第四章 蛋白质的稳定性和稳定化..
蛋白质的稳定性和稳定化
A
B
C
A.用多功能试剂交联；B.共价或非共价连于载体上 C.包埋到载体的紧密孔中
二、非共价修饰
反相胶束 添加剂
蛋白质间非共价相连，形成的多聚体或者
聚合体的活力和稳定性常比单体高
反胶束是由两性化合物在占优势的有机相中形 成的。它不仅可以保护酶，还能提高酶活力， 改变酶的专一性。
反相胶束示意图
固定化可通过下列效应影响酶的稳定性：
空间障碍：由于空间障碍可以防止蛋白水解
酶的作用，阻挡酶与化学失活剂的接触，同时
阻碍氧向酶的扩散可以保护对氧不稳定的酶
扩散机制: 使酶发生交联或包埋在载体紧
密的孔中可以使酶的构象更加坚牢，从而阻止
酶构象从折叠态向伸展态过渡。
一 酶固定到载体上后可产生空间障碍，结果其他大
质信息进行基因和蛋白质序列的改造， 通过定
点突变使得所表达的蛋白质产生相应的特征改
变。
组合设计（combinational design）
和数据驱动设计（data-driven design）
是另外两种最新的可以提高蛋白质稳定
性的蛋白质工程技术。
组合设计:
是通过一种策略使得在基因水平上产生 差异化，同时，通常需要大量的高通量筛选 来鉴别设计是否获得成功。组合设计方法的 目标在于通过在蛋白质随机位点引入随机突
进化目的的一种技术。
随着突变方法、突变体高通量筛选技术、基因结
构与功能研究的突破，特别是PCR 技术的进一步
成熟，DNA 改组技术(DNA shuffling)更加成熟，
使得DNA 改组成为蛋白质体外分子进化的主流技
术。
DNA 改组技术具有许多重要优点， 例如不需要
事先了解结构信息，也不需要了解蛋白质的功能
《药剂学》章节重点
《药剂学》章节重点第一章绪论1、概念：药剂学、药物剂型（剂型）、药物制剂（制剂）药剂学：是一门研究药物剂型和药物制剂的设计理论、处方工艺、生产技术、质量控制和合理应用等综合性应用技术的科学。
药物剂型：是适合于疾病的诊断、治疗和预防的需要而制备的不同给药形式，简称剂型。
药物制剂：是指剂型确定以后的具体药物品种。
2、药物剂型的重要性无型不成药(原料药无法给药)疾病——剂型（急症缓症）药物——剂型（作用疾病类型、作用速度、作用部位、毒副作用、疗效等）3、药剂学的三大支柱是什么？制剂技术、药用辅料、制剂设备4、下面缩写字母代表的意思：DDS、GMP、OTC、SFDA、GLP、GCPDDS：药物传输系统，GMP：药品生产质量管理规范，OTC：非处方药，SFDA ：国家食品药品监督管理局，GLP：药品安全试验规范，GCP：药物临床试验管理规范5、GMP的检查对象和三大要素分别是什么？它适用于制药的哪个阶段？检查对象是人、生产环境和制剂生产的全过程。
三大要素：将人为的差错控制在最低的限度；防止对药品的污染和降低质量；保证高质量产品的质量管理体系。
用于药品的生产阶段第二章表面活性剂1.概念：界面、表面、表面张力、表面活性、表面活性剂、胶束、CMC、HLB、Krafft点、昙点界面：指物质的相与相之间的交界面。
表面：通常将有气体组成的气—固，气—液等界面称为表面表面张力：是指一种使表面分子具有向内运动的趋势，并使表面自动收缩至最小面积的力。
表面活性：甲物质的加入能降低乙液体的表面张力，则称甲对乙有表面活性。
表面活性剂：是指能使液体表面张力显著降低的物质胶束：溶解在水中达一定浓度时，其非极性部分会自相结合，形成聚集体，使憎水基向里、亲水基向外，这种多分子聚集体称为胶束。
CMC：表面活性剂分子缔合形成胶束的最低浓度称为临界胶束浓度HLB（亲水亲油平衡值）：是用来表示表面活性剂亲水亲油能力大小的值（非离子型表面活性剂）Krafft点：离子型表面活性剂在水中的溶解度随着温度的变化而变化。
第四章 计划工作概述试题
第四章计划工作概述一、单项选择题1、（P89）在管理中居于主导地位的工作是（）A、领导工作B、人员配备C、计划工作D、组织工作2、（P89）计划工作的核心是（）A、确定计划的前提条件B、确定可供选择的方案C、决策D、组织工作3、（P89）计划工作的经济性指的是A、投入与产出之间的比例关系B、实现预期目标C、编制计划要诀D、计划指标既先进又可行4、（P90）计划工作有利于管理人员把注意力集中于（）A、管理B、顾客C、目标D、战略5、（P92）基本建设计划属于（）A、按企业的职能分类B、按计划的内容分类C、按计划所涉及的范围分类D、按计划的表现形式分类6、（P93）下列不属于按计划表现形式分类的是（）A、程序B、规则C、培训D、预算7、（P95）计划工作的第一步是A、确定前提条件B、估量机会C、确定可供选择方案D、确定组织战略目标并对目标分解8、（P96）总计划的基础是（）A、可供选择方案B、预算C、预算方案D、派生计划9、（P96）衡量计划工作进度的重要标准时（）A、各种方案B、派生计划C、预算D、规划10、（P96）使计划数字化的工作是（）A、规划B、规则C、政策预算11、（P96）计划工作中强调抓关键问题的原理是（）A、灵活性原理B、许诺原理C、改变航道原理D、限定因素原理12、（P96）限定因素指的是（）A、有利于目标实现的因素B妨碍目标实现的因素C与目标实现无关的因素D、人为限定的假设因素13、（P97）在下列对许诺原理的表述中正确的是（）A、许诺大，所需的时间长，实习目标的可能性大B、许诺大，所需的时间长，实习目标的可能性小C、许诺小，所需的时间长，实习目标的可能性小D、许诺小，所需的时间长，实习目标的可能性大14、（P98）计划工作中最主要的原理是（）A、改变航道原理B、灵活性原理C、限定因素原理D、许诺原理二、多项选择题1、（P87）计划工作，就是根据实际情况，提出未来一定时期内组织所要达到的目标及实现目标的方法，具体内容包括( )A、做什么B、何时做C、何地做D、何人做如何做2、（P92）按企业的职能，管理计划可分为（）A、生产计划B、劳资计划C、安全计划D、财务计划人员培训计划3、（P92）按计划的内容分类，管理计划可分为（）A、专项计划B、综合计划C、生产计划D、供应计划财务计划4、（P93）按计划的表现形式分类，可分为（）A、目标B、战略C、政策D、规划使命5、（P96）计划工作的原理包括（）A、灵活性原理B、许诺原理C、改变航道原理D、限定因素原理责权一致原理三、名词解释1、（P87）计划工作2、（P97）许诺原理3、（P98）灵活性原理4、（P99）改变航道原理四、简答题1、（P96）简述计划工作的原理2、（P98）简述灵活运用原理的限制条件五、论述题（P87）论述计划工作5W1H的具体含义历年开题1、（P93）某化工企业为了在竞争中处于有利的地位，开发了某种投资很大的新产品，投产后非常畅销，企业领导也倍感欢欣。
请详细阐述蛋白质的生理功能
请详细阐述蛋白质的生理功能1.引言1.1 概述蛋白质是一类重要的生物分子，存在于所有生物体内，起着多种关键的生理功能。
蛋白质广泛参与细胞的结构组成、代谢调控、信号传导、免疫防御等诸多生命活动过程。
在细胞中，蛋白质作为一种复杂的有机化合物，由氨基酸组成。
氨基酸通过肽键结合形成多肽链，多个多肽链再通过特定的空间构象折叠成具有特定结构和功能的蛋白质分子。
蛋白质的结构多样，包括原核生物中的单链蛋白质和真核生物中更加复杂的多链蛋白质。
蛋白质具有多种功能，其中最基本的是作为生物体体内的结构组成成分。
细胞骨架由多种结构蛋白质（如微管蛋白、微丝蛋白和中间丝蛋白）构成，维持细胞的形态和机械性质。
此外，蛋白质还参与细胞内的代谢调控过程，调控基因表达、信号传导和酶催化等。
例如，激素是一类重要的调节蛋白质，它们通过与细胞表面的受体结合，触发一系列的生化反应，从而影响细胞功能。
其他的蛋白质也可以通过相互作用，形成信号通路，传递细胞内外的信号。
此外，酶是一类蛋白质，它们作为生物体内的催化剂，参与调控多种代谢反应的速率。
蛋白质的生理功能是极其复杂且多样的，还包括免疫防御和细胞运输等。
免疫球蛋白是一类重要的抗体蛋白质，通过与病原体结合，发挥抗菌和抗病毒的作用。
而携带氧气和二氧化碳的血红蛋白，则参与呼吸过程，将氧气从肺部输送到组织器官，将二氧化碳从组织器官带回肺部，从而维持正常的新陈代谢。
总体而言，蛋白质在细胞和生命活动中发挥着重要的功能，关乎生命的正常进行和健康维持。
对蛋白质的结构、合成和功能的研究，对于深入了解生命的本质和疾病的发生机制具有关键意义。
未来，随着科学技术的不断进步，蛋白质研究的发展将进一步推动生物医学领域的突破和进步。
1.2文章结构文章结构:本文将按照以下顺序详细阐述蛋白质的生理功能。
首先，在引言部分概述了蛋白质的重要性和研究意义。
接下来，在正文部分，将先介绍蛋白质的结构和组成，包括氨基酸的组成和蛋白质的层级结构。
食品酶学第四章 酶的稳定和固化
第四章酶的稳定性和固定化第一节酶稳定的分子原因◆稳定蛋白质构象的力（盐键、氢键、二硫键和疏水作用）。
◆金属离子、底物、辅助因子和其他低相对分子量配体的相互作用使酶蛋白构象稳定。
金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是拐弯处），可以显著增加酶的稳定性。
◆蛋白质与其它的生物大分子尤其是蛋白质与脂的作用。
在生物体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用形成复合物，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域，从而显著增加蛋白质的稳定性。
◆氨基酸残基的坚实装配蛋白质分子中存在约25%的体积的空隙，这些空隙通常为水分子所充满。
由布朗运动调节的极性水分子与蛋白质疏水核的接触会导致蛋白质不稳定。
◆对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低活性部位的氨基酸残基的氧化作用是酶失活的最常见机理之一。
如半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别敏感。
第二节酶不可逆失活的原因和机理◆蛋白质水解酶作用微生物和外源蛋白水解酶作用催化肽键水解。
由基因工程菌纯化真核细胞多肽时收率低，是由于体外蛋白水解造成的。
◆聚合作用聚合作用首先使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂，导致蛋白质可逆变性；其次，蛋白质分子彼此缔合，以减少疏水氨基酸的不利裸露；最后，如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发生分子间二硫键交换反应。
聚合作用有时可通过还原和再氧化再生天然二硫键，使蛋白质再活化。
聚合和简单沉淀是有区别的，后者并未使蛋白质发生显著的构象变化。
◆极端pH极端pH条件下，一旦远离蛋白质的等电点，蛋白质分子内相同相同电荷间的静电斥力会导致蛋白质伸展，埋藏在蛋白质内部的非电离残基会电离，这些构象变化能导致不可逆失活。
另外，强酸条件下或中等pH和高温相结合的条件下，肽键容易发生水解。
碱催化的β-消除反应可破坏蛋白质的二硫键。
◆氧化作用各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。
分子氧、过氧水和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。
◆表面活性剂(去污剂)阴离子去污剂如十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质结合时导致蛋白质伸展，使原先埋藏的疏水氨基酸暴露，有利于SDS的进一步结合，直至达到饱和为止，SDS聚集在蛋白质暴露的疏水区域周围。
酶蛋白的稳定性和稳定化
第三节 酶蛋白的稳定化
一、固定化
二、非共价修饰 三、化学修饰
四、蛋白质工程
但最近X射线结晶学方法证实，蛋白质非极性表面
上水分子的结构重排，能引起系统的熵值降低和蛋白 质折叠状态的改变：蛋白质的非极性部分总是倾向于
使其不与水接触，并尽可能的隐藏在蛋白质球体内部，
从而增加蛋白质的稳定性。
二、测定蛋白质稳定性的方法
熔化温度（Tm，酶蛋白变性伸展过程中的温度）
3.盐桥和氢键
酶蛋白分子中的盐桥对其结构的稳定性具有很显著的 作用。如：嗜热脂肪芽孢杆菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶与 来自兔子的嗜温脱氢酶的三维结构很类似，但嗜热酶亚基 间有盐桥，因此其变性温度和最适温度都比嗜温酶高约 20℃。 氢键能维持二级结构，但对酶蛋白稳定性影响不大。
4.二硫键
酶蛋白的分子内交联可提高其在溶液中的稳 定性。酶蛋白中二硫键的形成，能显著增加酶蛋 白的稳定性。
（4）氧化作用（部分氨基酸侧链易氧化） （5）表面活性剂和去污剂（与酶蛋白结合，导致疏水氨基酸残基暴露） （6）变性剂： 高浓度盐（结合酶蛋白的带电基团与降低酶蛋白周围的水簇数目） 有机溶剂（改变介电常数、夺水及使疏水基团暴露） 金属离子（螯合） 脲和盐酸胍（消除疏水相互作用及与酶蛋白分子直接作用）
Disulfide bond
5.敏感氨基酸含量低
酶蛋白的变性等反应容易发生在敏感的氨基 酸残基上，如活性部位的氨基酸被氧化是酶蛋白 失活最常见的现象。在稳定的嗜热酶中不稳定氨 基酸的数目明显比相应的嗜温酶蛋白中低。
6.氨基酸残基的坚实装配
酶蛋白的分子结构中有孔隙，通常这些孔隙 被水分子所充满。极性的水分子通过布朗运动与 蛋白质的疏水键接触会导致蛋白质不稳定。若酶 蛋白的结构坚实，则水分子从孔隙中被除去，蛋 白的稳定性也相应增加。
蛋白质的稳定性
蛋白质稳定性与活性的关系
蛋白质的稳定性与其功能活性 密切相关。
稳定的蛋白质能够更好地维持 其构象和功能，从而在生理条 件下发挥其作用。
蛋白质的稳定性不足可能导致 其构象变化和功能丧失，从而 影响生物体的正常生理活动。
影响蛋白质稳定性的因素
温度
高温会导致蛋白质构象发生变化，破坏其稳 定性。
离子强度
THANKS
感谢观看
高离子强度可能影响蛋白质的构象和稳定性。
pH值
过酸或过碱的环境可能导致蛋白质的变性失 活。
有机溶剂和重金属离子
某些有机溶剂和重金属离子能够与蛋白质结 合，破坏其构象和稳定性。
02
蛋白质的化学稳定性
酸碱稳定性
总结词
蛋白质在酸碱环境中容易发生变性， 失去原有的生物活性。
详细描述
蛋白质的稳定性与所处的酸碱环境密 切相关。在酸性或碱性环境中，蛋白 质的二级结构会受到破坏，导致其失 去原有的生物活性。
光学稳定性
光学稳定性是指蛋白质在一定条件下保持其光学性质的稳定性。这包括对紫外线和 可见光的稳定性以及对荧光标记的稳定性。
紫外线照射和可见光照射可能会引起蛋白质的变性，这通常会导致其光学性质的改 变。因此，在实验中应尽量避免长时间暴露于紫外线和可见光下。
对于荧光标记的蛋白质，应选择与蛋白质结合稳定的荧光染料，并避免在实验过程 中发生荧光淬灭或漂白。
详细描述
氧化剂和还原剂可以与蛋白质中 的氨基酸残基发生反应，导致蛋 白质的空间构象发生变化，从而 失去原有的生物活性。
压力稳定性
总结词
蛋白质在高压环境下容易发生变性，失去原有的生物活性。
详细描述
在高压环境下，蛋白质的空间构象会发生变化，导致其失去 原有的生物活性。压力可以改变蛋白质的水合状态和构象， 从而影响其稳定性。
蛋白质稳定性的分析和评估方法
蛋白质稳定性的分析和评估方法随着生物技术的飞速发展，蛋白质在药物研发、工业生产等领域中扮演着越来越重要的角色。
然而，蛋白质的稳定性对于其功能和应用都有着至关重要的影响，因此如何准确地评估蛋白质的稳定性就成为了研究人员关注的焦点之一。
1. 蛋白质的稳定性概述蛋白质的稳定性是指在特定条件下，蛋白质结构和功能的改变能力。
蛋白质的结构包括一级结构、二级结构、三级结构和四级结构，其中主要以三级结构的稳定性表现最为重要。
蛋白质的三级结构存在着多种稳定化相互作用，比如氢键、疏水力、静电作用等，它们通过对蛋白质分子的不同区域产生相应的影响，维持了蛋白质的空间构型。
2. 蛋白质稳定性的影响因素蛋白质的稳定性受到多种因素的影响，主要包括温度、pH值、有机溶剂、盐浓度、氧化还原状态等。
其中，温度是影响蛋白质稳定性的主要因素之一。
在高温下，蛋白质的热运动会变得更剧烈，导致分子间的相互作用逐渐减弱，形成的蛋白质结构也会变得不稳定。
pH值是另一个影响蛋白质稳定性的因素。
当pH值偏离蛋白质最适宜的pH值时，极端的低或高pH值都可以导致蛋白质的三级结构发生改变。
此外，有机溶剂、盐浓度等因素也都会对蛋白质的稳定性产生不同程度的影响。
3. 蛋白质稳定性的分析方法目前，用于评估蛋白质稳定性的方法主要包括基于热力学的方法、基于动力学的方法和基于结构的方法。
热力学方法基于蛋白质在不同时间和条件下的热力学特性来评估其稳定性，包括热解、热容量、热传导等。
这些参数可以反映蛋白质在不同条件下的稳定性特点，但是无法直接反映蛋白质的功能状态。
基于动力学的方法则主要考虑蛋白质在不同条件下的动力学特性，比如蛋白质速率常数、反应速率等。
这种方法主要适用于已知蛋白质结构和反应途径的情况下进行评估，但对于未知结构的蛋白质则无法很好地适用。
基于结构的方法则是比较常用的评估方法。
通过对蛋白质结构的理解和分析，推断出蛋白质在不同条件下的结构转换情况，从而评估其稳定性。
蛋白质的稳定性PPT共54页
END
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
蛋白质的稳定性
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
第四章 蛋白质的稳定性和稳定化
蛋白质的稳定性: 蛋白质抵抗各种 因素的影响,保持其生物活力的能 力. 蛋白质的特定功能是由其特定的 空间结构决定的,要保持其生物活 理解蛋白质 力,必须保持其空间结构,稳定蛋白 稳定性的概念? 质空间结构的因素是什么?
维持蛋白结构稳定的主要因素:
① 金属离子、底物、辅因子和其他相对低分 子质量配体的结合作用 ② 蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 ③ 盐桥和氢键 ④ 二硫键 ⑤ 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 ⑥ 氨基酸残基的坚实装配 ⑦ 疏水相互作用(思考题)
熔化温度Tm;蛋白质伸展一半时的
变性剂浓度 蛋白质自由能; 最大稳定性温度(Ts); 在特定温度下蛋白质功能活性维持 时间.
思考
熔化温度Tm和蛋白质伸展50%
时的变性剂浓度是预测酶稳定性 的最有用参数;
Tm: 蛋白质受热伸展过渡中点时的
温度; 变性剂浓度: 蛋白质加变性剂伸展 过程中使蛋白质伸展一半时所需要 的变性剂浓度;
思考
三． 极端pH: 活性中心氨基酸必需基团电离. pH的变化可以引起蛋白质的伸展,这个过程原 则上是可逆的,但这些变化常能导致不可逆的 聚合或酶的自溶,引起不可逆失活. 四． 氧化作用: 各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及 蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧、 H2O2和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。 五． 表面活性剂和去污剂 表面活性剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈 的相互作用,导致蛋白质不可逆变性.其中阴离 子去污剂的作用比阳离子和非离子去污剂强烈.
疏水性标尺
疏水性氨基酸越多越稳定?
疏水性与蛋白质稳定性的关系小结
疏水性大小与稳定性没有必然的联系 非极性氨基酸在蛋白质球体内的规则的排 列是稳定性的原因之一 增加疏水作用是稳定蛋白质的实用方法:降 低蛋白质表面的疏水性,增加蛋白质内部的 疏水性
第四章蛋白质的稳定性
有两个特点已经明确，
第一，这些试剂消除了在维持蛋白质三级结构中起重要作 用的疏水相互作用。
第二，它们直接与蛋白质分子作用。尽管准确的作用机理 不清楚，但脲及盐酸胍广泛用于检测蛋白质可逆伸展的构 象稳定性。 应当特别注意的是，由脲可自发形成氰酸盐。8 mol/L脲 溶液平衡时大约含有0.02 mol/L氰酸盐。氰酸盐可与蛋白 质中的氨基和巯基相互作用，引起不可逆失活。因此，脲 溶液应在用前用优质固体脲新鲜配制
金属离子，二硫化物 蛋白激酶 底物
加热，极端pH 加热，高pH
加热，高PH 螯合剂、透析、加热，金属离子 化学修饰，极端pH, 脲，表面活性剂，高温或低 温 蛋白质浓度低, 加热 加热，极端pH, 有机溶剂,盐酸胍 流体形变
一、 蛋白水解酶和自溶作用
蛋白水解酶可催化肽键水解。当蛋白质底物也是一种蛋 白水解酶时，就会发生自我降解现象，叫作自溶。
6、氨基酸残基的坚实装配
蛋白质结构中存在有空隙。按照Chothia说法，蛋白球 体积的大约25%仍未充满，即不是被氨基酸占据。但溶质 分子可以包埋在这些孔隙中。这些孔隙通常为水分子所充 满。分子量为2―3万的蛋白质中约有个5―15水分子 。由 布朗运动调节的极性水分子与球体疏水核的接触会导致蛋 白质不稳定。随着水分子从孔隙中除去，蛋白质结构变得 更坚实，蛋白质的稳定性也增加。因此，蛋白质的坚实化 可作为一种人为稳定蛋白质的方法。
H2O2是非专一性氧化剂。在酸性条件下，它主要把蛋 氨酸氧化成它的亚砜。
五、表面活性剂和去污剂
表面活性剂是由疏水基团和亲水基团组成的化合物。 去污剂有离子性和非离子性两大类，都含有长链疏水尾巴 但“头”部基团不同，有带电的，有不带电的
去污剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈的相互作用，导 致蛋白质不可逆变性。
蛋白稳定性2
化学因素
• 与水混溶的有机溶剂： 一元醇和其他溶剂，因疏水作用常引起稳定性降低。 二元醇，取决于其疏水性大小。 三碳或多碳的多元醇，有增加天然态稳定性的作用。 • 表面活性剂：低浓度下，因与蛋白质有强的相互作 用，引起变性。离子型比非离子型变性作用更强。 • 螯合剂：像EDTA, 1.10-二氮杂啡能结合配基或金属 离子，使含有金属离子的蛋白质失活。
失活机理
• 天然态在一定程度上仅是热力学稳定，低 自由能使其倾向于不稳定，环境的微小变 化也会引起负自由能变化。自由能仅决定 平衡时的天然态和可逆变性态的比例，不 能说明达到平衡的速度。 • 达到平衡时的速度是由变性和复性的自由 活化能决定。变性活化能不同于天然态和 活化态的自由能；复性活化能不同于活化 态和变性态的自由能。
1.加入必需金属离子，底物，抑制剂，辅酶等 添加剂 2.改变酶表面附近水活性（蛋白质的优先水化） 添加剂 3.引入二硫键加固活性构型 蛋白质工程 4.减少疏水表面基团 蛋白质工程 5.增加内部疏水作用 蛋白质工程 6.氨基酸残基紧密装配 蛋白质工程
稳定化策略和方法
策 略 方 法
• 抑制次级‘不可逆’反应
1.降低对氧化作用敏感的氨基酸 2.低温和适中的pH 3.抑制稳定化策略和方法
• 稳定酶的筛选：不同生物来源的同功酶具有不同 的稳定性，通过筛选可得稳定性好的酶。高温菌， 极端、特殊环境微生物产生的蛋白质产品。 • 添加剂 1.天然态的稳定化：根据非共价相互作用：底物， 产物，抑制剂，别构效应物其他低分子量配基。 金属离子和离子型物质（低浓度）；蛋白质，聚 合物 。
第四章 酶蛋白的稳定性和稳定化
5、二硫键 二硫键在稳定某些蛋白质的构象方面 起着重要作用。 大分子的分子内交联可增强其坚实性， 并提高其在溶液中的稳定性。 由于交联即蛋白质中形成二硫键，伸 展蛋白质的熵急剧降低，这个稳定化效 应值随着肽链中氨基酸数目的增加而增 加。 当然，用双功能试剂实现分子内交联， 也能使蛋白质构象稳定化。
四、蛋白质工程
蛋白质工程是指利用基因工程手段，包 括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行 改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白 质分子。 用此法可得到这样的蛋白质：其结构与 母体分子只有一个或几个氨基酸残基的差别。
生物体内存在的天然蛋白质，有的需要进行改 造。由于每种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序， 所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性 质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变 构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋 白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根 据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重 新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的 需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变， 以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基 因定点突变技术。
蛋白质的稳定性不仅取决于多种外界 条件（热、变性剂或PH）而且主要取决于 蛋白质本身的组成和性质。
第一节 酶蛋白的稳定性
一、酶蛋白稳定性的分子原因 定义： 蛋白质的稳定性指的是蛋白质抵抗 各种因素的影响，保持其生物活力的能力。
蛋白质的特定功能是由其特殊的空间 结构决定的。显然要保持其生物活力，必 须保持其空间结构。
九、冷冻和脱水
冷冻可使蛋白质发生可逆和不可逆失活。
1、很多变构酶在温度降低时会产生构象变化。
2、在冷冻过程中溶质（酶和盐）随着水分子的
结晶而被浓缩，引起酶微环境中的pH和离子强
第四章 酶蛋白的稳定性和稳定化
酶所具有的特有活性构象是分子中各种相互作用的结果。
变性：蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间 构象被改变，蛋白质分子从原来有序的卷曲的紧密结构变 为无序的松散的伸展状结构从而导致其理化性质的改变和 生物活性的丧失，称为~。分为可逆变性与不可逆变性。 失活： 蛋白质的生物活性丧失。 变性与失活的关系： 变性蛋白质一定失活，但失活并不一定全是变性的结果 如蛋白质肽链水解断裂、辅基除去及抑制剂的存在等，均
活力。
一旦远离等电点，蛋白质分子内相同电荷间的静电斥力会导 致其伸展。而且在蛋白质伸展后，埋藏在内部的非电离残基 也发生电离。 His残基主要负责酸性pH下的蛋白质伸展。 对蛋白酶来说，常会导致自溶。 极端 pH 能启动改变、交联或破坏氨基酸残基的化学反应，结 果引起不可逆失活。
2014/10/13 29
性。使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂；
其次，这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合， 以最大限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露； 最后，如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基， 则会发生分子间二硫交换反应。 注意: 聚合和简单的沉淀作用是有区别的。
2014/10/13
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三、极端pH
pH改变可引起催化必需基团的电离，导致失活。 pH的较小变化对酶结构没有严重影响，重新调节pH，可恢复
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一、蛋白水解酶和自溶作用
酶在使用和贮存过程中的失活常是由于微生物
和外源蛋白水解酶作用的结果。 蛋白水解酶可催化肽链水解。 蛋白酶溶液中，蛋白酶分子可以相互催化，造 成蛋白酶降解，酶活降低叫做自溶。
2014/10/13
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二、聚合作用
聚合很久以来就被认为是蛋白质失活的一种机理。 首先，必须发生单分子构象变化，导致蛋白质可逆变
蛋白质的稳定性与稳定化2
➢ 如何防止酶的可逆伸展 ➢ 一旦酶发生可逆伸展，如何防止其不可逆失活发生。
方法： ➢固定化 ➢非共价修饰 ➢化学修饰（共价修饰） ➢蛋白质工程
一、固定化
几种酶固定化方法对酶固定化后的示意图 (a)用双功能试剂交联；(b)共价或非共价偶联于载体上；(c)包埋到
载体中。
1．空间障碍： 使得其它大分子难于与酶接近和作用，可以防止蛋白 水解酶和蛋白酶抑制剂的作用。同时，还可以防止化 学失活；
的失活； d.交联酶晶体还能增加热稳定性及抗有机溶剂，但具体
原因不详。
（四）蛋白质工程
➢ 工程二硫键 ➢ 增加蛋白质内部疏水性 ➢ 酶表面亲水化 ➢ 抗氧化失活 ➢ 取代天冬酰胺或谷氨酰胺，防止其脱氨失活。
④用非极性试剂修饰可加强蛋白质中的疏水相互作用； 位于蛋白质表面的很多疏水残基常聚集形成表面疏水 簇。如果待修饰的残基位于这类疏水簇附近，那么具 有适当链长的修饰剂就会与用而增加蛋白质的稳定性。
Illustration of the main driving force behind protein structure formation. In the compact fold (to the right), the hydrophobic amino acids (shown as black spheres) are in general shielded from the solvent.
②非专一性的中性盐：稳定蛋白质表面的疏水基团。 ③多羟基化合物（甘油、糖和聚乙二醇）：与蛋白质形
成大量氢键。同时，还通过对蛋白质的有效脱水，降 低蛋白水解作用。
④与酶失活剂竞争的物质或除掉能引起酶化学催化反应 的物质，如螯合剂，还原剂等。
蛋白质稳定性
蛋白质稳定性钟佳生态环境研究中心201028004237067蛋白质的稳定性取决于它的结构变化。
而蛋白质其结构又是由多肽在蛋白质分子伴侣的结合下的蛋白质折叠构象。
其过程中非极性氨基酸侧链被埋藏在蛋白质分子的内部而不与水接触。
很多实验证明蛋白质折叠或是变性是热力学可逆的。
而解开蛋白质折叠所需要的能量典型值为5-20 kcal/mol。
即使非常小的相互作用也会对稳定性有非常重要的影响。
那么保持蛋白质稳定的折叠构想的主要力是什么？影响蛋白质稳定性的条件有哪些？本次作业就所学的内容作总结。
蛋白质折叠主要作用力是疏水效应，也就是非极性溶质转移到水溶液中的过程。
蛋白质存在一种与极性溶剂相斥的作用，因而在极性溶液中能够保持稳定。
因而，非极性溶液变形蛋白质的实验（Singer, 1962; von Hippel &Schleich, 1969a）则可得到，非极性溶剂可以通过溶剂化暴露的非极性氨基酸来降低变性状态的自由能。
差热扫描量热实验与非极性溶液转移至非极性溶液的热量变化相关性检验。
对埋藏于内核和分布于蛋白质内核外核的疏水残基的作用也解释了蛋白质的疏水作用是主要的作用力。
而这一过程从能量角度解释，蛋白质变性具有正的焓变，以及很小或者是正的熵变（Baldwin, 1986;Privalov & Gill, 1988）。
同时还有大幅度的热容增加。
其他也起一定的作用的力有如下几种。
1.静电力（静电的电荷排斥和离子对）或是pH，蛋白质表面的离子对序列突变会影响稳定性，离子作用会导致静电收缩，同时蛋白质中离子对有限。
2.残基间氢键和范德华力。
此“二级结构力”提供的肽氢键在折叠状态下比去折叠状态要高；其次，水中单体间氢键相对于单体和水之间在焓上不利；同时肽键之间氢键形成劣于肽键与溶液之间氢键形成。
3.内聚性质。
这是与序列相关的、包含两个或者三个肽段的构象优先性，这种优先性源于作用在所连接的残基局部的短程和长程力的和，是水溶液中长多肽螺旋形成的影响之一。
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在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以 应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于 工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性， 但在工业生产中没有活性或活性很低。这是 因为工业生产中每一步的反应体系中常常会 有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高， 在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。 提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常 重要的课题。一般来说，提高蛋白质的稳定 性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定 性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要 氨基酸氧化引起的活性丧失等。
评定稳定化方法的标准
稳定性至少增加1~3个数量级
应对各种酶失活因素都有保护作用
稳定化不应减少酶活力或改变酶的专一
性
稳定化方法应适合各类蛋白质 稳定化方法应在体内、体外都适用 从经济角度看，方法应具有放大的潜力
二、各方法的比较
随机共价修饰法，如将PEG连到 酶上，显然不能令人满意 蛋白质工程和选择抗体保护法更 符合这些标准，具有普遍性 从难易程度和费用看，后者显然 优于前者 增加酶稳定性的新方法、新观念 仍有待开发，其研究进展必将加 速酶在生物工程各个领域的应用
渗透剂的作用第一次是在1982年被发现，其主 要作用是保护在逆境中的生物。它们能保护人 肾脏中的细胞，如分解掉大量含破坏蛋白质的 化学尿素；它们能使一种冻结的北极青蛙在无 损伤的情况下解冻；并且它们还能使奇异微小 生物"水熊"生活在极度干燥、强烈辐射和绝对 零度以上几度到过热蒸汽的温度范围内。 Matthew Auton和D. Wayne Bolen在文章中描述 了热力学计算的应用，并成功预测了多种渗透 剂在逆境状态下保护蛋白质的能力。极热、极 冷或细胞周围化学环境的改变均能影响蛋白质 正常功能的行使，而渗透剂则可以让蛋白质具 有正确的结构形式，并正常行使功能。
下面举一个如何通过蛋白质工程来提高重组β-干 扰素专一活性和稳定性的例子。
– 干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素
活性为106 U/mg，只相当于天然产品的十分之一， 虽然在大肠杆菌中合成的β-干扰素量很多，但多数是 以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改 变这种状况？
蛋白质是折叠的，生物医学研究的主要目的 就是了解它们折叠或在不稳定时展开的原因。 需要研究渗透剂是如何影响不同蛋白质的稳 定性的，以及它们之间的互作情况，这将为 研究蛋白质折叠过程提供重要的信息。 蛋白质的折叠与伸展是病变的一个明显特征， 如老年痴呆症、疯牛病和囊肿性纤维化。渗 透剂在人体多种器官行使功能，尤其是在肾 脏和大脑中。没有渗透剂，肾脏将无法行使 功能，大脑组织也不能反应。 医学研究主要针对它们在肾脏中的作用，而 它们也出现在其它很多组织中，该项技术将 有助于医学研究人员研究渗透剂在整个体内 的作用。
第二节 蛋白质不可逆失活的原因和机理
蛋白水解酶和自溶作用 聚合作用 极端pH 氧化作用 表面活性剂和去污剂 变性剂 重金属离子和巯基试剂 热 机械力 冷冻和脱水 辐射作用
第三节 蛋白质的稳定化
固定化 酶修饰 蛋白质工程
– 工程二硫键
– 增加蛋白质内部疏水性 – 酶表面亲水化 – 抗氧化失活 – Asn脱胺失活
1.你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋 白质工程有什么关系？我国科学家承担
了什么任务？
2.对天然蛋白质进行改造，你认为应该
直接对蛋白质分子进行操作，还是通过
对基因的操作来实现？
提高酶蛋白质的稳定性
葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，为 提高其热稳定性，朱国萍等人在确定第138位 甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸后，用双引物法 对GI基因进行体外定点诱变，以脯氨酸 （Pro138）替代Gly138，含突变体的重组质粒 在大肠杆菌中表达，结果突变型GI比野生型 的热半衰期长一倍；最适反应温度提高10～ 12℃；酶比活相同。
据分析，Pro替代Gly138后，可能由于引入了 一个吡咯环，该侧链刚好能够填充于Gly138 附近的空洞，使蛋白质空间结构更具刚性， 从而提高了酶的热稳定性。
第一节 蛋白质的稳定性
蛋白质稳定性的分子原因
– 金属离子、底物、辅因子和其他低相 对分子质量配体的结合作用
– 蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用
– 盐桥和氢键 – 二硫键 – 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 – 氨基酸残基的坚实装配
– 疏水相互作用
科学家发现能预测蛋白质稳定性 的小分子
近日，德克萨斯州立大学医学院(UTMB)的 研究人员发现了一种新的方法，可预测一 种特殊小分子在处于极端环境的各种器官 中所具备的能力。 研究结果发表在10月7日网络版的《美国国 家科学院院刊》（PNAS）中，该方法是通 过一种叫"渗透剂"的有机小分子对细胞内 蛋白质稳定性影响情况来进行研究的。结 果将有助于老年痴呆症、囊肿性纤维化、 肾脏疾病和稳定蛋白药物等的研究。
酶的失活和再活化
第四节 各种酶稳定化方法的比较
一、酶稳定化的标准
– 稳定性至少增加1-3个数量级 – 应对各种酶失活因素（物理、化学及生物
学因素）都有保护作用
– 稳定化不应减少酶活力或改变酶的专一性 – 稳定化方法应适合各类蛋白质
– 稳定化方法应在体内、体外都适用
– 从经济角度看，方法应具有放大的潜力
– 研究发现，β-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17
位、31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱氨 酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的半胱 氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠 杆菌中生产的β-干扰素的抗病性活性提高到108 U/mg， 并且比天然β-干扰素的贮存稳定性高很多。