蛋白表达纯化PPT课件
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蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)
而增加
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
蛋白质的表达纯化.pptx
本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆 菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有 6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白， 该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸 （NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以 提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质 的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
别取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。
第5页/共16页
• 1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。 • 2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。
30%Acr- Tris-HCl H2O
Bis
pH 8.8
5ml
3ml
4ml
10%AP TEMED 120ul 20ul
灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶 面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看 见清晰的界限）
第1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ页/共16页
感谢您的观看！
第16页/共16页
完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容
器。
第13页/共16页
5.将底座的开关打开， 并向外拨动透明的架子， 使中间空隙增大，放入 电极架。
6.如图所示将电极架往下 压（约1~2mm），使底面 完全接触。
第14页/共16页
7.关上底座开关。
8.放入电泳槽内，加上加样 架加样。注意加样架与刚才 制胶所用的梳子齿数必须一 致。
第10页/共16页
注意事项
(1) Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用， 操作时应戴手套和口罩。
(2) 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成 凝胶板与玻璃板之间产生气泡。
(3) 样品槽模板梳齿应平整光滑。 (4) 灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的 通过。 (5) 切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区 带扭曲。 （6）电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过 低都会影响电泳效果。 (7) 稀释5×SDS/电泳缓冲液至1×浓度灌入电泳槽， 需800毫升。
别取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。
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• 1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。 • 2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。
30%Acr- Tris-HCl H2O
Bis
pH 8.8
5ml
3ml
4ml
10%AP TEMED 120ul 20ul
灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶 面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看 见清晰的界限）
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完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容
器。
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5.将底座的开关打开， 并向外拨动透明的架子， 使中间空隙增大，放入 电极架。
6.如图所示将电极架往下 压（约1~2mm），使底面 完全接触。
第14页/共16页
7.关上底座开关。
8.放入电泳槽内，加上加样 架加样。注意加样架与刚才 制胶所用的梳子齿数必须一 致。
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注意事项
(1) Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用， 操作时应戴手套和口罩。
(2) 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成 凝胶板与玻璃板之间产生气泡。
(3) 样品槽模板梳齿应平整光滑。 (4) 灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的 通过。 (5) 切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区 带扭曲。 （6）电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过 低都会影响电泳效果。 (7) 稀释5×SDS/电泳缓冲液至1×浓度灌入电泳槽， 需800毫升。
蛋白表达和纯化课件
Part 1: 蛋白表达、纯化
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA 2. 表达宿主 3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
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E. coli
rapid (30 min) low
high refolding may be
required no
no no no no no low
Yeast
rapid (90 min) low
low – high refolding may be required high mannose
yes yes yes yes no low
c: 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。
d:在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。
e:大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个U而形成四联核苷酸 的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强
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Host
Cell-free
Bacterial
Yeast
Mammalian Insect
Expression System Characteristics 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
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蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA 2. 表达宿主 3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
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E. coli
rapid (30 min) low
high refolding may be
required no
no no no no no low
Yeast
rapid (90 min) low
low – high refolding may be required high mannose
yes yes yes yes no low
c: 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。
d:在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。
e:大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个U而形成四联核苷酸 的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强
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Host
Cell-free
Bacterial
Yeast
Mammalian Insect
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蛋白纯化课件ppt
5. 收集洗脱液并进行检测，确 定蛋白质的纯度和浓度。
6. 对实验结果进行分析和总结 。
实验操作流程
实验前准备
确保实验器材和试剂 的清洁和完好，准备 好实验记录本。
样品处理
将蛋白质样品加入离 心机中进行离心分离 ，收集上清液。
层析分离
使用注射器将上清液 注入层析柱中，根据 蛋白质的性质选择合 适的洗脱液进行洗脱 。
3
食品加工技术优化
研究食品加工过程中蛋白质的变化和作用，优化 加工工艺。
环境监测领域
污染物的生物标志物
纯化特定环境污染物结合的蛋白，作为污染物存在的生物 标志物。
生态毒理学研究
纯化环境中的毒性蛋白，研究其对生态系统的影响和作用 机制。
生态修复与治理
利用纯化的微生物降解酶，研究环境修复和治理的新方法 。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
应用
凝胶过滤法常用于分离纯化蛋白质、 酶、核酸等生物大分子，尤其适用于 分离分子量相近的蛋白质或多肽。
CHAPTER 03
蛋白纯化的步骤
样品准备
样品来源
选择合适的生物样品，如 细胞、组织或培养液，确 保样品中目标蛋白的含量 较高。
细胞破碎
采用物理或化学方法破碎 细胞，释放细胞内的蛋白 质。
去除杂质
通过离心、过滤等方法去 除细胞碎片、颗粒物等杂 质。
粗分离
离心分离
根据蛋白质的密度和大小差异，采用离心法 进行初步分离。
沉淀与溶解
通过调节溶液的pH值、离子强度或添加有机溶剂， 使蛋白质沉淀，再通过溶解将蛋白质重新溶解在适 宜的缓冲液中。
凝胶电泳分离
利用电泳技术将蛋白质在凝胶上进行分离， 根据蛋白质的电荷和大小进行分离。
蛋白质的分离纯化.ppt
logMr
三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 法测定相对分子质量
聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE），也称 圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯 酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而 成）为支持物 。
蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率
决定于它所带的电荷以及分子大小和形状(电 荷效应、分子筛效应)。
v =沉降速度（dx/dt）
s
=
—ω—v2x——
ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的
距离（cm）
沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）
蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系
M = —D—（—1R－—TsV—ρ）—
R—气体常数（8.314×107ergs·mol -1 ·度-1） T—绝对温度 D—扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机 转速很快，则忽略不计） V—蛋白质的微分比容（m3·g-1） ρ—溶剂密度（20℃，g·ml-1） s—沉降系数
二、凝胶过滤法测定相对分子质量
凝胶过滤原理
分子筛色谱 （凝胶过滤）
利用Andrews的实验经验式：
logMr = a/b—Ve/bVo
Ve（elution volume）为某一溶质组分的洗脱 体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰 （峰顶）出现时所流出的体积。
V0 (outer volume)为外水体积，即存在于柱床 中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被 凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖—2000 的洗脱体积可以决定V0。
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质 胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白 质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不 可能再重新溶解于水。
由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性 质的变化，所以又称为变性沉淀。
蛋白表达及纯化PPT课件
萃取法
液-液萃取法
利用两种不混溶的溶剂，将目标蛋白 质从一种溶剂中转移到另一种溶剂中 。
反胶团萃取法
利用反胶团形成的微环境，选择性分 离和纯化蛋白质。
色谱法
凝胶色谱法
利用凝胶介质对不同大小的蛋白质颗粒的分离作用，将目标蛋白质与其他杂质 分离开。
离子交换色谱法
利用离子交换剂对不同带电状态的蛋白质的吸附作用，将其与其他蛋白质分离 开。
亲和层析
利用基因工程改造的蛋白质分 子上的特定标签与固相载体上 的配体结合进行分离纯化。常 用的亲和层析包括His-tag亲 和层析、GST亲和层析等。
离子交换层析和凝胶过滤 层析
与抗体药物的纯化类似，离子 交换层析和凝胶过滤层析也可 用于重组蛋白药物的进一步纯 化和精制。
蛋白质相互作用研究中的纯化应用
02
蛋白纯化方法
沉淀法
盐析法
通过加入高浓度的盐溶 液，改变蛋白质的溶解
度使其沉淀下来。
有机溶剂沉淀法
利用有机溶剂降低蛋白 质溶解度的原理，使其
沉淀。
聚合物沉淀法
利用聚合物与蛋白质的 相互作用，使蛋白质沉
淀。
低温沉淀法
在低温条件下，通过改 变蛋白质的溶解度使其
沉淀。
离心法
差速离心法
通过逐渐增加离心力，将 不同大小的蛋白质颗粒分 离开。
扩展床吸附技术
将大颗粒的介质填充于柱中，使流动相能够通过吸附作用去 除杂质，提高纯化效果。
集成化与自动化技术
集成化分离系统
将多个分离步骤集成在一个系统中， 实现连续的分离纯化，提高生产效率。
自动化控制技术
通过自动化控制系统，实现分离纯化 的全流程监控和自动调节，减少人为 误差和操作时间。
《蛋白表达纯化》课件
基础研究领域
用于解析蛋白质结构与功能、 探究生物过程和疾病机制等。
02
蛋白表达系统
原核表达系统
操作简便
原核表达系统通常在相对较低的 成本和较短的时间内实现蛋白表 达。
高表达量
原核细胞具有较高的繁殖速度， 因此可以快速获得大量的目标蛋 白。
原核表达系统
• 蛋白翻译后修饰少：原核细胞没有真核细胞复杂的翻译后 修饰机制，因此表达的蛋白通常不需要复杂的纯化步骤。
案例三：融合蛋白的表达与纯化
总结词
融合蛋白表达纯化的优势和应用
详细描述
融合蛋白是指将两个或多个蛋白质序列融合在一起形成的单一蛋白质。这种技术常用于 蛋白质标签、蛋白质相互作用研究、抗体药物等领域。融合蛋白的表达纯化具有一定的 复杂性，但通过选择合适的融合伙伴和优化表达纯化条件，可以获得高纯度和稳定性的
实验试剂的储存与使用
实验试剂应按照规定的要求进行储存， 避免因储存不当导致试剂变质或失效。
使用前应仔细核对试剂的名称、浓度、 使用过程中应控制试剂的用量，避免浪
有效期等信息，确保使用正确的试剂。
费和环境污染。
06
案例分析
案例一：重组蛋白的表达与纯化
总结词
重组蛋白表达纯化的基本流程和技术要点
详细描述
重组蛋白表达纯化是生物技术领域中常见的技术手段，主要涉及基因克隆、载体构建、转化、诱导表 达、纯化等步骤。其中，选择合适的载体和宿主细胞、优化表达条件以及纯化方案的制定是关键。
案例二：膜蛋白的表达与纯化
总结词
膜蛋白表达纯化的特殊技术和挑战
详细描述
膜蛋白是一类特殊的蛋白质，它们嵌入细胞膜中，具有跨膜结构域。膜蛋白的表达和纯化相对于可溶性蛋白具有 一定的难度。常用的表达系统包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等。纯化时需考虑保持膜蛋白的天然状态和功能。
蛋白纯化技术简介课件
蛋白纯化技术简介课件CATALOGUE目录•蛋白纯化技术概述•蛋白纯化技术方法•蛋白纯化步骤与流程•蛋白纯化技术挑战与解决方案•蛋白纯化技术展望与发展趋势•蛋白纯化技术案例分析CATALOGUE蛋白纯化技术概述蛋白纯化目的蛋白纯化的定义与目的各种方法基于不同的物理或化学原理，如电荷分布、分子大小、特异性结合等，实现对蛋白质的分离与纯化。
蛋白纯化技术的分类与原理原理分类蛋白纯化技术的应用领域01020304生物化学研究临床诊断制药工业食品工业CATALOGUE蛋白纯化技术方法应用盐析法在蛋白纯化中应用广泛，适用于大多数蛋白质的纯化。
原理盐析法主要是利用蛋白质在低盐浓度时溶解度降低，高盐浓度时溶解度升高的特性，通过在中间盐浓度时加热或静置，使溶解度降低的蛋白质析出。
优缺点盐析法操作简单，成本低，但有时会造成蛋白质的变性，影响其生物活性。
盐析法原理凝胶色谱法主要用于蛋白质分子量的分离和纯化。
应用优缺点原理应用优缺点030201原理应用优缺点电泳法原理应用优缺点膜分离法CATALOGUE蛋白纯化步骤与流程初步分离缓冲液置换细胞破碎粗分离阶段03疏水相互作用色谱01亲和色谱02离子交换色谱精细分离阶段质谱分析HPLC分析SDS-PAGE电泳纯度检测与鉴定阶段CATALOGUE蛋白纯化技术挑战与解决方案1 2 3亲和色谱法离子交换色谱法凝胶过滤色谱法杂蛋白的去除选择合适的纯化方法根据蛋白的性质和纯化要求，选择适合的纯化方法，以尽可能提高目标蛋白的回收率。
优化实验条件对实验条件进行优化，如pH值、温度、离子强度等，以提高目标蛋白的回收率。
多次纯化将纯化过程分为多个步骤，每个步骤针对不同的杂质进行去除，从而提高目标蛋白的回收率。
目标蛋白的回收率添加保护剂避免剧烈操作低温操作蛋白的稳定性与活性保持CATALOGUE蛋白纯化技术展望与发展趋势纳米材料新型介质新材料与技术的发展集成化自动化集成化与自动化技术进步生物药物研发蛋白纯化技术在生物药物研发中具有重要作用。
全式金-蛋白表达与纯化的PPT
原理
促进正确折叠
手段
融合催化二硫键形成酶的标签 选择促二硫键形成的细胞（Origami系列菌株）
分泌表达
融合表达 控制表达水平 “假”包涵体 （疏水区域，膜结合等）
细胞周质表达，胞外分泌
融合溶解性高的标签（GST，MBP） 诱导温度 IPTG浓度 特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶„„）
1
2
1
2
3 Lane 1：37℃
最高 蛋白种类多，需裂解 ≤50% 菌体，复杂 较少 ≤4% 变化 较大 蛋白种类少，需渗透 压休克，相对容易 纯化简单。但机理不 详，成功先例少 适用于疫苗开发、抗 体制备，前景广阔。
表达定位
菌液 离心 菌体 悬菌，渗透压休克 菌体 悬菌，裂解，离心 沉淀 溶解，离心 沉淀 胞质不溶组分 胞质可溶组分 培养基组分 细胞总蛋白 细胞周质组分
严谨调控
稀有密码子
溶解性
Rosetta系列
Origami系列
稀有密码子 不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基 因的mRNA 无法正常在E. coli 里表达，是为“稀有”密码子。
表达条件
• 乳糖操纵子与诱导物
• 常用表达条件的优化
乳糖操纵子与诱导物
• 1980年，Guarante L等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统
原核表达概述 原核表达原理概述 表达载体 表达菌株 表达条件
原核表达原理概述
目的基因
构建
转化
培养，诱导
表达载体
重组载体 表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
表达载体
• 启动子
• 融合标签
• 常用表达载体系统
常见启动子 • λpL启动子： • trp启动子： 热诱导启动子 化学诱导启动子
促进正确折叠
手段
融合催化二硫键形成酶的标签 选择促二硫键形成的细胞（Origami系列菌株）
分泌表达
融合表达 控制表达水平 “假”包涵体 （疏水区域，膜结合等）
细胞周质表达，胞外分泌
融合溶解性高的标签（GST，MBP） 诱导温度 IPTG浓度 特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶„„）
1
2
1
2
3 Lane 1：37℃
最高 蛋白种类多，需裂解 ≤50% 菌体，复杂 较少 ≤4% 变化 较大 蛋白种类少，需渗透 压休克，相对容易 纯化简单。但机理不 详，成功先例少 适用于疫苗开发、抗 体制备，前景广阔。
表达定位
菌液 离心 菌体 悬菌，渗透压休克 菌体 悬菌，裂解，离心 沉淀 溶解，离心 沉淀 胞质不溶组分 胞质可溶组分 培养基组分 细胞总蛋白 细胞周质组分
严谨调控
稀有密码子
溶解性
Rosetta系列
Origami系列
稀有密码子 不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基 因的mRNA 无法正常在E. coli 里表达，是为“稀有”密码子。
表达条件
• 乳糖操纵子与诱导物
• 常用表达条件的优化
乳糖操纵子与诱导物
• 1980年，Guarante L等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统
原核表达概述 原核表达原理概述 表达载体 表达菌株 表达条件
原核表达原理概述
目的基因
构建
转化
培养，诱导
表达载体
重组载体 表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
表达载体
• 启动子
• 融合标签
• 常用表达载体系统
常见启动子 • λpL启动子： • trp启动子： 热诱导启动子 化学诱导启动子
蛋白质纯化技术PPT幻灯片课件
超速离心法 (ultracentrifugation)：~60万 g ， 6万~8万 r/min。可用来测定蛋白质分子 量。
16
• 超速离心
17
1.2分子形状
• 形状
▫ 蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝 胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受 到分子形状的影响。
• 方法
▫ 梯度离心 ▫ 电泳
1
蛋白质的分离纯化与鉴定
Isolation, Purification and Identification of Protein
2
分子生物学圣经—分子克隆实验指南
3
为什么要纯化蛋白质？
蛋白质是生命功能的执行者
• 理论意义：深入研究某种蛋白质的功能 以及作用机制，如信号通路中的蛋白 质…
• 应用价值---蛋白质工程 医药、工业、科研… 作为药物靶点…
25
2. 分离方法
在实验操作上，分为： •沉淀法 •离心法 •电泳法 •超滤法 •相分配法 •层析法
26
27
•Note
*不可能有一套统一的方法适用于分离纯 化所有的蛋白质，
*但每一种蛋白质可能都有一套适合的分 离纯化程序，
*而且所用的主要技术手段都基本相同。
28
二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤
23
1.6吸附性质
• 原理 蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、 陶瓷、塑料等。
• 方法
▫ 疏水层析
24
1.7变性和复性
• 原理
▫ 变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有 的空间结构、生物学功能及部分理化特性。
▫ 复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构 及生物学功能。
• 方法
▫ 如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中 纯化原核表达蛋白
16
• 超速离心
17
1.2分子形状
• 形状
▫ 蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝 胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受 到分子形状的影响。
• 方法
▫ 梯度离心 ▫ 电泳
1
蛋白质的分离纯化与鉴定
Isolation, Purification and Identification of Protein
2
分子生物学圣经—分子克隆实验指南
3
为什么要纯化蛋白质？
蛋白质是生命功能的执行者
• 理论意义：深入研究某种蛋白质的功能 以及作用机制，如信号通路中的蛋白 质…
• 应用价值---蛋白质工程 医药、工业、科研… 作为药物靶点…
25
2. 分离方法
在实验操作上，分为： •沉淀法 •离心法 •电泳法 •超滤法 •相分配法 •层析法
26
27
•Note
*不可能有一套统一的方法适用于分离纯 化所有的蛋白质，
*但每一种蛋白质可能都有一套适合的分 离纯化程序，
*而且所用的主要技术手段都基本相同。
28
二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤
23
1.6吸附性质
• 原理 蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、 陶瓷、塑料等。
• 方法
▫ 疏水层析
24
1.7变性和复性
• 原理
▫ 变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有 的空间结构、生物学功能及部分理化特性。
▫ 复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构 及生物学功能。
• 方法
▫ 如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中 纯化原核表达蛋白
蛋白表达及纯化ppt课件
蛋白表达及纯化
Part 1: 蛋白表达、纯化
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA
2. 表达宿主
3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
Host
Cellfree Bacteri al
Yeas t
Mammalia n
0.60 0.50 0.40
Protein preparation, extraction, clarification
Cell growth, protein overexpression Cell lysis Removal of cell debris
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。 b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。 c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。
pET system manual, Novagen, 11th Edition
X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化
1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L； 4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L； 7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。 图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化
1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG 诱导表达 0、1、 2、3、4、6、8、12 h。
Part 1: 蛋白表达、纯化
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA
2. 表达宿主
3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
Host
Cellfree Bacteri al
Yeas t
Mammalia n
0.60 0.50 0.40
Protein preparation, extraction, clarification
Cell growth, protein overexpression Cell lysis Removal of cell debris
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。 b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。 c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。
pET system manual, Novagen, 11th Edition
X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化
1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L； 4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L； 7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。 图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化
1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG 诱导表达 0、1、 2、3、4、6、8、12 h。
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包含体表达蛋白的纯化：
在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体 易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。一般 采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利 用透析、凝胶过滤色谱等方法进行复性。
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举例：His-Taq DNA 聚合酶纯化
步骤3. E. coli 表达菌株转化及筛选：
1.扩增并抽提构建好的表达质粒。 2.将表达质粒转化到高效的E. coli表达菌株中。 3.至少挑选5个阳性克隆于LB培养基中扩增并选择合适的条件， SDS-PAGE 检测蛋白表达情况，筛选出合适菌株。
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步骤4. 目标蛋白表达及纯化：
1.对时间，温度以及IPTG浓度等表达条件进行优化，诱导表达目标蛋 白。 2. 培养重组细菌，通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等层析方法 纯化表达的重组蛋白。 3.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。 4.通过Western-blot验证目标蛋白正确性，根据蛋白质性质检测其活性
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各种色谱的主要影响因素
填料性质 样品浓度 上样体积 洗脱流速 工作缓冲液的pH值，离子浓度
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12Biblioteka 蛋白质纯化常用衔接技术：1、透析。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋进 行透析，可以起到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。2、 超滤。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子量的 超滤膜进行超滤。 3、脱盐。透析、超滤可用于进行脱盐，Sephadex G25、G50常 用于蛋白质脱盐。
NdeI 识别序列： 5' CA^TATG 3' IPTG诱导：lac，T5，T7启动子 热诱导：lamda phage PL和PR启动子
表达载体选择：研究目的，目的蛋白性质和预计纯化方法
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重组蛋白质在大肠杆菌中的表达和纯化
步骤1. 目标基因全基因合成 步骤2. 目标基因亚克隆 步骤3. E. coli 表达菌株转化及筛选 步骤4. 目标蛋白表达及纯化
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性质：6*His标签，DNA聚合酶活性，pI ~5，热稳定 目的： 95%以上纯度，大量制备，无核酸酶，保持聚合酶活性
纯化策略： 1、37度可溶表达，收集菌体后超声加溶菌酶破碎菌体，离心， 上清液75度热处理20min，离心取上清 2、亲和层析纯化，阴离子交换层析去除核酸酶，根据聚合酶活 性及核酸酶活性测定其活性及核酸酶残留量
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蛋白质纯化常用预处理技术：
1、菌体破碎。超声、冻融、溶菌酶 2、离心沉淀。利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术。 3、过滤。澄清过滤、除菌过滤 4、盐析。常采用硫酸铵、硫酸钠盐析 5、等电点沉淀。根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。 6、有机溶剂沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。例如人血浆蛋白的 乙醇分级沉淀。 7、变性沉淀。根据目的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在 较高的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的方法。
重组蛋白质在大肠杆菌中的表达和纯化
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研究目的：
生物学活性 纯度 数量
目的蛋白性质：
序列 相对分子质量 氨基酸组成 等电点 稳定性 亲水性
蛋白质表达系统
1. 大肠杆菌表达系统 2. 酵母表达系统 3. 哺乳动物细胞表达系统
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2
大肠杆菌表达系统
遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类 齐全，表达效率高 基本不分泌，容易形成包涵体，无糖基化等翻译后修饰
真核表达系统
可进行分泌表达，有天然立体结构及翻译后修饰 表达量较低，培养成本较高，操作较复杂
表达系统选择：目的蛋白性质，研究目的
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大肠杆菌表达形式
可溶性表达：目的蛋白含有二硫键且需要正确的立体结构 包涵体表达：无活性要求，温度和诱导剂浓度影响 融合表达：小分子蛋白
大肠杆菌表达载体
融合表达：融合各种tag，GST,CBD,GFP等 单纯表达：pJLA系列，用NcoI/NdeI导入AUG的载体
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步骤1. 目标基因全基因合成：
1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。 2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优 化。 3.合成设计好的基因序列，将目标基因亚克隆到合适的复制质粒上。
提取mRNA，逆转录PCR得到cDNA
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步骤2. 目标基因亚克隆：
1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。 2.将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。 3.测序验证构建质粒的准确性。
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蛋白质纯化常用层析方法
1、凝胶过滤。根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量较大 的先出峰，分子量小的后出峰。 2、离子交换色谱。蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于 其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电 荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负 电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度 梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱。对于等电点小于5.0的酸性蛋白 质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使 用阳离子交换。 3、疏水作用色谱。利用蛋白质、多肽在高盐存在下，可以结合疏水凝 胶，而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实现分离。 4、亲和色谱。利用蛋白质、多肽与配基的特异性相互作用而进行分离。 5、反相色谱。常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制 备分离，分辨率极高。