菌种的制备和保藏-1
菌种的管理和保藏课件
•2024/5/26
•菌种的管理和保藏
•25
详细记录
菌种的来源、接收、传代、分离、复壮、使用 和鉴定等均应做好详细记录。包括菌保存位置、 环境(温度)、种传代或使用时间、名称、菌号、 代数、传代或保存形式、分离、复壮方式、使 用内容、鉴定情况等都应进行详细的记录。
•2024/5/26
•菌种的管理和保藏
分离一般采用平板培养基。
分离方法主要有分段划线法、连续划线法、 涂布分离法、倾注分离法等。
•2024/5/26
•菌种的管理和保藏
•16
培养 ：接种后的培养基，根据不同微生物
生长条件的要求，将培养基放在适宜微生物 生长的环境中（温度、湿度、氧气等），使 其生长繁殖的过程。 需气菌培养法 厌氧培养法
•2024/5/26
•菌种的管理和保藏
•13
细菌的接种、分离和培养 常用培养基种类 斜面培养基 半固体培养基。 液体培养基 平板培养基
•2024/5/26
•菌种的管理和保藏
•14
接种方法 涂布法 划线法 穿刺法 直接加入法等
•2024/5/26
•菌种的管理和保藏
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分离：为了获得纯菌种（株），采用的 将细菌分离成单个细胞，使其独立分裂繁 殖形成单个菌落的操作技术。
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菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购买 应有证明和登记，并包装严密。 菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应 有详细记录。
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•27
菌悬液的制备与保存
菌悬液的制备与保存 参照《中国药典》2010版培养基适用性 试验。
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•菌种的管理和保藏
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谢谢
菌种怎么制作,菌种保藏方法
菌种怎么制作，菌种保藏方法1、将土豆切成块，放入烧杯中煮半个多小时，煮好后过滤溶液备用。
2、将琼脂放入溶液中，然后重新将其烧开，琼脂完全溶化后继续煮一段时间。
3、煮好后将汁液分放至试管内，并用高压锅消毒杀菌，消毒后斜放试管，待凝固后开始接种。
4、用酒精对嫩蘑菇进行杀菌，并在无菌箱内将其切成小块，切好后可接种至琼脂基质上。
5、堵上试管口，将琼脂基质放入培养箱，长满菌丝后便可形成一级菌种。
一、菌种怎么制作1、一级菌种（1）向烧杯内放入切成块的土豆，然后煮30多分钟，煮好后过滤溶液备用。
（2）向溶液内放入琼脂，再将其烧开，待琼脂完全溶化后继续煮一段时间。
（3）煮好后，将汁液分放至试管，再用高压锅消毒杀菌。
消毒后将试管斜放，直到冷凉凝固后即可开始接种。
（4）用酒精对嫩蘑菇做杀菌处理，然后在无菌箱内切成小块，接种至琼脂基质上面。
（5）用塞子堵上试管口，再将琼脂基质放入培养箱内，待长满菌丝后即可形成一级菌种。
2、二级菌种（1）将煮熟的大豆和谷粒置于无菌的条件下晾干，再装入经过高温杀菌的玻璃瓶内。
（2）将瓶子封口，放入高压锅中，经高压灭菌后放在无菌室冷凉。
（3）将培养瓶放至无菌箱内，再放入一级菌种，用的小匙挖出黄豆大小的菌种接种入玻璃瓶。
（4）接种后要封口，再将玻璃瓶放到培养室中，待长满菌丝后即可备用。
3、三级菌种（1）制备方法与二级菌种基本一致，培养基可使用煮熟的麦粒、玉米粒及棉籽。
（2）三级菌种的菌丝长满后即可取出来培育，经历三级菌种的培育后可完全制成平菇菌。
二、菌种保藏方法1、斜面低温保藏法将菌种接种至适宜的固体斜面培养基上，待菌种充分生长后用油纸将棉塞部分包扎好，然后放入冰箱，温度控制在2-8°C即可。
2、甘油管保存法（1）将80%甘油用高压蒸汽做灭菌处理，再将菌种放置在斜面培养基上培养，用无菌水制成高浓度的菌悬液。
（2）将1毫升甘油与菌液混匀，使甘油的浓度达到10-30%，然后放在-70°C的环境中冻存。
菌种保藏方法及复壮技术
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
菌种保藏方法
菌种保藏方法(来源:微生物保藏管理中心)定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
适用于细菌和酵母菌等。
青霉素生产菌种的制备与保藏方法
青霉素生产菌种的制备与保藏方法生命科学学院生物10-2 赵鑫指导教师：朴永哲摘要：青霉素发酵属单一纯菌种发酵，青霉素生产菌种的制备是青霉素发酵过程的关键环节，生产菌种的质量是影响发酵生产水平的重要因素。
在生产过程中既要有优良的菌种，又要有良好的培养条件才能获得高质量的种子。
本文将对青霉素生产菌种的制备与保藏方法进行介绍。
关键词：产黄青霉；青霉素；制备工艺；保藏方法1.概述1.1 青霉素的定义青霉素（Benzylpenicillin / Penicillin）又被称为青霉素G、peillin G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。
青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。
1.2 青霉素的应用青霉素类抗生素的毒性很小，由于β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁，而人类只有细胞膜无细胞壁，故对人类的毒性较小，除能引起严重的过敏反应外，在一般用量下，其毒性不甚明显，是化疗指数最大的抗生素。
临床应用：主要控制敏感金黄色葡糖球菌、链球菌、肺炎双球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌、螺旋体等引起感染，对大多数革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体有抗菌作用。
青霉素针剂和口服青霉素能分别治疗肺炎、肺结核、脑膜炎、心内膜炎、白喉、炭疽等病。
工业应用：可用于生产柠檬酸、延胡索酸、葡萄糖酸等有机酸和酶制剂。
2.菌种及保藏方法介绍2.1 菌种介绍产黄青霉属无性型真菌，一种属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目从梗孢科青霉属的真菌。
分布于土壤、空气及腐败的有机材料等基物。
最适生长温度为20-30°C。
产生青霉素、多种酶类及有机酸，是重要的工业用真菌，也产生真菌毒素。
产黄青霉的发现和大规模地生产、应用，不仅对抗生素工业的发展起了巨大的推动作用，而且加上其他抗生素的广泛使用，比如像磺胺药物，使人类的平均寿命，再次延长了四岁。
生产菌种的扩大培养与保藏简介
生产菌种的扩大培养与保藏简介1. 引言生产菌种的扩大培养与保藏是微生物工程中不可或缺的重要环节。
在微生物工业中，菌种数量的扩大和保藏对于生产规模的控制和后续的实验操作至关重要。
本文将介绍生产菌种的扩大培养和保藏的基本原理、方法和注意事项。
2. 菌种的扩大培养菌种的扩大培养是将初始的菌株培养至足够数量供生产使用的过程。
以下是菌种的扩大培养的基本步骤：2.1 选择培养基根据菌株的特性和要求，选择适当的培养基进行扩大培养。
常见的培养基包括富含营养物的培养基和特殊功能的培养基。
2.2 菌种的预培养在扩大培养前，先进行菌种的预培养。
从保存的菌种中挑取适量的菌落或菌点接种到预培养培养基中，进行为期数小时的预培养。
2.3 液体扩大培养将预培养的菌种转移到液体培养基中，并进行液体扩大培养。
根据需要的菌种数量，选择适当的容器和培养条件进行扩大培养。
2.4 固体扩大培养液体培养经过一定周期后，可以将菌种转移到固体培养基中进行固体扩大培养。
固体培养可以有助于菌落的生长和分离。
2.5 菌种的检测和纯化在扩大培养结束后，需要对菌种进行检测和纯化。
常用的方法包括菌落PCR、生化测试和纯化子代的分离。
3. 菌种的保藏菌种的保藏是为了长期保存和储备菌种，保证其稳定性的一系列措施。
以下是常见的菌种保藏方法：3.1 冷冻保存法将菌种在适当的保存液中制备冻存物，并存放在低温冰箱或液氮罐中。
常用的保存液包括甘露醇、甘油等。
3.2 干燥保存法将菌种在无菌条件下培养至晚期生长期，用无菌纱布吸干培养基上的菌落，将菌落贴附在无菌纸上，然后将纸张放置在干燥剂中保存。
3.3 冷冻干燥法通过冷冻和干燥的交替操作，将菌种制备为干燥粉末，再用密封容器保存。
冷冻干燥法在菌种保存期间能保持菌种的高度稳定。
3.4 液氮冷冻保存法将菌种悬浮液或培养物直接置于液氮罐中，利用极低温度保存菌种。
这种方法能够保留菌种的生物学特性，并保证菌种长期保存。
4. 注意事项在进行生产菌种的扩大培养和保藏时，需要注意以下事项：•严格遵守无菌操作规范，防止污染和交叉感染。
菌种制作及保藏
第六节 消毒与灭菌
一、概念 1、 灭菌 ：在一定范围内彻底杀灭物料及其容 、 器中的一切微生物。 器中的一切微生物。 2、消毒： 用物理或化学的方法，消灭物体表 、消毒： 用物理或化学的方法， 面或环境中一部分微生物的措施。 面或环境中一部分微生物的措施。也称简易非 彻底的灭菌。 彻底的灭菌。在医学上泛指对病原微生物的杀 灭。
加棉塞
质检
三、 各级菌种的培养时间 1、试管种 7-10天 、 天 2、二级种 30-60天 、 天 3、三级种 30-60天 、 天
四、全年菌种生产时间安排 时间 名称 香菇 木耳 银耳 金针菇 侧耳类 猴头菇 双孢菇 草菇 段木 2-4月 月 3-4月 月 3-4月 月 袋料 8-9月 月 2-3月(春) 8-9月(秋) 月春 月秋 3-4月(春) 9-10月(秋) 月春 月秋 11-1月 月 2-4月(春) 8-10月(秋) 月春 月秋 3-4月(春) 8-9月(秋) 月春 月秋 9-10月 月 6-8月 (华中 4-10月(华南 华中) 华南) 月 华中 月 华南
三、常用药品 1、HgCl2 、 2、C2H5OH（60%—70%） 、 （ ） 3、KMnO4 、 4、CH3COOOH（过氧乙酸） 、 （过氧乙酸） 5、HCHO(38%) 、 6、C6H4CH3OH（来苏尔） 、 （来苏尔） 7、C6H5OH 、 8、C21H38NB（新洁尔灭） 、 （新洁尔灭） 9、气雾消毒盒 、
二、培养基的类型及应用 (一)、按培养基的物理状态分液体培养基、固化 一 、按培养基的物理状态分液体培养基、 培养基和固体培养基 (二)、按营养物质的成分；可分为天然培养基、 二 、按营养物质的成分；可分为天然培养基、 半合成培养基和合成培养基 (三)、根据培养基的主料，可分为马铃薯培养基、 三 、根据培养基的主料，可分为马铃薯培养基、 玉米粉培养基、胡萝卜培养基、果汁培养基、 玉米粉培养基、胡萝卜培养基、果汁培养基、棉 籽壳培养基、麦粒培养基、木屑培养基、木块培 籽壳培养基、麦粒培养基、木屑培养基、 养基、粪草培养基等。 养基、粪草培养基等。
发酵菌种的保藏方法
发酵菌种的保藏方法发酵菌种是用于生产发酵食品和其他生物工艺的重要微生物资源，对于其保藏和长期保存非常关键。
下面将介绍几种常见的发酵菌种保藏方法。
一、冷冻保存法冷冻保存法是最常用的发酵菌种保存方法之一、其步骤如下：1.选择菌种：选择菌种时应选择生长良好、菌落形态规整、功效明确的优良菌株。
2.培养菌种：将菌种接种到合适的培养基上，培养到适宜的生长期（一般是最佳菌落时期）。
3. 制作菌种原液：从菌落上取一些脓样物质，加入到保存管中，并加入10%的甘油做菌种的保护剂。
每管约用1-2ml。
4.冷冻保存：菌种原液在-80℃低温冰箱中冷冻保存，也可以使用液氮保存。
冷冻保存法虽然简单易行，但由于菌种原液在冷冻解冻过程中易遭受冻害，导致菌数下降，因此冷冻保存时间一般不宜超过1年。
二、干燥保存法干燥保存法通过将发酵菌种完全干燥保存，以能有效地延长菌种的保存时间。
其步骤如下：1.选择菌种：选择生长良好、菌落形态规整、功效明确的优良菌株。
2.培养菌种：将菌种接种到合适的培养基上，培养到适宜的生长期。
3.干燥处理：将菌落用无菌胶片照射，然后在无菌条件下放置在干燥器中进行干燥处理。
也可以使用无菌纸片将菌落移至无菌试管中干燥。
4.包装保存：将干燥的菌片或菌落保存在无菌试管中或铝箔袋中，密封保存在低温、干燥的地方。
干燥保存法可以保持菌种的长时间活力，但其干燥环境要求较高，一般适用于较耐干燥的菌种。
三、液氮冷冻保存法液氮冷冻保存法是一种极低温保存法。
其步骤如下：1.选择菌种：选择生长良好、菌落形态规整、功效明确的优良菌株。
2.培养菌种：将菌种接种到合适的培养基上，培养到适宜的生长期。
3.菌种分装：将菌液均匀取出，分装到无菌的小试管或容器中，并加入保存剂如甘油等。
4.冷冻保存：将分装好的菌种置于液氮中快速冷冻，用罐盖密封好，存放在液氮罐中进行长期保存。
液氮冷冻保存法是最理想的保存方法之一，菌种可以保存数十年，但存储设备要求较高。
除了以上几种方法，还有其他一些较特殊的保存方法，如低温冷冻干燥保存法、制备本源菌种保存法等，具体选择方法应根据菌种特性和保存目的而定。
菌种保藏的方法
菌种保藏的方法菌种保藏是一种重要的微生物资源保护方式，对于研究、应用和开发微生物具有重要意义。
以下是几种常见的菌种保藏方法及其操作步骤。
一、低温冷冻保藏法低温冷冻是一种常用的微生物保藏方法，适用于大多数真菌、细菌和酵母菌。
其主要原理是将菌株保存在低温下，使其生理活动缓慢，以延长菌种的保藏时间。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备保存液：根据不同菌株的需要，制备适宜的保存液，常用的保存液有甘油、甘露醇等。
4. 菌种保存：将菌株用保鲜膜包裹，放入保存管中，加入保存液，密封保存管。
5. 冷冻保存：将保存管放入低温冰箱或液氮罐中进行冷冻保存。
二、干燥保藏法干燥保藏法是一种简便、经济的保藏方法，适用于真菌、细菌、放线菌等微生物。
其基本原理是将菌种与干燥剂混合，使其水分含量降低，从而实现微生物的休眠状态。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备干燥剂：根据不同菌株的需要，选择合适的干燥剂，如硅胶、氧化钙等。
4. 菌种混合：将菌株与干燥剂按照一定比例混合均匀。
5. 干燥保存：将混合物均匀地散布在无菌培养基上，置于通风干燥的环境中进行保存。
三、冷冻冻干保存法冷冻冻干保存法是一种较为复杂的菌株保藏方法，适用于难保存的微生物，如厌氧菌、放线菌等。
其主要原理是将菌株在低温下冻结干燥，从而保护微生物的活力。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备保存液：根据不同菌株的需要，制备适宜的保存液，如甘油、甘露醇等。
4. 冷冻过程：将菌株加入保存液中，放入冷冻机冷冻至低温（通常为-80℃）。
5. 冻干过程：将冷冻的菌株经过真空排气、结冰降温等步骤进行冻干处理。
生产菌种的培养与保存
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面
(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；
(3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几 度的细胞冻结点(通常为-30℃)；
(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生 相变；
(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；
(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或 气相(-156℃)中 保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于-70℃冰 箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。
种子扩大培养是指将保存在砂土管、 冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入 试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种 子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质 量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子 。
种子扩培的目的
接种量的需要
菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染
(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积 20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧， 则需先用玻璃珠打散；0.5-1ml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专 用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置 于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。
生产中常用菌种的分离、选育和保藏
生产中常用菌种的分离、选育和保藏在生产中，分离、选育和保藏常用菌种是非常重要的步骤，这些菌种可以用于各种不同的应用，如发酵过程中的生物转化、抗生素的生产以及食品工业中的乳酸发酵等。
以下是常用菌种的分离、选育和保藏的基本步骤：1. 分离：分离菌种是指从自然环境中分离出纯种菌株的过程。
首先，需要选择合适的样品来源，如土壤、水样或食品样品等。
然后，将样品进行稀释、接种到固体培养基上，培养出菌落。
最后，从菌落中挑选单一菌株，并进行纯化培养，得到纯种菌株。
2. 选育：选育是指对已有菌种进行进一步培养和筛选，选出优良品系。
在选育过程中，可以根据所需特性进行筛选，如产量高、抗性强或代谢产物优良等。
通过连续传代培养和筛选，可以逐步培育出符合要求的优良品系。
3. 保藏：保藏是为了长期储存和保存已经分离和选育得到的菌种。
常用的保藏方法包括冷冻保存和冷冻干燥等。
冷冻保存是将菌种保存在低温 (-80℃或液氮温度下)，可以长期保存并保持菌株的生物学性状。
而冷冻干燥则是在低温下将菌种先冷冻，然后通过真空蒸发使其脱水，最后用密封容器保存。
冷冻干燥具有长期保存时间和较小的储存体积的优点。
在菌种的分离、选育和保藏过程中，需要注意的是严格遵守无菌操作规范，以防止杂菌污染。
另外，应该建立相应的菌种信息管理系统，记录并标注每个菌株的来源、特性以及保藏条件等重要信息，以便日后使用和查询。
菌种的分离、选育和保藏在生产中扮演着极其重要的角色。
下面将进一步探讨这些过程，并介绍一些常用的菌种及其应用领域。
在分离菌种的过程中，重要的是选择适当的样品来源。
不同的环境中存在着各种微生物，如土壤、水体、植物、动物及其制品等。
通过采集不同来源的样品，可以获得不同类型和特性的微生物，从而得到多样性的菌株资源。
在接种前，样品经过稀释，使微生物适当分散。
然后将稀释液均匀接种于固体培养基上，并进行孵育。
在培养过程中，微生物通过分裂繁殖形成菌落，而每个菌落代表一个菌株。
菌种的选育与保藏
菌种的选育与保藏微生物菌种选育与保藏本章知识概要第一节菌种分离与筛选第二节菌种选育第三节菌种保藏第一节菌种分离与筛选1、采样原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。
可寻找已适应各种环境压力的微生物类群。
土壤、水、空气、动植物体都含有微生物。
土壤由于具备了微生物所需要的营养、水分、空气。
是微生物最集中的地方从土壤中几乎可以分离所需要任何菌株。
细菌（108）＞放线菌（107）＞霉菌（106）＞酵母菌（105）＞藻类（104）＞原生动物（103）②采样方法：选择适当地点和场所、用无菌器皿取样十克，装入袋中，记录采样地点、时间、环境等等。
2、富集培养：在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，是目的微生物在最适的环境下，迅速生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离到所需要的菌株。
A：控制营养条件----纤维素酶产生菌B：控制培养条件----施加压力、pH、温度、氧气、根据特殊生理特征、C：添加特殊抑制剂---抗生素3、纯种分离：富集培养而得到微生物，并不能达到纯化标准，杂菌并没有死亡、还需要进一步纯化----纯培养粗放型：菌落纯精细型：菌种纯划线分离法A：粗放型涂布分离法稀释分离法平板划线分离法：接种针挑取含有微生物样品，在固体培养基表面上划线，适当条件培养后，挑取单菌落。
稀释分离法用1ml无菌吸管精确地吸取1ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，使其混合均匀。
另取一支吸管自10-1试管吸1ml放入10-2试管中……其余依次类推。
涂布分离法用涂棒蘸取培养液，在固体培养基表面均匀涂平，获得单菌落。
精细型：毛细管分离法：利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。
也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。
流式细胞仪：流式细胞仪（Flow CytoMeter, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析和检测、筛选技术。
微生物的菌种保藏
培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培
养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，
垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。
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• 菌种保藏方法
微 生
3.砂土管保藏法
物
将砂与土分别洗净、烘干、过筛，
的 菌 种
装于小试管中，砂土的高度约1cm， 121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3
保 藏
次。50℃烘干后经检查无误后备用。 将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子
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斜面低温保藏法操作步骤
1.斜面低温保藏法 2.固体穿刺保藏法 3.液体石蜡保藏法 4.沙土管保藏法 5.甘油保藏法
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• 菌种保藏方法操作步骤
微
生
1.斜面低温保藏法
物 的 菌
（1）贴标签 将注有菌株名称和日期的标签贴于试管斜面的正下方。 （2）接种 将待保藏的菌种用斜面接种法移接至注明菌名的试管
悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也
可直接刮下孢子与载体混匀，而后置
于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰
熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥
器中，在室温或4℃冰箱内保藏。
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• 菌种保藏方法
微
生 物 的
4.甘油悬液保藏法 此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本
菌 种 保
法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用－20℃， 保藏期约为0.5～1年，而采用－70℃，保藏期可达10年。
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• 菌种保藏方法
微
生 物 的
1.斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长
菌 种 保
完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定 时间再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保
菌种的传代、保藏及菌液的制备
菌种的传代、保藏及菌液制备标准菌种的概念及其管理§§检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中菌种的名称§生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］§白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］§微生物菌种的使用、保存与管理、验证。
§一.制定菌种使用保藏管理程序§§标准菌种的保藏形式培养基的选择§菌种的传代§§§菌种的接种菌种的复苏《的传代次数不得超过从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第严格控制菌种的传代§1.复溶菌种并转种按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代）2.鉴定菌种后制甘油冷冻管后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管面，工作用菌种（为第三代）§3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于试验§保存管（第三代）斜面养基适当温度培养后作为工作用菌种（第三代）§将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。
§当工作用用菌种代数小于上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三代）可直接§转接第四代，直至四代转为五代。
菌种保藏标签的规范与要求菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标签必须字迹清晰可见，应注明：称，系列号旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必处理掉处理过程应记录。
严格菌种的质量控制，确保菌种的质量菌种的质量对检验至关重要，对实验式储备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种进行纯度和属性确认外，还应对每一次传代都进行确认的质量控制系统。
因为微生物菌种从上一代传到下一代时，很可能发生污染或变异，因此每次传代中至少要对菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实验。
发酵工程第2章2 菌种的选育与保藏
2.3传代保藏
将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的 生长温度下生长和保存的传代保藏方法。
可用于实验室中若干菌种的保藏。 此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。 但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。
2.3 传代培养法
实验原理：保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于 厌氧细菌）培养好后，置4C˚冰箱中存放，定期 进行传代培养、再存放。 可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体 石蜡来进一步延长保存期。
冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常 用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等。
大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久 而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻 保藏，便于运输。
培养物的冻干过程
冷冻真空干燥操作流程
配制保护剂 灭菌
菌种 培养 制备菌悬液
分装安培瓶 预冻
真空干燥 测定水分
操作方法 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，
用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置 4C˚冰箱中包藏。
保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保 存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月， 假单胞菌两周传代一次。
此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易 被污染。
加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的 稳定性。
在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检 测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。
成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括：在 保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单 位)、细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征 应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中 试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极 为重要。
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所属分类地位：子囊菌纲
15
4.担孢子(basidiospore)
有性结构及其形态特征： 担子菌所特有，经两性细 胞核配合后产生的外生孢 子。因着生在担子上而得 名。 所属分类地位：担子菌纲
三、放线菌的生长繁殖
5
1、放线菌的形态构造
★由分枝状菌丝组成。菌丝无隔膜，仍属单细 胞。菌丝直径与杆菌相似（1 m左右）；细 胞壁含磷壁酸、二氨基庚二酸，不含几丁质、 纤维素；革兰氏阴性。
★菌丝根据形态和功能不同可
分为：
基内菌丝(Substrate
mycelium）
气生菌丝(Aerial mycelium)
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2. 接合孢子（zygospore):
有性结构及其形态特征： 是 由菌丝生出的结构大小相似、 形态相同或略有不同两个配 子囊接合后发育而成。 所属分类地位：接合菌纲
接合孢子形成过程:
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3.子囊孢子（ascospore):
有性结构及其形态特征：在子囊中形成。
子囊：两性细胞接触以后形成的囊状结构。子囊的形成有两种方 式：
群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
3
二、细菌的繁殖
方式
无性繁殖 有性繁殖
一般为无性繁殖，二分裂法。
➢ 同形裂殖：裂殖后形成的子细 胞大小相等。
➢ 异形裂殖：分裂产生两个大小 不等的子细胞。
细菌分裂过程：
➢ ①菌体伸长，核质体分裂 ➢ ②形成横隔壁 ➢ ③子细胞分离
☆少数有菌毛的菌可进行有性繁殖
4
孢子丝(Reproductive
mycelium)
6
2、放线菌的繁殖方式
放 线菌的繁殖
无 性孢子（主要）
菌 丝片段
分生孢子
孢子囊孢子
横隔分裂 缩缢分裂
7
繁 殖方式
四
霉
孢子
菌 丝片段
菌
的
有性孢子
无性孢子
繁
殖
卵孢子
孢囊孢子
方
接合孢子
分生孢子
式
子囊孢子
节孢子
担孢子
后垣孢子
8
1.孢囊孢子 （sporangiospore）
发育——从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、 从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。
个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原 生质与细胞组分的增加为个体生长。
群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度 或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来 反映个体生长的状况）个体生长个体繁殖 群体生长
)：
形成特征：形成于菌丝的特化结 构——孢子囊内。
孢子形态：近圆形。
举例：根霉、毛霉。
9
2.分生孢子(Canidinm):
形成特征：由分生孢子梗顶端细胞特化而成的单个 或簇生的孢子。 孢子形态：极多样。 举例：曲霉、青霉。
10
3.节孢子(arthrospore，又称粉孢子)
形成特征：由菌丝断 裂而成。 孢子形态：常呈成串 短柱状。 举例：白地霉。
11
4.厚垣孢子（Chlamydospore)
形成特征：部分菌丝细胞 质浓缩、变圆，周围生出 厚壁而成。 孢子形态：圆形、柱形等。 举例：总状毛霉。
厚垣孢子
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1. 卵孢子（oospore)
有性结构及其形态特 征：由大小不同的配 子囊结合后发育而成。 小配子囊称雄器；大 配子囊称藏卵器。 所属分类地位：卵菌 纲。
16
五、微生物生长的测定方法
描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况， 需选用不同的测定指标。 （一）微生物细胞数目的检测法 直接法（血球计数板、比例计数法） 间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法） （二）微生物生长量和生理指标测定法 直接法(干重法，堆体积法) 间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）
第五章菌种的制备和保藏
•
•
•
授课教师 贺立虎
1
第一节 微生物的生长繁殖
2
一、生长与繁殖的概念
生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用> 异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。
繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命 个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。
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2.血球计数板法
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3.比浊法
原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成 正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因 此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光 密度，就可反应出菌液的浓度。
特点：快速、简便；但易受干扰。
21
4.平板菌落计数法
★A standard plate count (viable count) reflects the number of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony; plate counts are reported as number of colony-forming units (CFU) per ml (CFU/ml) or per g (CFU/g) of sample.
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1.涂片染色法
应用：可同时计数不同微生物的菌数，适 于土壤、牛奶中细菌计数。
方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取 0.01ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代 入公式：
每ml原菌液含菌数 = 视野中平均菌数×涂布面积/视野面积×100 ×稀释倍数
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2.血球计数板法
原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从 中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目， 换算成单位体积中的细胞数。 适用范围：于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞 太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出 油镜工作距离。 特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在 菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。
★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完 成操作），严格无菌操作； ★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀 处理，倾注平板时的培养基温度； ★适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生 长的微生物， ★误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于 样品内菌体分布不均匀、以及不当操作