蛋白质的稳定性和稳定化

A
B
C
A.用多功能试剂交联；B.共价或非共价连于载体上 C.包埋到载体的紧密孔中
二、非共价修饰
反相胶束 添加剂

蛋白质间非共价相连，形成的多聚体或者
聚合体的活力和稳定性常比单体高
反胶束是由两性化合物在占优势的有机相中形 成的。它不仅可以保护酶，还能提高酶活力， 改变酶的专一性。
反相胶束示意图
固定化可通过下列效应影响酶的稳定性：
空间障碍：由于空间障碍可以防止蛋白水解
酶的作用，阻挡酶与化学失活剂的接触，同时
阻碍氧向酶的扩散可以保护对氧不稳定的酶
扩散机制: 使酶发生交联或包埋在载体紧
密的孔中可以使酶的构象更加坚牢，从而阻止
酶构象从折叠态向伸展态过渡。
一 酶固定到载体上后可产生空间障碍，结果其他大
质信息进行基因和蛋白质序列的改造， 通过定
点突变使得所表达的蛋白质产生相应的特征改
变。
组合设计（combinational design）
和数据驱动设计（data-driven design）
是另外两种最新的可以提高蛋白质稳定
性的蛋白质工程技术。
组合设计:
是通过一种策略使得在基因水平上产生 差异化，同时，通常需要大量的高通量筛选 来鉴别设计是否获得成功。组合设计方法的 目标在于通过在蛋白质随机位点引入随机突
进化目的的一种技术。
随着突变方法、突变体高通量筛选技术、基因结
构与功能研究的突破，特别是PCR 技术的进一步
成熟，DNA 改组技术(DNA shuffling)更加成熟，
使得DNA 改组成为蛋白质体外分子进化的主流技
术。
DNA 改组技术具有许多重要优点， 例如不需要
事先了解结构信息，也不需要了解蛋白质的功能
分子难于与酶作用，因此，固定到载体上的酶往
往能抵抗蛋白水解酶的降解作用，这也是防止蛋
白水解酶自溶的原因
二 底物、配体和氢离子浓度在载体附近和整体溶液 之间的分布不均一，造成载体周围的局部浓度与 整体浓度不同，也就是酶的微环境发生了变化
三 当酶包埋在多孔颗粒内，底物必须先扩散到颗
粒表面（外部质量传递），然后进入颗粒内部
六、变性剂：
1.脲和盐酸胍:机制尚不明确,可能是消除了维持三级结构的 疏水作用力或直接与蛋白质分子作用.
2.高浓度盐：高浓度盐既有稳定作用也有变性作用，这要
看盐的性质和浓度。
3.螯合：常常不可逆地失活需要金属辅因子的酶，但可稳
定不需要金属辅因子的酶； 4.有机溶剂：改变溶液的介电常数;增加疏水核的溶解度,降 低带电表面的溶解度;夺去酶分子表面的必需水而使酶 失活.
第四章 蛋白质的稳定性和稳定化
第一节: 蛋白质的稳定性 一. 蛋白质稳定性的分子原因

蛋白质的稳定性: 蛋白质抵抗各种 因素的影响,保持其生物活力的能 力。
维持蛋白质结构稳定的主要因素:
1.金属离子、底物、辅因子和其他相对 低分子质量配体的结合作用
金属离子由于结合到多肽链的不稳定 部分（特别是弯曲处），因而可以显著增 加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子 和其他低相对分子质量配体相互作用时， 也会看到蛋白质稳定性的增加。
（内部质量传递），酶才能与其作用，这些扩散
限制可明显使固定化酶“稳定化” 外扩散：底物必须从流动的水溶液传递到固定化
酶颗粒外表面 内扩散:底物进一步传递到固定化酶颗粒内部
四 将酶多点共价连接到载体表面，或用双功能 试剂交联酶，或将酶包埋在载体紧密的孔中， 可以使酶构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折 叠态向伸展态过渡。
原因：
修饰有时会获得不同于天然蛋白质构象的




更稳定的构象； 修饰关键功能基团也会达到稳定化； 由化学修饰引入到蛋白质的新的功能基团 有可能形成附加氢键或盐键； 用非极性试剂修饰可加强蛋白质中疏水相 互作用； 蛋白质表面基团的亲水性； 交联酶晶体
酶的失活和再活化
对于可逆性酶，可以采取相应措施实现其 再活化 例如：用过量的碘离子使脲酶重新天然化， 该酶失活是由于重金属阳离子使巯基中毒 引起，再活化的机理是碘离子与结合的金 属离子形成碘结合物 对于不可逆变性酶，可用下述方法进行再活 化：用变性剂使固定化酶伸展成无规则盘 绕状态
pH的变化可以引起蛋白质的伸展,这个 过程原则上是可逆的,但这些变化常能导致 不可逆的聚合或酶的自溶,引起不可逆失活.
四、氧化作用:
各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基 酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基，从 而使蛋白质变性。分子氧、H2O2和氧自由基 是常见的蛋白质氧化剂。
五、表面活性剂和去污剂
表面活性剂在很低浓度下能使蛋白质发 生强烈的相互作用,导致蛋白质不可逆变性. 其中阴离子去污剂的作用比阳离子和非离子 去污剂强烈.
七、重金属离子和巯基试剂:
与蛋白质的巯基、二硫键以及色氨酸、组 氨酸残基反应。
八、热:
热失活是工业上最经常遇到的酶失活的 原因.热失活分二步过程:伸展---不可逆失活.
九、机械力：
振动、剪切、超声波、压力都可能引起 蛋白质的变性。这种变性理论上是可逆的，但 也可能伴随着其他反应而不可逆地失活.
十、冷冻和脱水：
优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。
优点：提供了有目的改变酶性能的可能性，
不仅改变酶的结构，也可以改变其催化活力及专
一性和稳定性。
改变蛋白质稳定性的蛋白质工程方法
①DNA改组技术 ②定点突变技术
③组合设计
④理性设计
DNA改组技术的定义
DNA 改组( DNA shuffling ), 也称分子育种
关系，其缺点是需要配合快速、可靠的鉴别突变 体的方法。
定点突变技术(Site-directed mutagenesis)是在
已知蛋白质中取代、插入或删除特定的氨基酸
残基，从而改变蛋白质的结构和对应功能，又
被称为理性设计(rational design)。它可以作为
DNA 改组技术的有益补充， 是基于基因和蛋白
最新进展
可将变性的蛋白质分子孤立在反胶束
内，蛋白质在反相胶束内可重新折叠成天
然状态，而且没有与其他变性分子接触和
聚合，此胶束由表面活性剂稳定的水滴构
成，并悬浮于异丁烷中。
第四节 各种酶稳定化方法的比较
比较各种不同的酶稳定化方法是困难的，因 此制定的了一下一般的标准：
①稳定性至少要增加1~3个数量级 ②应对各种酶失活因素(物理，化学及生物学因素) ③稳定化不应减少酶活力或改变酶的专一性 ④稳定化方法适合各类蛋白质 ⑤稳定化方法应在体内，体外都适用 ⑥从经济角度看，方法应具有方法的潜力
蛋白质的聚合作用和沉淀的区别：
1.蛋白质的聚合作用可能是可逆的,并不一 定是不可逆的. 2.沉淀作用意味着蛋白质并未发生显著的 构象变化即从溶液中析出。因此，沉淀很 容易再溶于水溶液中，并恢复其全部天然 特性。
三、极端pH:
极端pH下引起蛋白质变性的重要因素 是：一旦远离了蛋白质的等电点的，那么 蛋白质分子内相同电荷间的静电斥力会导 致蛋白质伸展。从而使埋藏在蛋白质内部 非电离残基发生电离，导致失活。
6.氨基酸残基的坚实装配
溶液中的蛋白质似乎装配紧密，其紧密程 度类似于低相对分子质量化合物的晶体状 态，尽管如此，蛋白质结构中仍有空隙。
空隙中充满水分子，会导致蛋白质不稳定， 因此除去孔隙中的水分子，蛋白质结构变 得更坚实，稳定性也增加。
7.疏水相互作用
疏水性大小与稳定性没有必然的联系 非极性氨基酸在蛋白质球体内的规则的排 列是稳定性的原因之一 增加疏水作用是稳定蛋白质的实用方法:
氢键：是通过氢原子参与成键的特殊形式 的化学键。 当一个电负性较强的原子与氢键合后， 继续与另一个电负性较强的原子键合： 氢键能维持二级结构(如α-螺旋，β-片 层，β-转角等）。但是氢键对蛋白质稳定 性的重要性不应估计过高。
4.二硫键
二硫键：即S－S 键， 是2 个巯基被氧化而形 成的-S-S-形式的硫原子间的共价键。 链内二硫键和链间二硫键：
2蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用
由于蛋白质分子表面上既有疏水簇，也 有极性和带电基团。从热力学上看，疏水 簇与水的接触对蛋白质稳定性是不利的。
所以当蛋白质形成复合物时，脂分子或 蛋白质分子稳定到疏水簇上，因而防止疏 水簇与溶剂的接触，屏蔽了蛋白质表面的 疏水区域。

3.盐桥和氢键
盐桥：当一个氨基酸的氨基和与它空间相 邻的另一个氨基酸的羧基互相靠近时，形 成盐桥。 -COO.......H3N蛋白质中盐桥的数目较少，但对蛋白 质的稳定性作用很显著。
添加剂
专一性底物及配体; 非专一性中性盐和多羟基物质;
与失活剂竞争的物质或除掉破坏化学催化
剂的物质
添加剂不仅可以提高酶的热稳定性，还
可提高酶的抗蛋白水解，抗化学试剂，抗
PH变化，抗变性剂，抗稀释作用 例如：甘油，糖和聚乙二醇是多羟基化合 物，能形成很多氢键，并助于形成“溶剂 层”，增加表面张力和溶液黏度，这类添 加剂通过对蛋白质的有效脱水，降低蛋白 质水解作用而起稳定酶的作用
冷冻和脱水时，溶质被浓缩，引起酶微 环境中pH和离子强度的剧烈改变，减弱疏水 相互作用,并可能引起二硫交换和巯基的氧化。
十一、辐射作用:
辐射可产生自由基(.OH,H2O2,O2-.等)直
接或间接地作用于蛋白质分子.
第三节 蛋白质的稳定化
酶的稳定化方法
固定化 非共价修饰
化学修饰
④蛋白质工程
一 固定化
由于交联即蛋白质中形成二硫键，伸 展蛋白质的熵急剧降低，从而增加蛋白质 的稳定性。
与此类似，用双功能试剂实现分子内交 联，也能使蛋白质构象稳定化。
日常生活中的烫发和发型保持， 主要原理是操 纵毛发角蛋白二硫键的还原和再氧化， 即二硫键的 断开和重新键合。
5.对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低
蛋白质中一些结构比较重要的氨基酸残 基（如活性部位的氨基酸）的氧化作用是 蛋白质失活的重要原因。因此要减少这类 对氧化修饰敏感的氨基酸含量，从而提高 蛋白质的稳定性。
(molecular breeding)或有性PCR( sexual PCR) ,
是以单个基因或多个同源基因(一般为天然存在
的基因家族)为模板, 将其切割成一系列随机大小
的DNA小片段, 然后在体外通过聚合酶链式反应(
polymerasechain reaction, PCR)将这些片段随
机重组成全长基因, 实现同源基因重组, 达到分子
蛋白质非共价相连 蛋白质间相互作用时，由于从蛋白质表面 相互作用区域排除水，因而降低自由能， 增加蛋白质的稳定 酶形成的多聚体或聚合体的活力和稳定性 也常比其单体高
三、化学修饰
化学修饰即修饰作用可达到稳定酶的作用， 得到可溶性稳定化酶。 1.可溶性大分子修饰酶：聚乙二醇 （PEG）、右旋糖苷、肝素等多糖以及白 蛋白，多聚氨基酸 2. 小分子修饰酶
第五节 蛋白质工程
蛋白质工程定义
以蛋白质分子的结构规律及其生物功
能的关系作为基础，通过化学、物理和分 子生物学的手段进行基因修饰或基因合成， 对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的 蛋白质。
蛋白质工程的基本目标：
是按预期的结构和功能，通过分子设计和
DNA 重组技术，对现有蛋白质加以定向改造、
设计、构建并最终生产出性能比天然蛋白质更加
比较蛋白质稳定性的准则包括:
1.熔化温度Tm;蛋白质伸展一半时的变性剂浓 度 2.蛋白质自由能; 3.最大稳定性温度(Ts); 4.在特定温度50%时 的变性剂浓度是预测酶稳定性的最有 用参数;
1.Tm: 蛋白质受热伸展过渡中点时的温度; 2.变性剂浓度: 蛋白质加变性剂伸展过程中 使蛋白质伸展一半时所需要的变性剂浓度;
1.降低蛋白质表面的疏水性； 2.增加蛋白质内部的疏水性
有3个主要因素不利于疏水相互作用：
1.蛋白质球体中的氨基酸必须相当紧密地堆 积； 2.影响氨基酸几何形状和能量的微环境； 3.蛋白质多肽链折叠时需要疏水簇仍保持在 蛋白质表面，因为在体内，疏水簇负责蛋 白质与其他分子的疏水相互作用。
二. 测定蛋白质稳定性的方法
第二节：蛋白质失活的原因和机理
一.蛋白水解酶和自溶作用
1. 酶在使用和贮存过程中的失活常是由于微 生物和外源蛋白水解酶作用的结果。蛋白 水解酶可催化肽键水解。 2.当蛋白质底物也是一种蛋白水解酶时，就 会发生自我降解现象，叫做自溶。
二.聚合作用： 蛋白质发生可逆性伸展 → → 伸展 的蛋白质分子彼此缔合 → → 可能发 生蛋白质分子间二硫键的形成从而使 蛋白质沉淀析出.