胞为宿主.目前动物细胞可依其性质,形态及培养特质来分类,以其性质来分有初代

细胞(primary cell),正常细胞(normal cell)及持续性细胞株(continuous cell line)三种.

初代细胞是直接以胰蛋白将动物组织或器官加以分解而得;正常细胞是指具成对染色体,

培养时须有培养表面供其附著,单层长满后即不再继续增生,可用胰蛋白让这些细胞脱离

附著面进行继代培养,但无法永续地培养,有一定生长代数.相反地,细胞株则可持续地培

养.生物蛋白制剂生产所使用的细胞依其形态则可分类为纤维状(fibroblast-like)及表皮状

(epithelial-like)两种不同的细胞.若以培养时是否需要附著面,又可分为悬浮性(suspension)及附著性(adherent)两种细胞.悬浮式细胞培养是一种最易於放大生产培

养的方式,因为1 L培养槽在概念上与1000 L培养槽是相似的,只是对於环境控制及维持细

胞生长之正确生理环境需要较多的考量.附著性细胞培养因受到培养表面与氧气营养供给问

题,较不容易以单一培养槽体放大培养生产,须有周边配备协助,但是近年来的一些改良设

备已有突破性的进展,在本章后半段将会进一步探讨.

二, 影响大量细胞培养之参数

1. 培养容器与培养表面

最标准非抛弃式动物培养细胞容器是玻璃制品,在大量培养中则以不锈钢制品取代.细

胞通常易於贴附於玻璃表面,如有需要可以先处理过玻璃以提高细胞贴壁效果.在悬浮式细

胞培养,细胞通常不需要细胞贴壁,而且玻璃培养容器须以矽胶(silicone)处理培养表面,通

常使用的有:Sigmacote (Sigma-Aldrich),Dow Corning

1107,dimethyldichlorosilane

(Repelcote, Hopkins and Williams).表面处理后须以大量水冲洗乾净以防止溶剂残留.在较

复杂的生物反应器中通常以不锈钢或矽胶管来连接不同的组成部分,矽胶管对於气体具有相

当的通透性,同时有许多不同管壁厚度可供选择,不管使用不锈钢或矽胶管必须慎选合适的

连接器(connector)以确保操作过程的无菌性.

气体过滤器(vent filter)对於气体进出生物反应器是必要的,即使连续式气体的供应并非

必要,但一个过滤器出入口对於整个生物反应器压力的平衡及培养液进出仍是相当

重要的,

这个气体过滤器必须采用非湿性(non-wettable)且为绝对0.22 m孔径大小的产品.

2. 培养液与营养成分

一定成份的营养成分只能供应一定细胞的生长,各种细胞的来源不同,所喜好的营养成

分也不相同,除了一些大部份细胞共同需要的成分之外,最好能针对所选用细胞研究其所特

殊需求之添加物,组成最适合该细胞生长及生产成品的培养液.培养液与营养成分已被Ham

与McKeehan (1),Litwin(2),Waymouth(3)等学者仔细探讨.细胞培养液对於大量细

胞培养的

功用主要在两方面,第一:维持一个适合的生理环境包括pH与渗透压;第二:提供大

量细

胞生长与制造产物所需之足够养分.早期的培养液是根据分析血浆或其他生物液体

而调配出

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来,例如199(4).有另一种设计方式是降低培养液组成配方至最低而显示哪些成分

是生长所

必须,这种培养液称为"极少培养液"(minimal medium).经由这个方式,Eagle发明了MEM

培养液(minimal essential medium)(5).经由四,五十年细胞培养制程的改

良,MEM,199,

DMEM (6),RPMI 1640 (7)与F12 (8)现已成为使用最广泛之细胞培养基础培养液,这些培养液