动物生物化学第十七章核酸技术

限制性核酸内切酶—— 一把神奇的“手术刀”
具有内切和甲基化两种功能 能够识别外源的核酸并将它切除 有特异的识别位点，通常为4-8对碱基的旋转对称结构
在其切口处留下黏性末端（sticky end）——具有互补序列
的单股链，或者平头末端（blunt end） 有3种类型，II型为主 例如： EcoRI
同一物种不同生态型之间DNA多态性产生的RFLP
指 纹 分 析 应 用 于 刑 侦
DNA 1. 2. 3. 4. 6. 7. 8. 5. 9. Marker，8. 10 都是对照 嫌疑人A血细胞DNA 被害人衣服上残留精液DNA 嫌疑人B血细胞DNA 被害人阴道取样DNA 被害人血DNA 实验对照
第17章 核酸技术
Technology of Nucleic Acid
本章主要内容：

DNA重组技术


基因鉴定
核酸技术的应用
一个梦想已成真
对遗传分子核酸的结构与功能的阐明，用于研究核酸的工具
酶的开发，由核酸的分子杂交性质建立起的一系列分析技术，使
我们已经能够按照自己的意愿来摆布和操作基因，去改变生命有 机体的遗传性状，甚至制造出新的物种，以服务于人类。重组
5. 简述肾上腺素通过cAMP/PKA途径中酶的级联放大效应催化肌肉糖原 分解的生物化学原理。
目的基因克隆的技术路线
黏性末端
利用表型特性，核酸杂交 以及免疫化学等方法对克 隆进行筛选
（如细菌）
（如质粒，噬菌体等）
目的基因的制备

直接从染色体中分离 人工合成 逆转录合成cDNA cDNA文库：用细胞全部mRNA经反转录制备全套cDNA后建库。

构建基因文库
PCR扩增
目的基因的载体
2.基因鉴定
聚合酶连锁反应（ PCR, DNA polymerase chain reaction ） 目的基因可以通过以下系统在试管中得以大规模扩增
一个温度和时间可以控制的反应体系
含有双链DNA模板 耐热的DNA聚合酶（如Taq酶）
一对设计适当的RNA引物，dNTP原料，过量
经“变性---退火---延伸”多次循环使目的DNA得以扩增
分子杂交等技术可用来筛选重组克隆
用探针鉴定DNA 称为Southern 印迹,鉴定RNA称 为Northern印迹
Southern-blot印迹杂交原理示意图
染 色 体 的 原 位 杂 交
基因芯片的应于 发育生物学研究
在基础研究和应用领域具有广泛用途的DNA 芯片
DNA指纹（DNA fingerprint）
分子杂交是一系列基因来自百度文库定方法的基础
印迹技术（ Blotting） Southern blot——用探针鉴定DNA Northern blot——用探针鉴定RNA 原位杂交（Hybridization in situ） 指纹分析（Finger printing） 基因芯片（ DNA microarray）
DNA技术使人类千百年的梦想变为了现实。
生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了“硕鼠”
1.DNA重组技术
DNA重组技术是利用多种限制性内切酶和DNA连接酶等工具酶，以DNA 为操作对象，在细胞外将一种外源DNA（来自原核或真核生物）和载体 DNA重新组合连接（重组），形成重组DNA，然后将重组DNA转入宿主细胞 （如大肠杆菌等），使外源基因DNA在宿主细胞中随宿主细胞的繁殖而增 殖，并在宿主细胞中得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有 的遗传性状。“基因工程”（gene engineering）或“分子克隆” （molecular cloning）。
从上世纪90年代初开始，用了10年时间，人类完成了 对自身染色体的30亿对碱基的序列测定，这就是所谓 的人类基因组项目（HGP）
在人类基因组项目基本完成之后，人类蛋白质 组项目将要展开，旨在对人类基因组表达的全部蛋 白质进行全面的、高通量的、精细的分析，这是后 基因组时代的新的研究领域，对于人类认识自己，
质粒是可以独立复制 并在细菌之间转移的 遗传单位，质粒还能 赋予宿主菌某种表型
plasmid DNA Genomic DNA
其他的基因载体还有 如：噬菌体，病毒等
含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过 规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）
打 开 古 了 埃 人片及 们段一 窥已具 探经木 过得乃 去到伊 的克的 窗隆一 户 个 DNA
DNA核苷酸序列分析
Sanger 双 脱 氧 链 终 止 法
分子杂交（Molecular hybridization）
利用一个标记的（如用同位素标记），特异的，单股 DNA或RNA片段——探针（probe）， 可以： 研究DNA之间的亲缘关系；


发现基因的缺失或突变；
测定某种遗传信息的量； 鉴定某种基因 基因治疗等
排序 属
种
品系
限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下黏性末端）
目的基因克隆的技术路线
获得目的基因
选择合适的可以携带目的基因的载体
把目的基因插入到载体中去，得到重组载体 将重组载体导入宿主细胞进行克隆（通过无性繁殖，随着宿主目的基
因也得以扩增）
对重组的克隆进行筛选 使重组的宿主细胞大规模的表达目的基因
2.DNA的复制包括哪些主要阶段？为什么复制具有半保留性？为什么说子 链的合成是半不连续的？
3.转录的终止出现在DNA分子中特定的碱基顺序上。原核DNA转录的终止顺 序有明显的结构特点，请予描述。除此以外，还有什么其它的终止转录的 方式？
4. 关于蛋白质多肽链的翻译过程，请你 a.说明氨基酰-tRNA合成酶的特点； b.图示原核70S 起始复合物； c.解释延伸因子Tu的作用； d.指出何时肽酰基转移酶起作用。
基因重组技术的 两个基本目的
1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等 2.利用基因的表达产物 疫苗、药物、 组织激活物、 生长因子、 珍稀蛋白等
核酸酶学
50年来，核酸酶学的进步为DNA的分析与鉴定提供了有力的工具。主要的
核酸酶有：
DNA聚合酶（DNA polymerase ） klenow 片段， Taq 酶 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ） 逆转录酶（Reverse transcriptase） S1核酸酶（ S1 nuclease） 连接酶（Ligase） 拓扑异构酶（Topoisomerase）等
控制疾病的意义将难以估量。
3.核酸技术的应用

在生命科学研究中的应用 在动物疾病诊断中的应用


在动物遗传育种中的应用
在生物制药中的应用

在农业中的应用
本章结束
动物生物化学练习（3） 1.氨基酸参与了动物体内一些重要含N 小分子的合成。请指出以下3种物 质的主要功能，它们各由哪些氨基酸为原料转变而成。 a. 肾上腺素； b. 磷酸肌酸； c. 嘧啶