大肠杆菌无细胞表达系统

大肠杆菌无细胞表达系统

传统的大肠杆菌表达系统经过不断的改进优化，具有生产周期短、效率高、成本低等一系列的优点，但是也存在系统自身的缺陷性，除了无法完成真核蛋白的折叠与修饰外，至今人们利用该系统仍无法解决膜蛋白以及一些毒性蛋白表达，严重制约着大肠杆菌表达系统的应用。为弥补原核表达系统的不足，人们常用真核表达系统来表达重组蛋白，但是真核表达系统步骤繁琐、周期长、蛋白产量低、费用高等一系列问题，也给真核表达系统的推广应用设置了一个比较高的门槛。目前，随着人们对蛋白表达系统研究的不断深入，使得蛋白的无细胞表达从可能变成了现实，解决了膜蛋白和毒性蛋白在大肠杆菌表达系统中无法表达或仅能以包涵体形式存在的难题。

大肠杆菌无细胞表达系统目前最为常见的是E.coli S30提取物表达系统。E.coli S30提取物系统(E.coli S30Extract Systems)是利用omp T胞内蛋白酶和lon蛋白酶活性缺失突变体菌株E.coli B制备而来，通过添加氨基酸、T7RNA聚合酶和能量物质等来实现目的蛋白的表达。

大肠杆菌无细胞表达系统制备目的蛋白基本原理如下：1、质粒DNA或是直接的PCR产物，在RNA聚合酶的作用下在体外合成mRNA；2、利用细胞抽提物中的转录因子、各类合成蛋白质所需的酶和外加补充的氨基酸、能源物质、tRNA等将mRNA翻译成蛋白质；3、转译后释放的mRNA再循环利用无细胞系统合成蛋白质，重复数次后mRNA失活。

大肠杆菌无细胞表达系统制备目的蛋白的流程大致如下：

1、E.coli B菌液制备，生长对数期收集菌体；

2、大肠杆菌细胞破碎（超声波、玻璃珠研磨、低温高压等），制备E.coli S30提取物系统；

3、加入氨基酸、T7RNA聚合酶和能量物质等构成反应体系；

4、表达质粒的加入，孵育，检测；

5、目的蛋白纯化。

大肠杆菌无细胞表达系统相比于大肠杆菌表达系统，具有更多的优势：

1、可以直接利用PCR的基因片段作为模板表达目的蛋白，省略载体构建、转染、阳性克隆筛选、表达等大量的步骤，节省大量时间；

2、可以直接实现多个蛋白在同一体系中同时表达，直接用于蛋白互作验证实验；

3、通过96T板等，可以实现多个蛋白的同时表达，完成蛋白的快速筛选；

4、实现标记蛋白的制备，以及特殊氨基酸的引入；

5、实现跨膜蛋白的表达，解决部分蛋白原核表达为包涵体的难题；

6、可以直接干预蛋白的表达，实现蛋白表达的人为操控。

武汉云克隆诊断试剂研究所