1 植物细胞工程的理论基础

生 长 中 心 （ 拟 分 生 组 织 ）
器 官 原 基
芽 形 成
在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤 组织即可形成器官原基，有两种情况， 一是外植体中已存在器官原基，进一步培 养即形成相应组织器官进而再生植株， 另一种情况是外植体形成分生细胞团后在 分生细胞团上直接形成器官原基。
一般认为，芽和茎原基通常起源于培养组 织中比较表层的细胞，即外起源， 而根原基则发生在组织较深处，是内起源。
二.离体培养中细胞的脱分化 （Dedifferentiation） 脱分化 外植体―→愈伤组织或 ↗体细胞胚↘完整植株 脱分化细胞↘不定器官↗ 直接伸长 茎尖培养（较大时）――→完整植株 发育 幼胚培养（较大时）――→完整植株
外植体： 植物组织培养中用来进行无菌培养的离体 材料，可以是器官、组织、细胞和原生质 体等。
胚性愈伤组织
非胚性愈伤组织
注意： 1、并不是所有的细胞脱分化的结果都必 然形成愈伤组织。有些植物体的细胞脱分 化以后直接形成胚性细胞，进而形成体细 胞胚。 2、多数愈伤组织内的细胞并不都是未分 化的细胞，即同一愈伤组织内的细胞之间 其状态存在一定的差异。
三.细胞分化 细胞分化，是指导致细胞形成不同结构， 引起功能改变或潜在发育方式改变的过 程。分化也可以说是相同基因型的细胞 所具有的各个不同的表现型。 时间上的分化：一个细胞在不同的发育 阶段上可以有不同的形态结构和功能； 空间上的分化：对于多细胞生物来讲， 同一细胞后代，由于所处的环境不同而 可以有相异的形态结构和功能
二.器官分化的过程
离体条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要 经过三个生长阶段 1.外植体经过诱导形成愈伤组织。 2.生长中心的形成。当把愈伤组织转移到有利 于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成 丛出现类似形成层的细胞群，称之为生长中心 或拟分生组织，它们是愈伤组织形成器官的部 位。 3.器官原基及器官形成。生长中心形成后，按 照其已确立的极性，某些细胞开始分化形成管 状细胞，进而形成微管组织，开始形成不同的 器官原基，进而分化出相应的组织和器官。
培养细胞变异的类型 1、自发产生的变异，即培养物在未加诱 变因素的情况下产生变异。 2、诱发产生的变异，即培养物在诱变因 素作用下产生变异。 前者变异率一般在10-7~10-6之间，后者一 般在10-5~10-4。
1、自发产生的变异
A.染色体多倍性和非整倍性
Triticum durum 6 个无性系植株体细胞染色体数 (括号外为个体数，括号内为染色体数) 序号 1 2 3 4 5 6 5(9, 11, 12) 3(7) 1(11) 2(12) 2n<14 1(7) 2n=14 7 3 6 1 6 1 2n=15～27 37(16～24, 26) 5(17, 20, 23) 21(15,18,21～27) 4(16, 21, 22, 27) 5(15, 22, 26) 18(18, 20～26) 2n=28 2n=29～55 2n=56 2n>58 76 11 33 22 14 21 8(29, 39, 40) 1(33) 3 3 1(32) 1(40) 2 4 2 1
转移至无毒素培养基继代培养两代
转移到致死剂量和高于致死剂量的培养基培养，统计存活率
二、变异原因：
1、 植物本身的异质性（嵌合性）（不是真正意 义上的突变） 无性繁殖植物的体细胞中，存在广泛的异质性 （如体细胞突变等原因造成），在整体中被掩盖， 无法表现出来。在离体培养中，原来具有不同类 型的细胞被诱导分裂，由这些变异的细胞再生的 植株为变异植株，经过一定的选择，选育新品种。
脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结 构、无明显极性的、松散的细胞团称为愈伤组织。 愈伤组织的种类 1、胚性愈伤组织 （Embryonenic callus）： 表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。 胚性愈伤组织容易形成胚状体，所以被称为 胚性愈伤组织。 2、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、 细胞大。
1．细胞分化与基因组变化 细胞分化过程中，可以观察到的最常见的 变化是染色体的反复复制，而并不进行细 胞分裂。核内染色体的复制过程可以区分 出两种主要类型： 一是核内有丝分裂，导致核内多倍体， 二是大量复制染色丝，导致形成多线染色 体。 另一类基因组的变化是基因重排。例如， 在玉米、金鱼草等植物中，转座子的移动 能引起很多发育性状的改变，
三.影响器官分化的因素
1.外植体- 位臵、状态及组织类型（芦荟、 小麦） 外植体的状态和组织类型影响诱导和分化 的难易； 外植体的部位直接影响器官分化的类型。 例如：芦荟
有变态器官（如鳞茎、球茎、块茎等）的 植物，在培养中往往也容易形成相应的变 态器官，如百合、水仙等鳞茎类植物培养 中往往易形成小鳞茎；马铃薯等块茎植物 培养中则可观察到块茎的形成。这一特性 也使以变态器官为繁殖体的植物实现实验 室工厂化生产种子提供了可能。
§2.器官发生
一．离体培养中器官发生的方式 二. 器官分化的过程 三. 影响器官分化的因素
植物的离体器官的发生： 培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织） 分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽 （ adventitious shoots）等器官的过程。
不定根：从茎、叶上生出的根叫做不定根
不定芽：不是从叶腋或枝顶发出，而是从叶子、 根上或从树干上发出的芽
一.离体培养中器官发生的方式
通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式： 第一种方式是先芽后根；如小麦，芦荟、苹果 第二种方式为先根后芽；如枸杞、苜蓿等 第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和 根，再通过维管组织的联系形成完整植株。如 胡萝卜、石刁柏
1.植物细胞工程的理论基础
§1. 细胞分化与细胞全能性 §2. 器官发生 §3. 离体培养下的遗传与变异
§1.细胞分化和全能性
一. 细胞全能性的一般概念 二.细胞分化 三.离体培养中细胞的脱分化、再分化
一.细胞全能性的一般概念 一个细胞所具有的产生完整生物个体的固 有能力称之为细胞的全能性。 细胞全能性的绝对性与相对性: 不是所有基因型的所有细胞在任何条件下 都具有良好的培养反应;即使对于植物细 胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细 胞均可以直接产生植物个体;动、植物细 胞全能性的表现程度存在明显的差异。
2.生长调节剂 生长调节剂在细胞生长与个体发育中具有 重要的调控作用。离体培养下的器官分化 在大多数情况下是通过外源提供适宜的植 物生长调节剂来实现的。 种类、浓度和不同类型生长调节剂的比例 是影响根芽等分化的关键。
3.光照 光照有利于维管组织和叶绿体形成进而分化芽 愈伤组织的诱导培养一般是在黑暗或弱光照条件 下进行的，细胞中完全没有维管成分，当转入强 光照条件下以后，才能逐渐变绿并形成维管组织。 分化培养的初期连续光照能促进愈伤组织变绿， 随后的昼夜交替则有利于细胞极性的建立，从而 促进器官分化。 有些植物，只有在一定的光周期条件下才能分化 芽，如天竺葵的愈伤组织进入器官分化培养，一 般要在16h/d光照和8h/d黑暗条件下才能分化芽。
b、蔗糖浓度
Wetmore 和 Sorokin 的洋丁香组织培养中试验
蔗糖浓度对于维管组织发生的影响
蔗糖浓度(％ ) 1％ 2％ 2.5～ 3.5% 4％ 维管组织类型 数量很少的木质部 木质部形成，韧皮部不能形成 木质部和韧皮部都能形成 韧皮部形成，木质部不能形成
C、光照与温度
光照对于维管组织的分化具有促进作用， 适宜的温度对于维管组织的分化是必需的。
2.细胞分化与极性建立 极性是指植物的器官、组织、甚至单 个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结 构以及生理生化上的梯度差异。 在很多情况下，细胞的不均等分裂是是细 胞极性建立的标志。 无论是在活体还是在离体条件下，目前一 般认为，极性的建立和维管成分的产生， 是植物细胞分化的基本特征
3.细胞分化的过程 细胞分化可分为两个阶段： 1.决定：早期在动物发育研究中使用这一 概念，它通常是指胚胎细胞在发育过程中 发生的不可逆的特化现象。因此，决定就 是细胞发育途径的确定，它是细胞分化的 早期过程； 2.分化细胞特征逐渐表现：在大多数情况 下，细胞从决定到表现特定细胞特征通常 需要经过几代细胞的传递（细胞分裂）。
4.影响细胞分化的因素 a.激素 生长素能促进维管组织形成 细胞分裂素与木质部的发生有关
激素在细胞分化中的作用，可能是通过在 转录或翻译水平上的调节作用而影响相关 基因的表达从而调控细胞分化。 但植物中细胞种类的不同或同一种细胞不 同的发育状态，均会影响该种细胞对激素 的反应，即靶细胞反应差异，所以试图寻 找不同激素在分化中作用的共同模式可能 是很困难的。
2、培养条件引起的变异 变异原因可能与如下因素有关： 1） 培养基中添加的激素 2） 形成愈伤组织过程中，细胞分裂异常 3）环境条件的改变（温度、光照时间及强 度与原来生长环境不同）
三.影响离体培养细胞遗传变异的因子 1、供体植株 倍性水平、基因型、外植体细胞的分化 程度 2、培养基及培养方式 培养基的成分、物理状态及培养类型 原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养 的变异，而细胞培养的变异又大于组织器 官培养的变异 3、继代培养的次数 一般来讲，继代时间越长、继代次数越多， 细胞变异的几率越大。
4.温度 愈伤组织诱导培养时，温度可以适当提高，而分 化温度比诱导温度要低。如烟草，愈伤组织生长 时33℃仍可良好生长，而分化则必需在18℃条件 下才适宜。 与光周期相似，某些需要通过低温春化的植物， 在离体培养中器官形成有时也需要低温处理，特 别时对于某些特殊目的的培养，需要考虑这一因 素，如菊苣根培养产生的愈伤组织，诱导分化时 经低温处理可形成花芽，而在25℃下培养只能形 成营养芽。
Leabharlann Baidu
§3.离体培养下的遗传与变异
一、培养细胞变异的类型 二、变异原因 三、影响离体培养细胞遗传变异的因子 四、体细胞无性系变异的诱导 五、优良变异的筛选方法 六、体细胞无性系变异的利用 七、变异的抑制
一、培养细胞变异的类型 离体培养中，组织、细胞、原生质体培养再生 植株中，会有各种各样的变异。例如，叶色、 花色的变异，株高、果实大小的变异，染色体 结构和数目的变异，由于离体培养条件下并没 有发生雌雄配子的重组和交换。 由于它们没有发生有性过程，因此，我们把在 组织培养条件下所表现的遗传与变异特征称之 为体细胞遗传与变异，由此发展起来的遗传学 分枝称为体细胞遗传学。
B.畸形变异
最常见的变异是白化苗突变，其次是产生 丛生芽、肉质茎芽等。
安祖花
C.非遗传变异 a、外遗传变异（epigenetic variation) 在植物愈伤组织培养过程中，常常出现一 种不涉及基因结构的变化，而只是在基因 表达水平上的变异，如最常见的生长素自 养型变异。这种变异不能通过有性世代传 递给后代植株，但在离体条件下却可以经 过培养继代，长期保存。（马铃薯）
b、生理适应（physiologic adaptation） 变异 通常是在某种外界条件存在时才表现 出变异，外界条件不存在时，变异也随之 消失
2、诱发产生的变异（抗镰刀菌毒素细胞变异系的分离）
将诱导产生的愈伤组织接种在含不同浓度梯度毒素的培养基上
筛选得到半致死剂量浓度、100%生长抑制生长浓度、 致死计 量浓度 以半致死剂量为最低浓度，逐代增加毒素浓度至致死剂量浓度
植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从 强到弱: 营养生长中心 > 形成层 > 薄壁细胞 > 厚壁细胞(木质化细胞) > 特 化细胞(筛管、导管细胞)； 根据细胞所处的组织不同从强到弱为： 顶端分生组织 > 居间分生组织 > 侧生分 生组织 > 薄壁组织(基本组织) > 厚角组 织 > 输导组织 > 厚壁组织。