外源蛋白表达简介ppt课件
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《外源基因的表达》PPT课件
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
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3
原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下特点：
（1）大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制， 可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。
（2）基因组结构简单，便于基因操作和分析。
（3）多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于 构建相应的表达载体。
一、启动子
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合
酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。
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5
1. 原核生物的启动子
原核生物的启动子一般由四个部分构成：转录 起始位点、两个六联体保守序列区和间隔区。
识别区 Pribnow框 转录起点
16～19bp
5～9bp
5’ TTGACA TATAAT A（G） 3’
RNA … NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH
精选ppt
14
N
N
N
N
C
GC
CG C G RNA结构
GC
CG
GC
AU
AU
……NNNN UUUU-OH3
图： 强终止子模式图
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三、SD序列:
mRNA的翻译起始效率主要由其5’端的结构序列 所决定，称为核糖体结合位点（RBS），它包括下列 四个特征要素：
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（3）Sextama框: 在转录启动区的另一个六联体 保守序列位于距转录起始位点上游35bp处，通常称 为-35区，该保守序列为TTGACA，其中前三个碱 基具有较强的保守性，它是RNA聚合酶的识别位点。
（4）间隔区: 原核生物启动子在转录起始位点与 Pribnow框之间、Pribnow框与Sextama框之间存在 长度不等的间隔序列。间隔序列内部无明显的保守 性，其序列的碱基组成对启动子的功能并不十分重 要, 但间隔序列的长度却是影响启动子功能的重要 因素。
精选ppt
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原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下特点：
（1）大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制， 可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。
（2）基因组结构简单，便于基因操作和分析。
（3）多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于 构建相应的表达载体。
一、启动子
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合
酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。
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1. 原核生物的启动子
原核生物的启动子一般由四个部分构成：转录 起始位点、两个六联体保守序列区和间隔区。
识别区 Pribnow框 转录起点
16～19bp
5～9bp
5’ TTGACA TATAAT A（G） 3’
RNA … NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH
精选ppt
14
N
N
N
N
C
GC
CG C G RNA结构
GC
CG
GC
AU
AU
……NNNN UUUU-OH3
图： 强终止子模式图
精选ppt
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三、SD序列:
mRNA的翻译起始效率主要由其5’端的结构序列 所决定，称为核糖体结合位点（RBS），它包括下列 四个特征要素：
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7
（3）Sextama框: 在转录启动区的另一个六联体 保守序列位于距转录起始位点上游35bp处，通常称 为-35区，该保守序列为TTGACA，其中前三个碱 基具有较强的保守性，它是RNA聚合酶的识别位点。
（4）间隔区: 原核生物启动子在转录起始位点与 Pribnow框之间、Pribnow框与Sextama框之间存在 长度不等的间隔序列。间隔序列内部无明显的保守 性，其序列的碱基组成对启动子的功能并不十分重 要, 但间隔序列的长度却是影响启动子功能的重要 因素。
蛋白表达概述ppt课件
增加可溶性和折叠；稀有密码子；毒性基因及质粒稳定性；其他因素。
在许多应用中需要目的蛋白以可溶及活性形式存在(蛋白可溶并不意味着蛋白正确折叠)。载体、宿主菌、蛋白序列和培养条件都会降低或升高蛋白可溶/不溶形式的比例。在通常情况下，降低蛋白合成速率，如降低诱导剂浓度，降低诱导培养温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可溶性增加。温度：37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温(15-20℃)延长诱导时间（过夜）可以使溶解性蛋白的产量达到最大。裂解缓冲液的性质会大大影响到目的蛋白可溶与不溶形式之间的比例。当采用一般的裂解缓冲液如1×His Bind Binding 缓冲液（包括500mM NaCl）时，一些包含疏水或膜相关结构域的蛋白可能被归于不溶部分。在裂解缓冲液中加入毫摩尔的非离子型或双性去污剂可以将由于与细菌脂或膜结合而不溶的蛋白组分转变成可溶组分。包含高电荷结构域的目的蛋白可能与其他一些细胞元件关联（如可能与DNA 结合）。在这种情况下目标蛋白可能与细胞残余在一起，理论上可以在裂解缓冲液中加入盐或用Benzonase 核酸酶消化核酸来解决这类问题。Trx•Tag、GST•Tag和Nus•Tag融合标签都是高度可溶的多肽，可增加目的蛋白的溶解性。许多蛋白需要形成二硫键才得以正确折叠并产生活性，Rosetta-gami菌株不仅是硫氧还蛋白还原酶(trxB)突变体，还是谷胱甘肽还原酶（gor）突变体，这进一步增强了二硫键的形成。如果目的蛋白中含有一个或更多的关键二硫键，pET-32a-c(+)载体与Rosetta-gami菌株的组合可能是最佳的选择。
不同的克隆策略、对限制性酶切位点及阅读框的不同要求，会影响对载体的选择。许多pET 载体具有同样的限制性酶切位点，那么可以仅准备一次目的插入片段，将其插入到多个载体中。不同的要求可以考虑采用不同的PCR 克隆策略。
最新外源基因的原核表达PPT课件
mRNA 的翻译才能进行
ATG 与 SD 序列之间的碱基组成为 A，
T 碱基丰富时，mRNA 翻译效率较高。
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核糖体结合位点本身和附近的序列决定 了目标基因 mRNA 5’ 端的二级结构，研 究表明讨 mRNA 5’端形成的 “茎环” 结 构阻碍了 mRNA 与核糖体 30S 亚基的结 合，从而抑制了翻译的起始。
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大肠杆菌基因表达载体
6、密码子：密码子有简并性，多个 密码子为一个氨基酸进行编码，不 同生物在利用这些密码子时其利用 频率不同，不同的密码子会影响到 大肠杆菌的翻译速度。
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基因表达的机制
基因工程技术的核心是基因表达技术。 迄今为止，已构件建了不同类型的表达 系统，可根据需要合理地选择适当的表 达系统。
外源基因在受体细胞中的表达包括：
1、转录 2、翻译
两个环节
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基因表达的机制
基因工程的核心问题：有效表达 外源基因表达的关键步骤：起始转录 基因表达的限速步骤：转录起始的速率 构建表达系统时首先要考虑的问题是： 1、选择可调控的启动子 2、相关的调控序列
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在进行融合表达时，一般将受体菌 蛋白位于N端，而外源蛋白位于C端。 外源蛋白与菌体自身蛋白以融合蛋 白的方式表达后其稳定性大大增加。 其原因为：外源小分子蛋白上的酶
切位点暴露于分子的表面。当以融 合蛋白的形式表达后，外源蛋白部 分在菌体自身蛋白的引导下正确折 叠，可最大程度上封闭酶切位点。
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常见的大肠杆菌表达系统
基因工程II-外源基因的表达(ppt62)(1)
复性与重折叠 ：
● 主要任务： 通过次级键的形成使蛋白质复性 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
复性与重折叠 ： ● 复 性：
分段稀释法 一步稀释法 试剂添加法 蛋白修饰法 产物隔离法 分子伴侣法
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
复性与重折叠 ： ● 二硫键形成
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
劣势
缺乏蛋白质的复性功能 缺乏蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解异源蛋白 胞内含多种内毒素
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因高效表达的原理
◆ 启动子
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
包涵体的溶解与变性 ： ● 主要任务：拆开错配的二硫键和次级键
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
溶解与变性 ：
清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸
● 试剂和条件：
促溶剂 盐酸胍、尿素 混合溶剂
极端pH
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 密码子
密码子偏爱性： 密码子偏爱性对外源基因表达的影响：
策略
外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中的表达形式
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达
化学氧化法 二硫键交换法
● 主要任务： 通过次级键的形成使蛋白质复性 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
复性与重折叠 ： ● 复 性：
分段稀释法 一步稀释法 试剂添加法 蛋白修饰法 产物隔离法 分子伴侣法
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
复性与重折叠 ： ● 二硫键形成
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
劣势
缺乏蛋白质的复性功能 缺乏蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解异源蛋白 胞内含多种内毒素
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因高效表达的原理
◆ 启动子
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
包涵体的溶解与变性 ： ● 主要任务：拆开错配的二硫键和次级键
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
溶解与变性 ：
清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸
● 试剂和条件：
促溶剂 盐酸胍、尿素 混合溶剂
极端pH
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 密码子
密码子偏爱性： 密码子偏爱性对外源基因表达的影响：
策略
外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中的表达形式
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达
化学氧化法 二硫键交换法
蛋白质表达系统 ppt课件
蛋白质表达系统
哺乳动物表达系统
哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的 感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时 间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源 基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出 目的蛋白。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、 增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。
根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、 稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达 载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目 的蛋白的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周 期短。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载 体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由 于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。 诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以 开放。采用异源启动子、增强子和可扩增的遗传标记，可提高 蛋白产量。
蛋白质表达系统
酵母蛋白表达系统
代表：甲醇毕赤酵母 优点：表达量高，可诱导，糖基化机制
接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化， 易实现高密发酵 缺点：部分蛋白产物易降解，表达量不 可控
蛋白质表达系统
昆虫表达系统
昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数 高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。 昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。 利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载 体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具 有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化 及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；其 最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；可表达非常大的外 源性基因(一200kD)；具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达 多个外源基因的能力；对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体 蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在 此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。。常用的杆状病毒 包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕型多角体病 毒(BmNPV)，常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞，用 于表达外源基因的质粒来源于PUC系列，其含有一个多克隆 位点和多角体蛋白启动子。
哺乳动物表达系统
哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的 感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时 间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源 基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出 目的蛋白。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、 增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。
根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、 稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达 载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目 的蛋白的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周 期短。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载 体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由 于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。 诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以 开放。采用异源启动子、增强子和可扩增的遗传标记，可提高 蛋白产量。
蛋白质表达系统
酵母蛋白表达系统
代表：甲醇毕赤酵母 优点：表达量高，可诱导，糖基化机制
接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化， 易实现高密发酵 缺点：部分蛋白产物易降解，表达量不 可控
蛋白质表达系统
昆虫表达系统
昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数 高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。 昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。 利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载 体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具 有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化 及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；其 最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；可表达非常大的外 源性基因(一200kD)；具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达 多个外源基因的能力；对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体 蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在 此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。。常用的杆状病毒 包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕型多角体病 毒(BmNPV)，常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞，用 于表达外源基因的质粒来源于PUC系列，其含有一个多克隆 位点和多角体蛋白启动子。
基因工程-外源基因的表达培训课件
结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表 达不可缺少的重要调控序列。没有启动子， 基因就不能转录。
原核生物启动子是由两段彼此分开且又 高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成 极为重要。
Pribnow盒，位于转录起始位点上游5～
10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，
故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，
②原核生物的表达是以操纵子为单位的。 操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的 结合，是一个基因表达的协同单位。调控区 主要分为三个部分：操纵子(operator)、启动 子 (promotor)及其他有调控功能的部位。
③由于原核生物无核膜，所以转录与翻 译是偶联的，也是连续进行的。原核生物染 色体DNA是裸露的环形DNA，转录成mRNA 后，可直接在胞浆中与核糖体结合翻译形成 蛋白质。
(2)trp启动子 trp启动子可从大肠杆菌的 色氨酸操纵子中分离。色氨酸操纵子结 构基因排列及其表达如图8-3所示。
(3)PL和PR启动子 PL和PR 启动子是指从 λ噬菌体中得到的一类启动子，它比lac 启动子活性高8-10倍。 λ噬菌体有自己 的一套阻遏物-操纵基因系统(图8-4)。
利用基因工程技术将真核基因转至原核生物 中，由于原核生物繁殖速度快，因此一些用 传统和常规方法不能或难以大量生产的有生 理活性的蛋白，如果采用“工程菌”来生产 就方便得多。例如生长激素释放抑制因子从 50万只羊脑中仅能提取出5mg，而现在用10L 的工程菌液即能提出来。用720kg猪胰脏只能 够提取出100mg胰岛素，而用2000L工程菌发 酵液即可得到同样量的胰岛素。从这些例子 中可以看到基因工程在应用方面的巨大潜力。
基就从最左边的识别位点上解离下来。
ห้องสมุดไป่ตู้
原核生物启动子是由两段彼此分开且又 高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成 极为重要。
Pribnow盒，位于转录起始位点上游5～
10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，
故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，
②原核生物的表达是以操纵子为单位的。 操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的 结合，是一个基因表达的协同单位。调控区 主要分为三个部分：操纵子(operator)、启动 子 (promotor)及其他有调控功能的部位。
③由于原核生物无核膜，所以转录与翻 译是偶联的，也是连续进行的。原核生物染 色体DNA是裸露的环形DNA，转录成mRNA 后，可直接在胞浆中与核糖体结合翻译形成 蛋白质。
(2)trp启动子 trp启动子可从大肠杆菌的 色氨酸操纵子中分离。色氨酸操纵子结 构基因排列及其表达如图8-3所示。
(3)PL和PR启动子 PL和PR 启动子是指从 λ噬菌体中得到的一类启动子，它比lac 启动子活性高8-10倍。 λ噬菌体有自己 的一套阻遏物-操纵基因系统(图8-4)。
利用基因工程技术将真核基因转至原核生物 中，由于原核生物繁殖速度快，因此一些用 传统和常规方法不能或难以大量生产的有生 理活性的蛋白，如果采用“工程菌”来生产 就方便得多。例如生长激素释放抑制因子从 50万只羊脑中仅能提取出5mg，而现在用10L 的工程菌液即能提出来。用720kg猪胰脏只能 够提取出100mg胰岛素，而用2000L工程菌发 酵液即可得到同样量的胰岛素。从这些例子 中可以看到基因工程在应用方面的巨大潜力。
基就从最左边的识别位点上解离下来。
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蛋白质表达PPT课件
利用蛋白质表达技术，可以调控特定蛋白质的表达，为生 物治疗提供新的策略和方法，如基因治疗、细胞治疗等。
提高蛋白质表达产量的方法与策略
01
优化基因序列
通过优化目的基因的序列，如提高启动子活性、调整密码子使用等，可
以提高蛋白质的表达水平。
02
宿主细胞选择与改造
选择合适的宿主细胞，并进行必要的改造，如细胞代谢途径的优化、细
蛋白质降解
通过细胞内的蛋白酶体系统降解蛋白 质，调节细胞内蛋白质的平衡和功能。
02
蛋白质表达系统
原核表达系统
表达量高
原核表达系统如大肠杆菌表达 系统能够高效表达外源基因，
产生大量的重组蛋白质。
操作简便
原核表达系统相对简单，遗传 背景和培养条件较明确，便于 实验操作和基因工程改造。
表达产物易纯化
原核表达产物通常以可溶性或 包涵体的形式存在，易于分离 和纯化。
酵母表达系统在工业生产中具有一定的应 用价值，可以用于生产酶制剂、生物材料 等。
培养基廉价易得
表达量不稳定
酵母菌可以在相对简单的培养基中生长繁 殖，降低了生产成本。
酵母表达系统的表达量可能受到多种因素 的影响，如基因拷贝数、整合位点等，导 致表达量不稳定。
昆虫表达系统
高效表达外源基因
昆虫表达系统如杆状病毒表达系统能够 高效侵染昆虫细胞，并在短时间内获得
基因转染技术
基因转染技术是一种将外源DNA或RNA导入细胞的技术。通 过基因转染技术，可以将目的基因导入到细胞中，实现目的 基因的表达。
基因转染技术是蛋白质表达的重要手段之一，通过基因转染 技术可以将目的基因导入到各种类型的细胞中，如原代细胞 、干细胞、肿瘤细胞等，实现目的基因的表达和功能研究。
提高蛋白质表达产量的方法与策略
01
优化基因序列
通过优化目的基因的序列，如提高启动子活性、调整密码子使用等，可
以提高蛋白质的表达水平。
02
宿主细胞选择与改造
选择合适的宿主细胞，并进行必要的改造，如细胞代谢途径的优化、细
蛋白质降解
通过细胞内的蛋白酶体系统降解蛋白 质，调节细胞内蛋白质的平衡和功能。
02
蛋白质表达系统
原核表达系统
表达量高
原核表达系统如大肠杆菌表达 系统能够高效表达外源基因，
产生大量的重组蛋白质。
操作简便
原核表达系统相对简单，遗传 背景和培养条件较明确，便于 实验操作和基因工程改造。
表达产物易纯化
原核表达产物通常以可溶性或 包涵体的形式存在，易于分离 和纯化。
酵母表达系统在工业生产中具有一定的应 用价值，可以用于生产酶制剂、生物材料 等。
培养基廉价易得
表达量不稳定
酵母菌可以在相对简单的培养基中生长繁 殖，降低了生产成本。
酵母表达系统的表达量可能受到多种因素 的影响，如基因拷贝数、整合位点等，导 致表达量不稳定。
昆虫表达系统
高效表达外源基因
昆虫表达系统如杆状病毒表达系统能够 高效侵染昆虫细胞，并在短时间内获得
基因转染技术
基因转染技术是一种将外源DNA或RNA导入细胞的技术。通 过基因转染技术，可以将目的基因导入到细胞中，实现目的 基因的表达。
基因转染技术是蛋白质表达的重要手段之一，通过基因转染 技术可以将目的基因导入到各种类型的细胞中，如原代细胞 、干细胞、肿瘤细胞等，实现目的基因的表达和功能研究。
外源基因的表达2精品PPT课件
❖T A A T G T ❖T T A A C T ❖T A T A A T ❖T A T A A T
a) 大肠杆菌的lac启动子
乳糖启动子Plac的可控性：
基底水平转录 阻遏蛋白
野生型的Plac与其控制区Olac
偶联在一起，在没有诱导物
P
存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅
RNA聚合酶保护区 结构基因
5
3
3
5
5
3
-50 -40 -30 -20 -10 1 10
3
5-35 区Biblioteka TTGACA AACTGT
RNA-pol辨认位点 (recognition site)
开始转录 -10 区
T A T A A T Pu A T A T T A Py
(Pribnow box)
原核生物启动子保守序列
❖ T7噬菌体启动子
② 终止子
❖ 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过 头现象，即RNA聚合酶继续转录质粒上邻近的DNA 序列；
❖ 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工 程菌无谓的能量消耗；
❖ 终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终 止信号的DNA序列。
❖ 两类终止子 使用不依赖ρ因子的终止子
❖ 启动子
❖ -35 区序列
❖ -10 区序列
❖ PlL
❖T T G A C A
❖ PtraA ❖ Ptrp ❖ Plac ❖ Ptac
❖T A G A C A ❖T T G A C A ❖T T T A C A ❖T T G A C A
❖ Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
a) 大肠杆菌的lac启动子
乳糖启动子Plac的可控性：
基底水平转录 阻遏蛋白
野生型的Plac与其控制区Olac
偶联在一起，在没有诱导物
P
存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅
RNA聚合酶保护区 结构基因
5
3
3
5
5
3
-50 -40 -30 -20 -10 1 10
3
5-35 区Biblioteka TTGACA AACTGT
RNA-pol辨认位点 (recognition site)
开始转录 -10 区
T A T A A T Pu A T A T T A Py
(Pribnow box)
原核生物启动子保守序列
❖ T7噬菌体启动子
② 终止子
❖ 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过 头现象，即RNA聚合酶继续转录质粒上邻近的DNA 序列；
❖ 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工 程菌无谓的能量消耗；
❖ 终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终 止信号的DNA序列。
❖ 两类终止子 使用不依赖ρ因子的终止子
❖ 启动子
❖ -35 区序列
❖ -10 区序列
❖ PlL
❖T T G A C A
❖ PtraA ❖ Ptrp ❖ Plac ❖ Ptac
❖T A G A C A ❖T T G A C A ❖T T T A C A ❖T T G A C A
❖ Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
外源蛋白表达简介
二、杂交瘤技术的基本原理
单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗源免
疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能象 骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异 性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。
杂交瘤细胞的制备
（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基
骨髓瘤细胞选择
动物乳腺组织
• 分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白 质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特 别适合药用蛋白的生产；
• 转基因动物制作花费巨大，实验周期长
哺乳动物细胞表达系统
• 指导蛋白质正确折叠； 提供正确的多种翻译后加工功能； 表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能 方面最接近天然的高等生物蛋白质分子； • 可进行分泌表达 • 表达量不够高，培养成本较高
其
他
乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis)
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
• 可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修 饰功能；可进行染色体整合型基因表达; • 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓 度高; • 商品化表达体系： 酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）; 毕氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）
（四）细胞准备
（1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，计数活力细胞(不少于90％)； （2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，并计细胞数和测定活力细胞；
外源蛋白表达简介ppt课件
• 分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结 构； • 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性 高，重组蛋白易受蛋白酶的水解； • 质粒不稳定，尚无商品化的表达载体
其
他
乳酸菌 Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis)
基因表达体系
1. 原核体系 2. 真核体系
大肠杆菌 (Escherichia coli)
• 遗传背景清楚，基因工程操作方便，商 品化表达载体种类齐全，表达效率高； • 不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、 缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分 泌机制和充分形成二硫键的能力。
枯草杆菌 (Bacillus subtilis)
(4)离心(800转／分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；
(5)取96孔板，每孔加50l； (6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50P1； (7)送入5％CO2，温箱中37℃培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。
（六）融合后细胞培养
(1)融合后7—10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的) 后每隔2—3天 半量换液一次；
昆虫细胞
• 可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在 体外培养细胞SF-9中生产蛋白; • 适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰； • 糖链有所区别，表达量有限； • 作为药物宿主细胞未被FDA认可
植物组织
• 植物可大面积种植，可以廉价大规模生产； • 转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难 控制； • 表达量较难提高，分离纯化不方便
• 制备原理 要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体 的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体 外生 长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖 ，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞(次黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型)与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种 细胞继承两种亲 代细胞的特性，它既具有B淋巴细 胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外 培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞 培养增殖的细胞群，可制备抗 一种抗原决定簇的特 异单克隆抗体。
其
他
乳酸菌 Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis)
基因表达体系
1. 原核体系 2. 真核体系
大肠杆菌 (Escherichia coli)
• 遗传背景清楚，基因工程操作方便，商 品化表达载体种类齐全，表达效率高； • 不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、 缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分 泌机制和充分形成二硫键的能力。
枯草杆菌 (Bacillus subtilis)
(4)离心(800转／分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；
(5)取96孔板，每孔加50l； (6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50P1； (7)送入5％CO2，温箱中37℃培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。
（六）融合后细胞培养
(1)融合后7—10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的) 后每隔2—3天 半量换液一次；
昆虫细胞
• 可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在 体外培养细胞SF-9中生产蛋白; • 适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰； • 糖链有所区别，表达量有限； • 作为药物宿主细胞未被FDA认可
植物组织
• 植物可大面积种植，可以廉价大规模生产； • 转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难 控制； • 表达量较难提高，分离纯化不方便
• 制备原理 要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体 的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体 外生 长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖 ，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞(次黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型)与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种 细胞继承两种亲 代细胞的特性，它既具有B淋巴细 胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外 培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞 培养增殖的细胞群，可制备抗 一种抗原决定簇的特 异单克隆抗体。
蛋白表达及纯化ppt课件
蛋白表达及纯化
Part 1: 蛋白表达、纯化
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA
2. 表达宿主
3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
Host
Cellfree Bacteri al
Yeas t
Mammalia n
0.60 0.50 0.40
Protein preparation, extraction, clarification
Cell growth, protein overexpression Cell lysis Removal of cell debris
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。 b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。 c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。
pET system manual, Novagen, 11th Edition
X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化
1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L； 4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L； 7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。 图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化
1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG 诱导表达 0、1、 2、3、4、6、8、12 h。
Part 1: 蛋白表达、纯化
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA
2. 表达宿主
3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
Host
Cellfree Bacteri al
Yeas t
Mammalia n
0.60 0.50 0.40
Protein preparation, extraction, clarification
Cell growth, protein overexpression Cell lysis Removal of cell debris
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。 b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。 c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。
pET system manual, Novagen, 11th Edition
X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化
1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L； 4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L； 7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。 图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化
1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG 诱导表达 0、1、 2、3、4、6、8、12 h。
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• 制备原理 要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体 的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体 外生 长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖 ，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞(次黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型)与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种 细胞继承两种亲 代细胞的特性，它既具有B淋巴细 胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外 培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞 培养增殖的细胞群，可制备抗 一种抗原决定簇的特 异单克隆抗体。
二、杂交瘤技术的基本原理
单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗源免
疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能象 骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异 性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。
杂交瘤细胞的制备
（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基
骨髓瘤细胞选择
（四）细胞准备
（1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，计数活力细胞(不少于90％)； （2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，并计细胞数和测定活力细胞；
（3）按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤
净多余上清。
纸吸
（五）细胞融合
(1)将1ml 40％的PEG液一滴滴加入列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微 转动离心管或用手指轻弹离心管； (2)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完； (3)于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，
动物乳腺组织
• 分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白 质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特 别适合药用蛋白的生产；
• 转基因动Байду номын сангаас制作花费巨大，实验周期长
哺乳动物细胞表达系统
• 指导蛋白质正确折叠； 提供正确的多种翻译后加工功能； 表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能 方面最接近天然的高等生物蛋白质分子； • 可进行分泌表达 • 表达量不够高，培养成本较高
其
他
乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis)
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
• 可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修 饰功能；可进行染色体整合型基因表达; • 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓 度高; • 商品化表达体系： 酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）; 毕氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）
免疫程序是取6—8周龄Balb／C雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强
免疫一次，3—5天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，
要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。 抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为loog，第二次为 50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每 次腹腔注射1×l06一1×107。
•骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体 •次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-） •胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）
选择性培养基-HAT培养基
•次黄嘌呤（hypoxanthine，H）; •氨基喋呤（aminopterin， A）; •胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine， T）
（二）免疫小鼠
外源蛋白表达 简介
外源蛋白质的表达
市场部培训 李丽文 090624
为什么要重组基因表达？
1. 2. 3. 4. 5. 6. 蛋白质功能研究 生物制药和疫苗生产 疾病的基因治疗 食品、化工用酶制剂 抗虫、抗逆植物改良 细胞代谢产物的富集
基因表达体系
1. 原核体系 2. 真核体系
大肠杆菌 (Escherichia coli)
（三）脾细胞的制备
(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；
(2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次；
(3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中； (4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗， 令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养 液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可； (5)把细胞悬液注入50ml离心管中，加l0一20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中 置5分钟； (6)离心(800一1000转／分)计数、备用。
• 遗传背景清楚，基因工程操作方便，商 品化表达载体种类齐全，表达效率高； • 不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、 缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分 泌机制和充分形成二硫键的能力。
枯草杆菌 (Bacillus subtilis)
• 分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结 构； • 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性 高，重组蛋白易受蛋白酶的水解； • 质粒不稳定，尚无商品化的表达载体
昆虫细胞
• 可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在 体外培养细胞SF-9中生产蛋白; • 适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰； • 糖链有所区别，表达量有限； • 作为药物宿主细胞未被FDA认可
植物组织
• 植物可大面积种植，可以廉价大规模生产； • 转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难 控制； • 表达量较难提高，分离纯化不方便
哺乳动物细胞表达外源蛋白
• 单克隆抗体 • 基因工程药物
一、何谓单克隆抗体？
• 基本概念 抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体 的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同 的B淋巴细胞系，含 遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺 激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因 的B细胞。被激活的B 细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克 隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种 抗体。 • 如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得 到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。 • 单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体（ monoclonal antibody,McAb）。