基因工程总结

简述Southern blot,northern blot,western blot的原理，比较它们的不同.

答：Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。DNA => 琼脂糖电泳=> 印迹转移=> 预杂交=> 杂交（变性探针）=> 洗膜=> 放射自显影或显色Northern Blot

原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

mRNA提取=> 甲醛变性电泳=> 印迹转移=> 预杂交=> 杂交（变性探针）=> 洗膜=> 放射自显影或化学发光

Western Blot

与 Southern Blot或 Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

不同：所用于分析的对象不同。

Northern杂交用于分析RNA；

Southern杂交用于分析DNA；

Western杂交用于分析蛋白质。

转基因动物与转基因植物的产生有什么不同？

答：技术原理相同，用转基因技术将具体特殊经济价格的外源基因导入动植物体内，不但表达出人类所需要的优良性状（如抗虫，抗病，抗除草剂，抗倒伏，产肉，产蛋量高）,还可以通过蛋白质重新组合得到新的品种。但是，对动物和植物进行目的基因导入的方法不同。动物一般采用显微注射法将带有目的基因的病毒注入细胞；而植物一般采用农杆菌转化法或基因枪法将目的基因导入受体细胞。

限制性内切酶的种类？

答：限制性内切酶是一类能识别双链DNA特定序列，并使磷酸二酯键断开的内切脱氧核糖核酸酶，限制性内切酶根据酶的组成，裂解方式和所需因子的不同分为三种类型，分别是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。

Ⅰ型酶主要指的是：一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割DNA 链。能识别特异性的DNA 序列, 但没有固定的切割位点Ⅱ型酶主要指的是：能在其识别序列内部或附近特异地切开DNA 链。它们产生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用于DNA分析和克隆的限制性内切酶，分子量较小。

Ⅲ型酶主要指癿是：一类较大癿兼有限制-修饰两种功能癿酶。它在识别位点之外切开DNA 链，并且要求同一DNA分子中存在两个反向癿识别序列以完成切割。

酶切反应条件：

答：1．缓冲液

常规缓冲液一般包括提供稳定pH值的缓冲剂、Mg++ 、DTT（二硫苏糖醇）以及BSA （小牛血请白蛋白）。

pH经常为7.0-7.9（在25℃时），用Tris-HCl 或乙酸调节；Mg++作为酶的活性中心，由MgCl2 和MgAc 提供；浓度常为10mM；DTT 浓度常为1mM 。有时缓冲液中还要加入100g/ml BSA，但只是少数反应需要。不同的酶对离子强度的要求差异很大，并依次将限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低三种类型，离子强度以NaCl来满足，浓度分别为100mM 、50mM 和0mM 。

要对DNA 进行双酶切时，如何选择缓冲液是相当重要的。一方面可选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；若找不到共用的缓冲液则先用低浓度的，再加适量NaCl 和第二种酶；或先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液（DNA 可纯化或不纯化）。

2．反应温度

反应温度大多数为37℃，一部分为50-65℃，少数25-30℃。高温作用酶在37℃下的活性会下降，多数仅为最适条件下的10-50% 。如Taq 限制酶（正常反应温度为65℃），在37℃只有在65℃活性的10%；ApoⅠ（正常反应温度为50℃），37℃只有在50℃时活性的50% 。销售商在产品说明中都会标明最佳反应温度。

3．反应时间

反应时间通常为1小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。EcoRⅠ若反应16小时，所需酶量为正常酶切时间的1/8，即若反应时间为16小时，则所用酶量为只切1小时的1/8 。其它一些酶也有类似情况，如HindⅢ为1/8；KpnⅠ为1/4；BamHⅠ为1/2。4．终止酶切的方法

EDTA 可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为10mM ；加热是常用的方法，对于最佳反应温度为37℃的酶，在65℃或80℃处理20 分钟可使酶活性大部分丧失。但是对于在80℃作用20分钟也有不失活的酶，如最佳反应温度为37℃的酶Bg1Ⅱ、HpaⅠ和PvuⅡ，65℃酶Tth111Ⅰ和TspRⅠ，以及50℃酶Bc1Ⅰ，可用苯酚抽提去除蛋白，或用试剂盒纯化DNA 。

柯斯质粒载体的特点：

答：第一、具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒载体克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。但该载体不包含λ噬菌体的全部必要基因，因此不能够通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒二、具有质粒载体的特性柯斯质粒载体具有质粒复制子，能够在寄主细胞中象质粒DNA 一样进行复制，通常具有抗菌素抗性基因，可作为重组体分子表型选择标记，其中一些还带有基因插入失活的克隆位点。

第三、具有高容量的克隆能力柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和cos位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有5～7kb左右，及柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。

第四、具有与同源序列的质粒进行重组的能力一旦柯斯质粒与一种带有同源序列的质粒共存在同一个寄主细胞当中时，它们之间便会形成共合体。

转基因动物的主要目的：

一名词解释

转基因动物：是指以人工方法导入外源基因，在染色体内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。

转基因生物：在生物基因组中带有用转基因技术插入的外源基因，生物个体能将它遗传给后代并表达出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状。

核酶：是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特异的mRNA序列。核酶又称核酸类酶、酶RNA、核酶类酶RNA。

插入失活：当外源DNA插入到载体的某一基因中间时，该基因就不能表达，这种现象称为插入失活。

结构基因：包括以5端mRNA转录位点开始到3端mRNA终止信号结束的全部功能单位。

目的基因：决定生物的优良性状，具有应用价值的应用前景，并被用于构建物种新特性的基因。

操纵子：功能密切相关的基因聚集在一起，处于同一转录启动的调控之下，并且有相同的转录终止区。

启动区：RNA聚合酶识别，结合和开始转录的一段DNA序列。

终止子：原核生物基因在转录终止前的一段提供转录终止信号的DNA序列。

终止因子：帮助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子。

双元载体：即能在宿主自我复制，又能转化感染其它宿主的载体。

温和噬菌体：λDNA可以整合到宿主细胞染色体，以溶源状态存在并随染色体的复制而复制。

插入型载体：当外源DNA片段插入后使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶菌周期。

表达序列标签：EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA 部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20 到