最新基因表达检测RTPCR
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进 入 夏 天 ，少 不了一 个热字 当头， 电扇空 调陆续 登场， 每逢此 时，总 会想起 那 一 把 蒲 扇 。蒲扇 ，是记 忆中的 农村， 夏季经 常用的 一件物 品。 记 忆 中 的故 乡 ， 每 逢 进 入夏天 ，集市 上最常 见的便 是蒲扇 、凉席 ，不论 男女老 少，个 个手持 一 把 ， 忽 闪 忽闪个 不停， 嘴里叨 叨着“ 怎么这 么热” ，于是 三五成 群，聚 在大树 下 ， 或 站 着 ，或随 即坐在 石头上 ，手持 那把扇 子，边 唠嗑边 乘凉。 孩子们 却在周 围 跑 跑 跳 跳 ，热得 满头大 汗，不 时听到 “强子 ，别跑 了，快 来我给 你扇扇 ”。孩 子 们 才 不 听 这一套 ，跑个 没完， 直到累 气喘吁 吁，这 才一跑 一踮地 围过了 ，这时 母 亲总是 ，好似 生气的 样子， 边扇边 训，“ 你看热 的，跑 什么？ ”此时 这把蒲 扇， 是 那 么 凉 快 ，那么 的温馨 幸福， 有母亲 的味道 ！ 蒲 扇 是 中 国传 统工艺 品，在 我 国 已 有 三 千年多 年的历 史。取 材于棕 榈树， 制作简 单，方 便携带 ，且蒲 扇的表 面 光 滑 ， 因 而，古 人常会 在上面 作画。 古有棕 扇、葵 扇、蒲 扇、蕉 扇诸名 ，实即 今 日 的 蒲 扇 ，江浙 称之为 芭蕉扇 。六七 十年代 ，人们 最常用 的就是 这种， 似圆非 圆 ， 轻 巧 又 便宜的 蒲扇。 蒲 扇 流 传 至今， 我的记 忆中， 它跨越 了半个 世纪， 也 走 过 了 我 们的半 个人生 的轨迹 ，携带 着特有 的念想 ，一年 年，一 天天， 流向长
操作步骤（二）
4. 2-8 ℃ ，12000×g 离心10-15分钟；
将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml 异丙醇室 温下沉淀10分钟；
5. 2-8 ℃ ，12000×g 离心15分钟；
6. 弃上清，加1ml 75％乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务 必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），7500×g 离 心5分钟，小心弃上清；
7. 室温静置5－15分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20 µl DEPC水溶解，保存于-70 ℃ 。
8. 取2 µl 琼脂糖电泳检测RNA质量。
RNA的琼脂糖凝胶电泳
1. 用乙二醛/甲酰胺对RNA进行预变性，然后进 行琼脂糖凝胶电泳
2. 用甲醛和二甲基亚砜对RNA进行预处理，在 含6％或2.2mol/L甲醛的凝胶中电泳
实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳
带评价RNA质量
实验材料：水稻幼嫩叶片
提取方法：
➢ 苯酚/氯仿反复抽提 ，价廉但质不优， 尤其是对多酚等含量高的材料不适
➢ 蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法 ➢ 强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可
配合氯化铯离心或有机溶剂提取。
Trizol Reagent
RNA EXTRACTION (mini prep)
RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的 调节和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性 对于Northern blot, RT-PCR和cDNA文库的构建等分子 生物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关 键的因素是尽量减少RNA酶的污染。
防止内源RNA酶降解RNA
材料要新鲜; 裂解过程要同RNase活性抑制同步
RNA酶抑制剂
RNA酶是一种很顽固的酶，在RNA 分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的 完整性。用来使RNA酶不发挥作用的 RNA酶抑制剂主要有：
1. DEPC 2. 氧钒核糖核苷复合物 3. RNA酶的蛋白质抑制剂
长 的 时 间 隧 道，袅
基因表达检测RTPCR
基因表达分析
Northern Blotting
Reverse Transcription PCR
RNA抽提
反转录
基因特异性引导 Oligo(dT)引导 随机六核苷酸引物引导
Leabharlann Baidu
cDNA
Northern Blotting
PCR
基因表达水平
•Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993.
RNA抽提前应准备的其它试剂及物品：
1. 75％乙醇（in DEPC-treated water) 2. 氯仿 3. 异丙醇（RNA专用） 4. RNase-free water：Draw water to RNase-free glass
bottles. Add diethylpyrocarbonate （DEPC）to 0.1% . Let stand overnight and autoclave. 5. 防止外源RNase的污染： 应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180ºC烘烤3hrs 以上；塑料制品DEPC水清洗，蛋白质变性剂处理；一 次性用品如tube, tip等使用新的，无RNA酶的产品。
利用Trizol 试剂 抽提植物总RNA
Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相 的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中， 能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA 的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水 相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。
用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少， 可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA，体外翻译 和分子克隆等。
操作步骤（一）
• 液氮磨样，每管分装0.1克样品； • 每管加1毫升Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体
积的10％），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置 于冰上）；室温下净置5－10分钟以利于核酸蛋白质复合 体的解离； 1. 加200 µl的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟 左右；
DEPC:
是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧 基甲酸化形式破坏RNase的活性
氧钒核糖核苷复合物:
O
C-CH2-CH3 O
C-CH2-CH3 O
能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百 地抑制RNA酶的活性
RNA酶蛋白质抑制剂 Ribonuclease Inhibitor
可与RNase形成非共价的复合物，从而使RNA酶失活。 不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。
操作步骤（二）
4. 2-8 ℃ ，12000×g 离心10-15分钟；
将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml 异丙醇室 温下沉淀10分钟；
5. 2-8 ℃ ，12000×g 离心15分钟；
6. 弃上清，加1ml 75％乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务 必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），7500×g 离 心5分钟，小心弃上清；
7. 室温静置5－15分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20 µl DEPC水溶解，保存于-70 ℃ 。
8. 取2 µl 琼脂糖电泳检测RNA质量。
RNA的琼脂糖凝胶电泳
1. 用乙二醛/甲酰胺对RNA进行预变性，然后进 行琼脂糖凝胶电泳
2. 用甲醛和二甲基亚砜对RNA进行预处理，在 含6％或2.2mol/L甲醛的凝胶中电泳
实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳
带评价RNA质量
实验材料：水稻幼嫩叶片
提取方法：
➢ 苯酚/氯仿反复抽提 ，价廉但质不优， 尤其是对多酚等含量高的材料不适
➢ 蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法 ➢ 强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可
配合氯化铯离心或有机溶剂提取。
Trizol Reagent
RNA EXTRACTION (mini prep)
RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的 调节和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性 对于Northern blot, RT-PCR和cDNA文库的构建等分子 生物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关 键的因素是尽量减少RNA酶的污染。
防止内源RNA酶降解RNA
材料要新鲜; 裂解过程要同RNase活性抑制同步
RNA酶抑制剂
RNA酶是一种很顽固的酶，在RNA 分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的 完整性。用来使RNA酶不发挥作用的 RNA酶抑制剂主要有：
1. DEPC 2. 氧钒核糖核苷复合物 3. RNA酶的蛋白质抑制剂
长 的 时 间 隧 道，袅
基因表达检测RTPCR
基因表达分析
Northern Blotting
Reverse Transcription PCR
RNA抽提
反转录
基因特异性引导 Oligo(dT)引导 随机六核苷酸引物引导
Leabharlann Baidu
cDNA
Northern Blotting
PCR
基因表达水平
•Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993.
RNA抽提前应准备的其它试剂及物品：
1. 75％乙醇（in DEPC-treated water) 2. 氯仿 3. 异丙醇（RNA专用） 4. RNase-free water：Draw water to RNase-free glass
bottles. Add diethylpyrocarbonate （DEPC）to 0.1% . Let stand overnight and autoclave. 5. 防止外源RNase的污染： 应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180ºC烘烤3hrs 以上；塑料制品DEPC水清洗，蛋白质变性剂处理；一 次性用品如tube, tip等使用新的，无RNA酶的产品。
利用Trizol 试剂 抽提植物总RNA
Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相 的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中， 能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA 的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水 相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。
用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少， 可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA，体外翻译 和分子克隆等。
操作步骤（一）
• 液氮磨样，每管分装0.1克样品； • 每管加1毫升Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体
积的10％），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置 于冰上）；室温下净置5－10分钟以利于核酸蛋白质复合 体的解离； 1. 加200 µl的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟 左右；
DEPC:
是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧 基甲酸化形式破坏RNase的活性
氧钒核糖核苷复合物:
O
C-CH2-CH3 O
C-CH2-CH3 O
能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百 地抑制RNA酶的活性
RNA酶蛋白质抑制剂 Ribonuclease Inhibitor
可与RNase形成非共价的复合物，从而使RNA酶失活。 不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。