进食状态对糖尿病大鼠血糖及肝糖原的影响

进食状态对糖尿病大鼠血糖及肝糖原的影响

实验目的：

1.熟悉常用的糖尿病大鼠造模方法

2.掌握血糖仪的使用方法

3.掌握组织样品的制备方法

4.了解血清胰岛素水平检测方法

5.熟悉肝糖原提取、鉴定的方法与原理

6.通过本实验探讨临床糖尿病患者不同进食状态对血糖的影响

实验用品：

一、器材：

普通离心机，酶标仪，恒温水浴箱，分光光度计，0.01g电子天平、0.1g电子天平，血糖仪，棉签，干棉球，剪刀2把，镊子2把，研钵2个，白磁盘，试管架，拆条酶标板，吸水纸，5ml离心管，试管，烧杯，漏斗，玻璃棒，刻度吸量管，EP管，滤纸，1000μl微量可调取液器，50ml容量瓶3个，注射器，白瓷反应板，塑料手套，布手套，抹布，记号笔

二、试剂：

5%三氯乙酸溶液，蒸馏水，生理盐水，碘试剂，95％乙醇，标准葡萄糖溶液（50mg/L），98%浓硫酸，30%KOH溶液，0.2%蒽酮显色剂，柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液（PH4.4），1%链脲佐菌素（STZ）溶液，10%水合氯醛溶液，大鼠胰岛素（INF）ELISA检测试剂盒

实验步骤：

一、标记：

二、造模：

A、抓取大鼠并称重。（结果见表一）

B、大鼠先禁食12小时后（此部分为老师帮忙完成），进行血糖检测。然后抓取大鼠单次腹腔注射按1%STZ溶液（65mg/Kg），注射后一小时，给予自由饮食、饮水。

具体抓取大鼠方法：用右手将鼠尾抓住提起，放在较粗糙的台面或鼠笼上，抓住鼠尾向后轻拉，左手紧抓两耳和头颈部皮肤，余下三指紧捏鼠背部皮肤，如果大鼠后肢挣扎厉害，可将鼠尾放在小指和无名指之间夹住。

C、以后每天安排人员进去喂养动物，记录饮食量和更换垫料。

D、待72小时后大鼠尾静脉采血再次检测血糖，以餐后血糖≥16.7mmol/L为大鼠糖尿病模型造模成功的判定标准。

血糖检测具体步骤：将血糖检测专用试纸插入血糖分析仪中，待血糖仪显示屏上显示滴血标记时，方可使用。用剪刀剪断大鼠尾尖约＜0.5cm，挤出的第一滴血用棉球擦掉不要，第二滴血滴在试纸上。待血糖仪显示屏上显示稳定的数值后记录。（血糖检测结果见表二）

三、麻醉：

大鼠称量后，通过计算每只大鼠所需麻醉量（0.3ml/100g），抓取大鼠，腹腔注射。

四、血清胰岛素水平检测：

麻醉后摘除大鼠眼球，取血约1ml于EP管中，静置一小时以上，由于实验顺序要求先进行接下来的肝糖原检测并鉴定实验，所以静置后将EP管放入冰箱内冷藏一天，第二天进行实验时，将EP管对称放入离心机中，进行2000r/min离心15分钟，分离血清100μl。采用大鼠胰岛素ELISA检测试剂盒，严格按照试剂盒步骤进行血清胰岛素水平检测。

板37°C温育30分钟。

3．洗涤5次，每孔加入酶标试剂50μl，37°C温育30分钟。

4．洗涤5次，每孔加入显色液A,B各50μl，37°C避光显色10分钟。

5．加入终止液，15分钟内测量各孔OD值并做回归方程计算（具体见下表）五、肝组织制备和肝糖原检测：

各组大鼠用断颈法迅速处死，剖腹取出肝脏后浸泡在生理盐水中清洗。捞出后的肝组织用滤纸吸去表面的液体，用电子天平分别称取重量为0.5g和0.06~0.08的肝组织备用。

A.肝糖原定性检测：

B.肝糖原定量检测：

取干净试管多支，按表操作

结果分析

体重及血糖浓度

体重：

四只大鼠的体重总体而言均有不同程度的下降，在二十六号-二十七号之间下降明显，主要是期间破坏的胰岛，使得四只造模大鼠均体重下降。在十二月一号实验前12小时饥饿组即1号和3号经过禁食处理，体重也有下降。

肝糖原定性检测

上图为我们肝糖原匀浆取出糖蛋白后得到的滤液，由于实验过程中对3号管的

过滤过程中打洒了一部分，所以显得3号管里的滤液比较少。1号2号管浑浊程度较低，怀疑是操作失误，（加入了大于4毫升的三氯乙酸）导致溶液稀释过度。

3号管比4号管浑浊，由于3号大鼠为造模饥饿组，4号为造模饱食组，理论上4号的肝糖原应该比3号的多，所以4号管比3号管浑浊。

5号管与6号管浑浊程度对比，6号正常饱食组比5号正常饥饿组浑浊，也属正

7 空白—

1.沉淀量：6号（正常饱食组）＞5号（正常饥饿组）。正常。

2.沉淀量：2号，4号（造模饱食组）＞1号，3号。（造模饥饿组）。正常。不同造模饱食组、造模饥饿组的沉淀量有细微不同可能是因为个体差异原因，但是基本上总体情况符合理论要求。

肝糖原定量检测

根据我们小组的讨论分析，总结得出的结论为：造模饱食组尽管在实验前有充足的饮食，但由于糖尿病胰岛素的缺失，导致血糖转化为肝糖原的过程受到抑制，而胰高血糖素所催化的肝糖原转化为血糖的过程不受影响，所以造模饱食组的肝糖原含量会低于正常饱食组大鼠的含量。

2.造模饥饿组肝糖原比正常饥饿组肝糖原含量多的原因：

按照上面的分析，理论上应该是造模饥饿组的肝糖原会比正常饥饿组的肝糖原含量多，但是我们组的实验却出现了造模饥饿组少于正常饥饿组的现象。所以分析讨论之后，得出以下猜想：尽管造模饥饿组的肝糖原合成途径由于胰岛素缺少受到抑制，但由于本身糖尿病的原因，本身含有的血糖就高于正常组饥饿时含有血糖，使得肝糖原转化为血糖的途径也受到抑制，所以造模饥饿组肝糖原的含量比正常饥饿组肝糖原的含量偏高一点点。

胰岛素检测

上图为大鼠眼球取血后置于EP管离心的血清血浆分离结果。下图为分离出的血清。

由于只取一组造模组做实验，我们组取的是2号造模饥饿组以及3号造模饱食

大鼠分组吸光度A（对应胰岛素）胰岛素水平（mu/L）

分析，吸光度出现负数原因

1.空白孔溶液浓度配置出现问题。

2.设备原因。

3.使用分光光度计时操作不当。

4.比色皿受到其他溶液的污染。

结论

进食状态下，糖尿病大鼠的血糖会高于正常大鼠，肝糖原反而会低于正常大鼠。

饥饿状态下，糖尿病大鼠的血糖会高于正常大鼠，肝糖原会高于正常大鼠。

讨论与思考

1.空腹血糖和餐后血糖的意义？

糖尿病诊断时必须查空腹血糖。空腹血糖能反映自身胰岛素分泌能力，1型糖尿病病人空腹血糖往往很高。另外许多其他检查，如肝肾功能、血脂、血胰岛素等也需要空腹进行，而这些值对将来糖尿病的治疗很有帮助。所以，要诊断糖尿病必须要空腹抽血。空腹血糖是指空腹过夜后早晨的血糖，午饭前及晚饭前血糖仅可称为“餐前血糖”，而不能说是“午饭前空腹血糖”或“晚饭前空腹血糖”。

餐后两小时血糖测定也十分重要，因为此时血糖往往较高，容易发现问题，对于某些2型糖尿病病人来说，空腹血糖可能不高，甚至完全正常，餐后两小时血糖却很高。所以，在诊断2型糖尿病时，餐后两小时血糖有时比空腹血糖更为重要。

2.肝糖原与血糖浓度的相关性？

肝糖原即是血糖的来源通道，又是血糖的去处通道，其作用是平稳和储备葡萄糖。血糖的高低是取决于主要通道的顺畅程度，但由肝糖原和糖异生来实施，