原代神经元培养培训课件
大鼠皮层神经元细胞原代培养 ppt课件
Hale Waihona Puke ppt课件11实验步骤
5 剪碎：
将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用 手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗 三次，转移至离心管中离心1000 rpm 5min 。
6 消化：
加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化 20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。
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实验步骤
布局
器械
PBS 剪碎组织块
取脑，分离皮层神经 元
剥离血管及筋膜
PBS
冰盒
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酒精
PBS
断头
清洗血液
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实验步骤
3 断头取脑： 超净台内，断头取脑，置于盛有PBS的培养皿
内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于无 菌的生理盐水冰浴上。
4 剥离软脑膜： 剥离大脑皮层至预冷的PBS中，用两把无齿弯
培养基
材料
包被
剥膜
消化
低温操作
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影响因素
材料选择
胎鼠就要胎鼠，新 生鼠就要新生鼠， 不能混淆
★易于操作 ★有一些受体，在 培养的工作中失去 功能，会不能再生
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影响因素
培养基选择
不建议血清培养
1 血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，影响神经元产量； 2 抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验； 3血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，
皮层神经元细胞原代培养
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☞ 主要内容 :
1
2
3
4
实验原理
神经元原代培养
神经元原代培养Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】神经元原代培养一、准备1. 试剂1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。
选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。
对照瓶内插入1～2支温度计(保证测试温度的准确性)。
将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。
灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20～-70℃保存。
2）D-Hank’s液(g/L)：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O:0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红： 0.02，超纯水溶解，调节PH至7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。
3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤，200μl或400μl/tube分装, -20度储存。
母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma，P2636，100mg）。
配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。
用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。
4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50μl/tube，-20℃保存。
使用时需将终浓度调整为25μM（购自Sigma，G8415，100g，分子量：147.13）。
配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g，即0.01mol=10mmol，溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。
例：500ml的Neurobasal Medium中加入Glutamate母液（50mM）250μl，此时终浓度约为25μM。
5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone，SH30042.01，100ml）。
6）阿糖胞苷（AraC）母液： 10mM，(阿糖胞苷，1：1000稀释用)（购自Sigma，C1768，100mg，分子量：243.22）；配制方法：100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。
神经元原代培养_
神经元原代培养_
神经元原代培养
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。
孕雌鼠麻醉然后解剖，胎儿收集到HBSS-1中然后快速断头。
剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集入HBSS-2 液中机械磨碎。
皮质碎片移到有0.025%胰酶的H BSS-2液中37°C消化15分钟。
胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/ mL庆大霉素）。
以1×105cell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°C，5%CO2湿温培养箱里进行培养。
每3天用吸管换液，一次换0.5mL。
体外培养8天细胞就能用于实验。
选用17-18天的胎鼠能够提高神经元培养的效率，因为与乳鼠相比胚胎组织的细胞连接还很少。
因此，用乳鼠会使神经元的分离更加困难，会造成细胞连接不可逆的损伤，细胞之间的共同的轴突和树突更容易发生损伤。
另外，用出生后1天内的大鼠皮质培养容易有胶质细胞污染，而用胎鼠则可以避免这种情况。
如果用的是乳鼠，一般是在培养36个小时后加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞生长。
另外，如果把分化的影响看成是考虑的重要因素，可以用培养4天的、8天的、18天的细胞。
其中一个例子可以是观察毒性物质对小孩和成年的不同效应。
神经元原代培养 丁香园
（丁香园protocol 2008）一、常规的试剂配制：1、培养基：选用高糖型DMEM/F12 (1:1)培养基干粉（含15 mmol Hepes），每升培养液中加入碳酸氢钠1.8 g，调节pH值7.0，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，加入谷氨酰胺、无菌的青霉素和链霉素液，使其终浓度分别为0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分装后置于4℃保存，临用前加入2%的B27。
神经细胞代谢旺盛，选用高糖型培养基；谷胱甘肽可保持培养基还原状态，营养成分稳定；B27是公认的刺激神经元生长的营养因子，不过价格挺贵；PH值很关键，Hepes是优秀的缓冲系统，pH值调好后能保持很长时间；2、多聚赖氨酸溶液的配制：称取1.5 mg L-多聚赖氨酸溶于100 ml PBS，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于4 ℃保存，可长期使用；3、磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：称取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4•12H2O 和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O，调节pH值为7.2，补dd H2O至1000 ml并分装，高压灭菌（121～126 ℃），4 ℃备用；4、D-Hanks液的配制：称取KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4•12H2O 0.08 g，溶于dd H2O中，调节PH值为7.2，定容至1000 ml，高压蒸汽灭菌（121～126 ℃），4℃备用；5、0.25%胰蛋白酶的配制：称取0.25 g胰蛋白酶粉末，少许D-Hanks溶液调成糊状，用D-Hanks定容至100 ml，混匀，冰箱内放置过夜，滤纸过滤后，0.22 m微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃保存。
二、试验操作过程：1、包被：培养前晚上将培养瓶（板）用多聚赖氨酸包被10 min，吸除，无菌操作台上15min 自然晾干，置于培养箱中备用；2、取脑：选取新生24 h的SD大鼠数只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks液洗数次；（预先准备至少4把眼科剪刀，分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作）3、分离：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，仔细剔除微血管，用充分剪碎组织；4、消化：加入同体积0.125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37 ℃培养箱内消化20 min 左右，期间轻摇数次；过滤：加入数滴胎牛血清终止消化，用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液；5、接种：以1100 rpm离心5 min，倾去上清，用DMEM/F12培养液重悬细胞，轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为1 00000个/ml，加入终浓度为10%胎牛血清后接种于培养瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养；12小时内禁止晃动6、换液：接种后24 h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液，第48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，随后每3 d半量换液。
神经细胞培养讲义课件
合成培养基（ＭＥＭ ＤＭＥＭ ＨＡＭ`S F12 ＲＰＭＩ（１６４０） １９９ Ｌ－１５ ）等
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常用的平衡盐溶液（g/L）
R in g e r
PBS
(1 9 8 5 )
E a rg le (1 9 4 8 )
H anks (1 9 4 9
D u lb e c c o (1 9 5 4 )
b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类 为35~37℃；鸟类为38.5℃
b 气相及PH 值 ：O2及 CO2的值： CO2=5%；PH=7.2~7.4
c 渗透压：260~320m
mol/L
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3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生 长于无污染及无毒的环境！！
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三、培养操作过程
• 新生1～3d SD大鼠，麻醉后75%酒精浸泡消毒，断头后移入超净
工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于D-Hanks液中，仔细剥 除脑膜和血管，小心剥离脑组织（海马），放入10ml小瓶中
•剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37℃培养箱，定期振摇促消化。消 化约20min，
Байду номын сангаас
•用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目 不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、 洗细胞两次，每次10min，
2 细胞系培养
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一 神经元的原代培养(Primary culture)
一、组织来源：
1） 种属： 大鼠 小鼠 家鸡 瓜蟾 海兔 蜗牛 水蛭 等
2）年龄：一般为胚胎或新生动物组织
神经胶质细胞：生后早期
原代神经细胞培养
原代神经细胞培养新生鼠神经元细胞的培养准备工作：1、解剖器械一套（实验室有专门用于细胞间取材用的成套器械），需提前一天灭菌，过夜烤干。
2、试剂、溶液：Neuralbasal培养基（2mM glutamine）；D-PBS缓冲液；0.25%trypsin/0.02%EDTA消化液；0.05%poly-lysin。
3、包被玻片：干烤灭菌12 x 12mm2玻片，12孔板。
包被过程：0.05%poly-lysin滴于置培养板中的盖玻片上（注意勿溢出玻片），37℃放置12hr后纯水洗3遍，晾干。
4、操作中所用枪头均用剪刀剪去枪头尖，然后在酒精灯上迅速过一下抛光。
取材：1、从-200C取出三个冰袋，预冷若干皿D-PBS，一大皿用于冷却剥出的脑子，另外的35mm的皿用于冷却分离出的脑组织，如：海马，皮层，下丘脑等，分离几个部位就预冷几小皿D-PBS，小皿盖子上做好标记，第三个冰袋上放一皿盖，上面放灭过菌的滤纸，用于剥离脑子的操作。
2、取1-3天鼠，75％酒精浸泡片刻后，用大剪子断头处死。
3、弯头眼科剪剪开颅骨，取出完整脑至盛有预冷D-PBS的培养皿中，在体式镜下分离相应部位的组织,分别放在相应的皿中。
4、将组织块用弯头眼科剪剪碎，每小块约2mm3左右，用枪移入5mlEP中，稍为沉淀1分钟，吸弃上清，加入0.25%trypsin/0.02%EDTA，37℃消化10-15分钟左右，期间每3分钟颠倒几下。
注：每四个海马用胰酶1ml，每个皮层用胰酶2ml。
5、消化完毕，每毫升胰酶加入100ul血清以终止胰酶，颠倒混匀；1000rpm，4分钟，离心沉淀。
6、吸弃上清，注意不要将组织吸出。
7、加入37℃预热的1-2ml DMEM／10%FBS，用枪头吹打20下左右，此时液体浑浊，组织块明显变小。
8、放置沉淀3分钟左右，可见组织块沉底，吸取上清，其中包含所要的细胞。
9、计数，将细胞密度调整至2－4 x 10 5 /ml后接种于预先用poly-lysine包被过的盖玻片或皿上，100ul每玻片（12 x 12mm玻片）。
神经元和突触培训课件
躯体神经：体表、骨骼肌
突起
神经元和突触
内脏神经：内脏，心血管，腺体
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－. 神经元 neuron
神经元是神经系统的 基本结构和功能单位
形态多样，均有胞体和 突起构成。胞体大小不 等，约5～100m。突起 的形态、数量、长短不 同，分为轴突和树突。
1/29/2021
神经元和突触
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1、基本结构
• 胞体：分布于大、小脑皮质，脑 干，脊髓灰质，神经节
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神经元和突触
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• 星形胶质细胞 astrocyte a.纤维性星形胶质细胞 fibrous astrocyte
分布: CNS白质 形态：星形，突起细长，多支少。胞质中含大量胶质
丝（由胶原纤维质＋酸性pr构成，GFAP） b.原浆性星形胶质细胞 protoplasmic astrocyte
受体 与递质结合，引起化学门控通道开放
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神经元和突触
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1.2 胞体
神经元的营养中心
1.2.1 细胞核：
大而圆，异染色质少，浅染，核仁明显。
1.2.2 核周质：
嗜染质（Nissl bodies） LM：嗜碱性的块状、颗粒状 EM：RER，游离核糖体 功能：合成蛋白质
1/29/2021
分布：CNS灰质 形态：突起粗短，分支多，绒球状，胶质丝较少
功能：1. 维持神经元活动的内环境；
2. 摄取神经递质，调节神经元活动；
3. N.S发育阶段，诱导神经元迁徙到特定区域；
4. N.S损伤时，增生形成胶质斑痕，充填缺损；
5.合成分泌NTFs(如NGF,CNTF,GDNF)等，以维
持神经存活和促进神经突起生长。
神经元原代培养
神经元原代培养一、准备1. 试剂1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。
选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。
对照瓶内插入1～2支温度计(保证测试温度的准确性)。
将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。
灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20～-70℃保存。
2）D-Hank’s液(g/L)：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O: 0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红：0.02，超纯水溶解，调节PH至7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。
3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤，200µl或400µl/tube分装, -20度储存。
母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma，P2636，100mg）。
配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。
用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。
4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50µl/tube，-20℃保存。
使用时需将终浓度调整为25µM（购自Sigma，G8415，100g，分子量：147.13）。
配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g，即0.01mol=10mmol，溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。
例：500ml的Neurobasal Medium中加入Glutamate母液（50mM）250μl，此时终浓度约为25μM。
5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone，SH30042.01，100ml）。
6）阿糖胞苷（AraC）母液：10mM，(阿糖胞苷，1：1000稀释用)（购自Sigma，C1768，100mg，分子量：243.22）；配制方法：100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。
原代DRG神经元培养
原代DRG神经元培养主要试剂和溶液的配置Dulbecco缓冲液(1L): 0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8.0 g NaCl，Na2HPO4•12H2O 2.89g溶于900 ml ddH2O中，溶解完全后调pH值至7.2-7.4，定容至1 L。
0.3%胰酶(250 ml)（神经元用）:称取0.75 g胰酶(Sigma)溶于200 ml Dulbecco缓冲液中，定容至250 ml，0.22 μm微孔小滤器过滤除菌。
0.5%胶原酶IA (250 ml):称取1. 25 g 胶原酶(Sigma)溶于200 ml Dulbeaco缓冲液中，定容至250 ml，0.22 μm微孔小滤器过滤除菌。
DMEM培养液:称取DMEM固体培养基(Gibco-BRL, USA) 13.48 g溶于800 ml ddH2O中，用3.7 g NaHCO3调pH值至7.2-7.4，定容至1 L。
0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。
临用前配制成含10% FBS (Hyclone, USA)的完全培养基。
Neurobasal (Gibco): 4℃保存，临用前按50:1的比例加入B27无血清培养液添加剂(Gibco)。
Poly-D-lysine (Sigma): 1 mg/ml，可回收利用。
0.25%胰酶(250 ml)（细胞系用）：NaCl 2 g，KCl 0.05 g，KH2PO40.05 g，Na2HPO4·12H2O 0.721 g，胰酶(Sigma) 0.3125 g，EDTA 0.05 g，苯酚红0.001 g，碳酸氢钠0.145 g。
先将胰酶和EDTA 入瓶内溶1-2 h（4 o C），然后加入KH2PO4，Na2HPO4·12H2O及苯酚红的混合液混匀，溶解2 h （4 o C），在混合后的最后10 min加入0.145 g碳酸氢钠，调pH值至7.0~7.5，立即过滤以防碳酸挥发。
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版讲解
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。
9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。
（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。
皮层神经元的原代培养
皮层神经元的原代培养
一、背景
大脑皮层是调节躯体运动的高级中枢。
它由初级感觉区、初级运动区和联合区三部分构成。
人类大脑皮层的神经细胞约有140亿个，面积约2200平方厘米，主要含有锥体形细胞、梭形细胞和星形细胞（颗粒细胞）及神经纤维。
体外原代培养神经元作为神经科学研究的有力手段，越来越受到广大科研工作者的重视。
由于神经元是一种高度分化的细胞，动物出生后很少分裂，相对于其它细胞而言，神经元在体外更难以存活和生长。
因此，体外培养神经元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。
二、实验步骤
1. 无菌条件下，从怀孕18天的SD 大鼠腹中取出胚胎放入预冷的无钙、镁平衡盐溶液中；
2.在解剖显微镜下，分离取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织（1mm3），加入0.125%胰酶-EDTA 消化液后放入 37℃孵箱内消化10 分钟，期间摇晃一次；
3.去掉上清，加入终止液终止消化，吹打10-15次，不能有气泡，收集上清；剩余沉淀加入终止液继续吹打5-10次;
4.所收集的上清过滤后，将细胞悬液于4℃1000rpm离心10min ，弃上清，管内加入新鲜培养液重悬；
5.台盼蓝染色计数，以 3 x 104cells/孔种入包被的24孔板，37℃，5%CO2，95%饱和湿度的培养箱中培养；
6.每周换液两次，每次半量换液。
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精品文档神经细胞原代培养的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在从动物（大鼠或小鼠等）培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等℃烘干，各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，60用酒精棉球擦拭后晾干，或经以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－小时以上消毒。
80％酒精浸泡1 器皿：1) 2) 3)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
5)培养瓶、盖玻片次，盐酸浸泡可用0.2N10分钟，用蒸馏水洗2培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，分钟，10分钟，再用双蒸水洗2次，每次1010每次分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
6)7)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
8)。
孔）、、、塑料培养板（35mm9)塑料培养皿（）62496精品文档．精品文档辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制多7-1400001) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为0.1mg/ml，浓度为。
聚赖氨酸（Poly-L-lysineNaCl主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于2) 平衡盐溶液：的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培3)无血清培养液。
养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27℃564) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需。
灭活30分钟）胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补5) 冻℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml水至2.5%浓度，振荡摇匀，4。
实际或0.125%存。
用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25% 20-30分钟。
使用温度一般为37℃缓冲液和蔗糖－葡萄糖HEPESPuck6) 解剖溶液：由平衡盐水（D1-无钙镁离子的氏液）、D1-SGH。
溶液组成称为、酚红KH2PO4 0.03g、NaCl 8.0g、KCl 0.4gNa2HPO4.7H2O 0.045g、平衡盐水：D1 。
50ml0.0012g、三蒸水。
3g、三蒸水50ml7.5g蔗糖－葡萄糖（SG）：蔗糖、葡萄糖HEPES（H，0.352mM）：用25ml左右的三蒸水溶解2.35g的HEPES后，用NaOH 或精品文档．精品文档HCl调28ml，加三蒸水至。
pH至7.3-7.4备后置4℃即为解剖液，和将D1、SGH 三者合在一起并稀释到1000ml小瓶分装成5ml 用。
二、培养细胞操作涂培养基1.孔培养板或消毒的孔、96、1-2一般在细胞培养前天，将使用的塑料培养皿（35mm）24 Poly-L-Llisine，置于超净台中备用。
盖玻片涂上一层2. 实验动物准备如大鼠海马细动物的年龄和取材部位对培养细胞的成活率关系密切，需根据具体实验而定。
小时内的大鼠为宜，而培养背根神经节与脊髓神经元以4818胞培养，以天胚胎或新生天、小脑细胞取自临产或新生动物。
11-13天胚胎小鼠、大脑皮层以小鼠16-21 进入培养室操作3.穿上消毒衣，戴上口罩和帽子。
1)安放消毒的实验用具，如培养皿、解剖器械、玻璃吸管、培养板等于桌面适当的位置。
2)将平衡盐水、解剖溶液、血清、胰蛋白酶等溶液放置于桌面上，同时准备一个冰袋和污3)物盘。
分钟。
804) 解剖动物以新生大鼠取海马组织为例：将新生大鼠投入％的酒精中，消毒5-10，然后用解剖剪断头，并移入玻璃器皿中，沿中间骨缝将头骨剪开（头骨外侧下沿也剪开）暴露内侧面半月状的海马组剥开头骨暴露大脑半球，去脑膜，沿中线将大脑半球往外翻开，。
待数个动物均解剖后，织。
用弯头镊子轻轻夹起，放入解剖液内（培养皿可置于冰袋上）（取材干净非常重要）将培养皿内的海马组织移至解剖镜下，仔细去除血管、膜及非海马结构液，并用虹膜剪剪碎或用虹膜刀切成小粒。
后，再移至小培养皿中，加数滴D1-SGH精品文档．精品文档℃培养箱内消37胰蛋白酶各5) 在上述海马组织加入解剖溶液和0.25%1ml，摇匀后置于分钟。
化25-30加入含血清的全吸去剩余的胰蛋白酶溶液，将消化好的细胞碎片移入6) 2ml的离心管中，（全培养液成终止胰酶作用，约培养液2ml10分钟后，再更换一次全培养液以洗净胰酶。
、10％胎牛血清、％马血清或小牛血清，胎牛血清有助于细胞贴壁）。
10DMEM 份为80％培用口径较小的、在火焰上光滑过的玻璃吸管吸取细胞团，移入另一离心管，加入2ml7)。
分钟后，5-10吸取上层细胞溶液约1ml次。
养液并吹打20将离心管斜放，让细胞碎片下沉1次吸取的细胞混合一起后计数。
同上吹打并吸取细胞，离心管中再加入培养液1ml，与第按所需的细胞浓度接种在事先准备的塑料培养皿、细胞培养板中，用盖玻片则需滴满。
8)15接种后移入37℃的％CO2培养箱，培养天后可用无血清培养液，1星期换液2次。
三、细胞识别培养中的贴壁的神经根据细胞外形及内部结构进行细胞的识别。
神经细胞具有显著的特征，正在不断元突起很明显，特别是树突由粗而细，有分支，突起的末端有膨大的生长锥结构，变化；细胞体呈圆形、梭形、三角形或多角形不等，胞体较厚，具有空泡状核，有明显的核仁；立体感强，常见“晕”。
，即成纤维细胞、室管膜细培养细胞中可包括几种神经元的类型和非神经元的“背景细胞”胞和几种胶质细胞。
从胞体两端发出细长成纤维细胞贴壁最快，呈扁平状，胞核卵园形，有并列的两粒小核仁，“地“地毯”胶质细胞贴附在胶原上和成纤维细胞形成一层。
神经细胞贴壁较慢，落在突起。
毯”上生长迁移和分化。
法染色或免疫细胞化学特异性染色加以鉴别。
Nissl培养的神经细胞可按一般精品文档．精品文档无菌操作注意事项即便使用所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。
体外培养细胞缺乏抗感染能力，也会导致污染。
因而．为在一切?设备完善的实验室。
若实验者粗心大意，技术操作不规范操作中为最大可能的保证无菌．每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。
【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。
有关数据的计算要事先做好。
)培养室、超净台根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所( 内，然后开始消毒。
这可以避免开始实验后．囚物品不全往返拿取而增加污染机会。
．紫外拖布要专用【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次()％酒精擦洗。
然后紫外线淌毒线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75消毒时工作台面上30min。
在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，用品不要过多或重叠放置．否则会遮挡射线降低消毒效果。
—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。
可穿装细胞培养室【洗手和着装】原则上和外科手术相同。
平时仅做观察不做培养操作时，的清洁工作服。
在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着内紫外线照射30min％酒精消毒手。
如果实验过程中手触及可能污长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75着染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。
进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、消毒衣帽。
在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。
以【火焰消毒】都需在火焰近处并经过烧灼进行。
但要注后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组意：金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，因残留在吸管头中营养以免造成组织损伤。
吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，织，关闭长有细胞的培养瓶时，火再用时会把有害物带入营养液中。
开启、液能烧焦形成炭膜，精品文档．精品文档以免烧焦产焰灭菌时间要短。
防止因温度过高烧死细胞。
另外胶塞过火焰时也不能时间长，生有毒气体，危害培养细胞。
进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。
【操作】工作不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。
为拿取方便，台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，勿过早暴组织或细胞在未做处理之前，酒精灯置于中央。
工作由始至终要保持一定顺序性，露在空气中。
同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使闭瓶口直立可增加落菌机会。
吸取营养液、PBS工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。
用吸管，手或以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。
操作前用酒精擦拭超净台面及双手。
则应加液时如吸管尖碰到瓶口，瓶口最易污染，相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，将吸管丢掉。
细胞计数血测定培养基、细胞计数法是细胞学实验的一项基本技术。
它是了解培养细胞的生长状态．清、药物等物质生物学作用的重要手段。
下面介绍常用的血球计数板计数法。
一、用品(1) 血球计数板，巴氏吸管(2) 0.25％胰蛋白酶溶液，无血清培养液(3) 显微镜二、步骤(1) 准备计数板：用酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干。
制成单个细胞悬用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，(2) 制备细胞悬液；精品文档．精品文档，(1000rpm应将悬液离心个细胞／液。
本法要求细胞密度不低于10000m1，若细胞数很少，，重悬浮于少量培养液中。
2min)加样：用吸管轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞(3)悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。
物镜观察计数板四角大方格中的细胞数．细胞压中线时，10X计数：在显微镜下，用(4)只计左测和上方者，不计右侧和下方者。
(5) 计算：将计算结果代入下式，得出计数结果：4)X104 大格细胞数之和／(4细胞数／毫升原液＝细胞计数结果乘以稀释倍数即为细胞密度。
三、注意事项(1) 消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单细胞悬液。
否则会影响细胞计数结果。
取样计数前．应充分混匀细胞悬液。
在连续取样计数时，尤应注意这一点。
否则。
前后(2)计数结果会有很大误差。
％以个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞算。
如细胞团占10(3) 镜下计数时，遇见2说明稀时，l0mm250010mm2200说明消化不充分；上，或细胞数少于个／或多于个／释不当，需重新制备细胞悬液计数。
精品文档．。