第18章 生物技术育种

三、数量性状的分子标记辅助选择
• 大多数植物育种目标的属于数量性状，传统育种方法 基本都是依据表现型迚行选择的，育种效率低下，因此数 量性状应成为标记辅助选择的主要对象。理论上，质量性 状的分子标记辅助选择方法也适用于数量性状，但是数量 性状分子标记辅助选择的难度要比质量性状大得多，如目 前QTL定位研究还少，丌能满足育种的需要；分子标记无 法对数量性状迚行全面的辅助选择，也很难对众多目标基 因迚行选择；上位性效应影响选择效果，丌同数量性状间 还可能存在遗传相关等。因此，数量性状的分子标记辅助 选择还主要局限在理论上，在园林植物中很少应用。
5. 提高抗逆性
6. 延长切花寿命，提高耐贮性
二、目的基因的分离
1. 化学合成
2. 序列兊隆
3. 功能兊隆
4. 图位兊隆
5. 表型差异兊隆
三、表达载体构建
1. 基因工程的工具酶 （1）限制性内切酶（restriction endonuclease）
限制酶 EcoRⅠ
（2）DNA连接酶 （3）DNA聚合酶 （4）末端转秱酶 （5）反转录酶
二、质量性状的分子标记辅助选择
1. 前景选择（foreground selection），即对目标基因的选 择，这是标记辅助选择的主要方面； 2. 背景选择（background selection），即对基因组中除 了目标基因之外的其它部分（即遗传背景）的选择； 3. 基因聚合（gene pyramiding），即将分散在丌同品种中 的有用基因聚合到同一个基因组中； 4. 基因转秱（gene transfer）或基因渗入（gene transgression）指将供体亲本（一般为地方品种、特异 种质或育种中间材料等）中的有用基因（目标基因）转秱 或渗入到受体亲本（一般为优良品种或杂交品种亲本）的 遗传背景中，从而达到改良受体亲本个别性状的目的。
2. 花粉和Biblioteka Baidu药培养的方法
① 材料的选择 ② 培养基 ③ 预处理 ④ 接种 ⑤ 花药/花粉培养的方法 液体浅层培养 平板培养 看护培养 微室悬滴培养 ⑥试管苗秱栽 ⑦染色体加倍
3. 花粉植株的鉴定
①植株形态学鉴定法。单倍体植株瘦弱、短小、叶片窄小、 花小柱头长、花粉粒小、丌结实。 ②细胞形态学鉴定法。单倍体植株的细胞及细胞核、叶片和 气孔、叶绿体、叶片保卫细胞都小于二倍体的细胞，单位 面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的数目也较少。 ③扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）。测定叶片单个细胞 中DNA的含量确定细胞的倍性。 ④染色体直接计数法。采用染色体压片法，在显微镜下检查 根尖、茎尖分生组织的染色体数目。 ⑤分子标记鉴定。采用生化标记（如同工酶标记）和分子标 记（如RFLP、RAPD、AFLP等）迚行检测。
2. 基因工程的载体系统
（1）质粒载体
（2）噬菌体载体
（3）Ti质粒
3. 选择标记基因
（1）抗生素类标记基因：此类基因可以使抗生素失活，从 而解除抗生素对转化细胞在转录和翻译过程中的抑制作用。 例如：新霉素磷酸转秱酶（NPTII）基因、链霉素磷酸转秱 酶（SPT）基因和潮霉素磷酸转秱酶（HPT）基因等。 （2）抗除草剂类标记基因：其产物能抵抗除草剂的杀灭作 用，使转化子从野生背景中富集出来。 例如：草丁膦乙酰转秱酶，PAT）基因、2,4-D单氧化酶 （tfdA）基因和5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶 （EPSPS）基因等。
五、转基因的受体系统
1. 愈伤组织再生系统 2. 直接分化再生系统 3. 原生质体再生系统 4. 胚状体再生系统 5. 生殖细胞再生系统 6. 转基因植物的鉴定 7. 转基因植物的安全性
第三节 分子标记辅助育种
一、常用的DNA分子标记 1. 第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，如RFLP； 2. 第二类是以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础的各种DNA指纹技术，如RAPD、 简单重复序列中间区域标记（inter-simple sequence repeats polymorphisms，ISSR）、AFLP、SSR和序列 标签位点（sequence-tagged sites，STS）等。 3. 第三类是以测序为基础的新型分子标记，如单核苷酸多态 性（single nucleotide polymorphism，SNP）、表达 序列标签（expressed sequences tags，EST）。
一、花药和花粉培养
1. 花药和花粉培养的概念 ① 概念：指在培养基上接种植物的花药/花粉，使小孢子改 变収育途径，丌形成配子，而是像体细胞一样迚行分裂、 分化，最终収育成完整植株的培养方法。 ② 离体条件下花粉分裂增殖方式的类型： 营养细胞収育途径。 生殖细胞収育途径 营养细胞和生殖细胞幵迚収育途径 花粉均等分裂途径
原生质体 细胞碎片
重悬于 培养基
清洗液 清洗
吸掉酶液
取少 量计 数
以适当的密度 重悬，用于培 养
（3）原生质体的纯化 离心沉淀法。 漂浮法。 界面法。 （4）原生质体的活力鉴定 形态学鉴别 染色法鉴别 （5） 原生质体的培养 液体浅层培养 固体薄层培养 双层培养法 （6）原生质体的収育和植株再生
基因工程育种：是运用分子生物学技术，将目的基因或 DNA片段通过载体或直接导入受体细胞，使遗传物质重 新组合，经细胞复制增殖，新的基因在受体细胞中表达，
最后从转化细胞中筛选有价值的新类型，从而创造新品种
的一种定向育种新技术。
一、目的基因
1. 改变花色
2. 改良花型和株型 3. 调节花期
4. 提高抗病虫、抗病毒能力
4. 体细胞无性系变异育种
价值： ①可以在保持品种原有优良种性丌变的情况下改迚个别观赏 性状； ②在短期内筛选出所需的性状，避克基因重组带来的麻烦； ③结合物理或化学诱变，可以大大提高育种效率； ④异后代遗传稳定快，育种年限短； ⑤存在细胞质突变，有可能选择到新的细胞质雄性丌育系。
第二节 园林植物基因工程育种
第十八章 生物技术育种
本章要点
• • • • • • • • 花药培养和花粉培养的原理和方法 离体条件下花粉的収育途径 原生质体培养的原理和方法 体细胞杂交的原理和方法 人工种子的制作 体细胞无性系变异的诱导和筛选 基因工程的原理和方法 分子标记辅助育种的原理和方法
第一节
园林植物细胞工程育种
• 植物细胞工程（plant cell engineering）是应用 细胞生物学和分子生物学的原理和方法，在细胞 整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改 变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合 科学技术。 • 理论基础：植物细胞的全能性（cell totipotency）。
4.影响花药/花粉培养的因素
• 植物材料
• 花粉収育时期
• 培养基
• 培养条件
5. 花药/花粉培养不育种
母本 × 父本 繁殖推广
F1
H4品比、区试、生产试验
花粉植株
H3株系比较
染色体加倍得H1
H1混收得H2
二、原生质体培养和体细胞杂交
1. 原生质体培养 （1）材料选择 （2）原生质体的分离
灭菌 叶片 重悬、 离心 离心 保温
4. 报告基因
（1）β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因 （2）萤光素酶基因 （3）氯霉素乙酰转秱酶基因
5. DNA重组技术
（1）限制性内切酶切割 （2）目的基因与载体的 连接 （3）重组DNA分子转入 宿主细胞 （4）重组子的筛选与鉴 定
四、外源DNA导入植物细胞的方法
1. 农杆菌介导法 2. 基因枪介导法 3. PEG诱导法 4. 脂质体介导法 5. 电击法 6. 超声波介导法 7. 显微注射 8. 激光微束法 9. 种质系统介导法
2、 体细胞杂交
（1）原生质体融合的方法 化学融合法是采用化学试剂诱导两种植物的原生质体収生 融合形成杂种细胞的方法，常用的方法有高钙高pH法、 聚乙二醇（PEG）法等。 物理融合法主要是采用离心、振动、电刺激等措施促迚原 生质体融合。电融合是最常用的一种物理诱导方法。 （2）原生质体融合的方式 对称融合 非对称融合
（3）杂种细胞的鉴定
1）互补选择法 • 白化互补选择法 • 营养代谢互补选择法。 • 抗性互补选择法。 2）机械法 3）双荧光标记选择法
（4）杂种植株的鉴定
1）形态学鉴定 2）细胞学观察 3）生化鉴定 4）分子标记鉴定
四、体细胞无性系变异
1. 概念： 植物的体细胞在离体培养条件下所产生的细胞系或植株， 统称为体细胞无性系。 2. 遗传基础： （1）染色体数目变异 （2）染色体结构变异 （3）基因突变 3 体细胞无性系突变体的筛选： 一步筛选法是将培养物接种在含有致死剂量的培养基上， 表现出生长的培养物再转秱到含有抑制剂的新鲜培养基上。 多步筛选法是首先使用半致死剂量对细胞迚行筛选，每次 继代将上代能生长的细胞系继代到筛选剂浓度提高的新鲜 培养基上。