蛋白质纯化方法PPT课件

连 续 电 泳
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几种常用的层析法
吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析
柱层析
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离子交换层析法
此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物， 将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。
蛋 白 质 的
离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素,如 羧甲基纤维素(CM纤维素）等，阴离子交换 纤维素,如二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤 维素）等。
蛋
白
质 的 纯 化
在外加电场作用下，带电的蛋白质颗 粒在电场中移动的速度（v）取决于 电场强度(E)，所带的净电荷(q)，蛋
方 白质的分子量、分子形状以及与介质
法 的摩擦系数(f)。
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几种常用的电泳
纸电泳
醋酸纤维薄膜电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)
(可分为圆盘电泳和垂直平板电泳）
琼脂糖凝胶电泳
可以用适当的配体洗脱液洗脱。
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亲和层析法
常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋 白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼
蛋 脂糖凝胶等。 白 质 的 纯 化 方 法
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蛋白质纯度等的测定
纯度和分子量的测定：采用电泳 （如聚丙烯酰胺凝胶电泳）、分子 筛层析、高速离心、高效液相色谱 等技术测定。
用已知分子量的蛋白质作为标准，则
可以估算出不同蛋白质的分子量。
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等电聚焦
将两性电解质(eg:pH3-9，pH5-7)
同蛋白质样品一起加入到已经灌好
蛋 白 质
的凝胶中，在电场下，两性电解质 首先达到它的等电点而平衡，蛋白
的 质样品根据它自身的等电点分别向
纯 化
两极移动，最后也达到平衡。
方 等电聚焦：这种按等电点的大小，生物
分子筛层析的工作原理
也叫凝胶过滤层析
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亲和层析法
这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理 是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的
蛋 特殊配基具有不同的识别和结合能力。 白 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作 质 用的配基，然后应用化学方法将该配基与载 的 体共价连接。将这种连接有配基的载体装入 纯 层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过 化 层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结 方 合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流 法 出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
等电聚焦(IEF)
双向电泳
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聚丙烯酰胺凝胶电泳法 电影
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)是利用
聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳法，
蛋 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰胺和
白 质 的
交联剂甲叉双丙稀酰胺交联而成的多 孔网状凝胶。
纯 不连续PAGE有分离胶、浓缩胶和样
化 品胶。
方 法
PAGE分辨率很高。
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电泳过程
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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离
子型表面活性剂，它能够与蛋白质多
蛋 肽链中的氨基酸残基按大约1 1.4比 白 例结合。
质 每一个蛋白质分子都因为结合了许多
的 纯 化 方 法
的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白 质分子原有的电荷则可以忽略。该法 主要利用了蛋白质分子量大小不同而 分离蛋白质。
用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或
蛋 聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的
白 内部是多孔的网状结构。
质 的
Sephadex G10-G200(葡聚糖凝胶)
纯 Sepharose2B,4B,6B(琼脂糖凝胶)
化 方
Sephacryl S100,S200,S300,S400
法
(聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶)
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纯 带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强，而
化 带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。
方 用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液
法 进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，
可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。
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离子交换层析法
蛋 白 质 的 纯 化 方 法
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凝胶过滤法
此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所
等电点的测定：利用等电点时溶解 度最低或等电聚焦方法测定。
亚基个数的测定：采用SDS聚丙烯 酰胺凝胶电泳方法测定。
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个人观点供参考，欢迎讨论！
法 分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚
焦的行为称等电聚焦。
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等电聚焦的特点就 在于它利用了一种 称为两性电解质载 体的物质在电场中 构成连续的pH梯度， 使蛋白质或其他具 有两性电解质性质 的样品进行聚焦， 从而达到分离、测 定和鉴定的目的。
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蛋白质双向电泳
银