基因工程菌稳定性分析PPT(共 48张)
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生物工艺学课件 基因工程菌的稳定性问题
第七章基因工程菌发酵第二节工程菌的稳定性问题近年来，重组DNA技术（基因工程）已开始由实验室走向工业生产。
现在，由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等都已先后供应市场，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降，但是从许多研究中发现，工程菌的保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌的稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术的成就转变为生产力的关键之一。
一、工程菌不稳定性的表现（倾向）工程菌的不稳定实际上包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。
具体表现为下列三种形式：质粒的丢失；重组质粒发生DNA片段脱落；表达产物不稳定。
由于某种环境因素或生理、遗传学上的原因，质粒从某些宿主细胞中丢失（消除curing），丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。
由于质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是两种菌的混合物。
在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率（μ+）往往小于不含重组质粒的比生长速率（μ-）。
宿主细胞的生长优势对工程菌的发酵极为不利。
有时质粒不稳定并非由于质粒丢失的缘故，而是重组质粒上一部分片段脱落，表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。
表达产物不稳定也是一个很重要的问题。
发现人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的延长，干扰素活性反而下降。
这种情况在别的工程菌培养过程中也有发现。
二、引起工程菌不稳定性的一些因素及对策组建成的工程菌的稳定与否，取决于重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件等三个方面。
就质粒本身的分子结构而言，引起工程菌不稳定常常是由于稳定区受到影响。
某些质粒如PSC101、R1、F等的分配系统在质粒上的位置已经确定，质粒col DF13有两个DNA序列part A, part B对它的稳定起着不可缺少的作用。
枯草杆菌质粒pUB110上几个与膜结合的蛋白基因对稳定性有关。
如质粒在重组过程中影响到这些序列的完整性，则其稳定性也受影响，另外可能由于重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部分同源等等都会造成质粒的不稳定。
基因工程菌的稳定性
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发酵罐的组成有：
发酵罐体、保证高传质作用的搅 拌器、精细的温度控制和灭菌系 统、空气无菌过滤装置、残留气 体处理装置、参数测量与控制系 统、培养液配制和连续操作系统。
对发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件， 培养过程不得污染， 保证纯菌培养， 培养及消毒过程不得游离异物， 不能干扰细菌代谢活动等。
温度还影响蛋白质的活性和包 含体的形成。
⒋ 溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重 要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用 率，则能提高发酵产率。
发酵时，随DO2浓度的下降， 细胞生长减慢，ST值下降，发酵后 期下降幅度更大。
外源基因的高效表达需要大量 的能量，促进细胞的呼吸作用，提 高对氧的需求。
第五节 基因工程菌的 稳定性
基因工程菌在传代过程中常 出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为： 分裂不稳定 结构不稳定
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一 定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢 失或碱基重排、缺失所致工程菌性 能的改变
微生物 基因工程菌PPT课件
染刺吸式口器的昆虫和处于非取食期的昆虫卵和蛹等 真菌侵染和致病机制复杂，害虫难以对真菌制剂产生抗性 对病虫害的持续控制作用, 可以形成昆虫间的流行病 对哺乳动物毒性低, 对环境的影响小
24
目的基因的构建
1. 利用病原真菌的毒力基因，例：真菌孢子附着基因，穿透体壁基 因等
2. 利用外源毒力基因，例：蝎毒素基因、苏云金芽胞杆菌毒素基因 等
3. 利用人工设计并合成基因
写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
26
谢谢聆听
·学习就是为了达到一定目的而努力去干, 是为一个目标去 战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折
Learning Is To Achieve A Certain Goal And Work Hard, Is A Process To Overcome Various Difficulties For A Goal
优势 ➢ 基因克隆表达系统完善
➢ 全基因组测序，共有4405个开放型 阅读框架
➢ 繁殖迅速、培养简单、操作方便、 遗传稳定
➢ 被美国FDA批准为安全的基因工程 受体生物
4
工程菌高密度发酵工艺
自重组DNA技术产生以来，许多在临床上具有重要治疗价值的蛋白药物通过携带有目的基因的大肠杆菌成功地在实验 室和工厂得以生产。利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺，生物工程菌发酵的目的 是希望能狄得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主、载 体和目的基因二者之间的相互关系，而且与其所处环境条件息息相关，因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远 不够的，需要对影响外源基因表达的因素进行分析，探索出适合外源基因表达的发酵工艺。高密度、高产率和高浓度 培养是近几年发酵工业的目标和方向。对于大肠杆菌，尤其是重组大肠杆菌的发酵来讲，实现高密度发酵，可相应的 缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用，从而降低生产成本，达到提高生产效率的目的。通过对基因工程菌 (RRhPI-pQE40 E.coli M15)发酵条件的优化，可以看出摇床转速与补料方式对发酵结果影响最大.摇床转速与发酵过程 中氧气的供给有很大的关系。大肠杆菌的生长代谢需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长及重组产物的影响很大 ，溶解氧的浓度过高或过低都会影响大肠杆菌的代谢，使后期生长变得极为缓慢，而且会降低重组蛋白的表达量.菌体 在进行大量的增殖过程中，消耗氧进行氧化分解代谢，因而饱和氧的及时供给非常重要。随着发酵的进行菌体的细胞 密度迅速增加，溶解氧的浓度因不断被菌体消耗而降低，细胞的生长开始减慢，ST值下降，尤其在发酵后期，下降幅 度更大。在高密度发酵后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数均不能满足对氧的供给，结 果导致外源蛋白的表达量很低。所以维持较高水平的溶氧浓度能提高带有重组质粒的大肠杆菌的生长繁殖，有利于外 源基因的重组蛋白的表达。一般的高密度发酵的通风速度达到18L/min ( 20L发酵罐)，搅拌速度达到500rpm以上，往往 还需要供给纯氧，需保持60%以上的溶氧饱和度，这样才能提高带有重组质粒细胞的生长，利于外源蛋白产物的形成 。需要注意的是，要考虑通风速度和搅拌速度的增加对泡沫的产生和发酵液粘稠度的影响，需要在培养基中加入适宜 的消泡剂。
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目的基因的构建
1. 利用病原真菌的毒力基因，例：真菌孢子附着基因，穿透体壁基 因等
2. 利用外源毒力基因，例：蝎毒素基因、苏云金芽胞杆菌毒素基因 等
3. 利用人工设计并合成基因
写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
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谢谢聆听
·学习就是为了达到一定目的而努力去干, 是为一个目标去 战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折
Learning Is To Achieve A Certain Goal And Work Hard, Is A Process To Overcome Various Difficulties For A Goal
优势 ➢ 基因克隆表达系统完善
➢ 全基因组测序，共有4405个开放型 阅读框架
➢ 繁殖迅速、培养简单、操作方便、 遗传稳定
➢ 被美国FDA批准为安全的基因工程 受体生物
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工程菌高密度发酵工艺
自重组DNA技术产生以来，许多在临床上具有重要治疗价值的蛋白药物通过携带有目的基因的大肠杆菌成功地在实验 室和工厂得以生产。利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺，生物工程菌发酵的目的 是希望能狄得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主、载 体和目的基因二者之间的相互关系，而且与其所处环境条件息息相关，因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远 不够的，需要对影响外源基因表达的因素进行分析，探索出适合外源基因表达的发酵工艺。高密度、高产率和高浓度 培养是近几年发酵工业的目标和方向。对于大肠杆菌，尤其是重组大肠杆菌的发酵来讲，实现高密度发酵，可相应的 缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用，从而降低生产成本，达到提高生产效率的目的。通过对基因工程菌 (RRhPI-pQE40 E.coli M15)发酵条件的优化，可以看出摇床转速与补料方式对发酵结果影响最大.摇床转速与发酵过程 中氧气的供给有很大的关系。大肠杆菌的生长代谢需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长及重组产物的影响很大 ，溶解氧的浓度过高或过低都会影响大肠杆菌的代谢，使后期生长变得极为缓慢，而且会降低重组蛋白的表达量.菌体 在进行大量的增殖过程中，消耗氧进行氧化分解代谢，因而饱和氧的及时供给非常重要。随着发酵的进行菌体的细胞 密度迅速增加，溶解氧的浓度因不断被菌体消耗而降低，细胞的生长开始减慢，ST值下降，尤其在发酵后期，下降幅 度更大。在高密度发酵后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数均不能满足对氧的供给，结 果导致外源蛋白的表达量很低。所以维持较高水平的溶氧浓度能提高带有重组质粒的大肠杆菌的生长繁殖，有利于外 源基因的重组蛋白的表达。一般的高密度发酵的通风速度达到18L/min ( 20L发酵罐)，搅拌速度达到500rpm以上，往往 还需要供给纯氧，需保持60%以上的溶氧饱和度，这样才能提高带有重组质粒细胞的生长，利于外源蛋白产物的形成 。需要注意的是，要考虑通风速度和搅拌速度的增加对泡沫的产生和发酵液粘稠度的影响，需要在培养基中加入适宜 的消泡剂。
最新【微生物工程】第八章_基因工程菌的培养幻灯片课件
【微生物工程】第八章_基 因工程菌的培养
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的表现
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种 不稳定性具有下列两种表现形式：
结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失
分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸（curing）
格式塔心理学
目录
❖ 第一部分：前言 ❖ 第二部分：格式塔心理学产生背景 ❖ 第三部分：格式塔心理学的主要代表人物 ❖ 第四部分：格式塔学派的研究成果 ❖ 第无部分：对格式塔心理学的评价
一、前言
❖ “格式塔”（Gestalt）一词具有两种涵义。一种涵义是 指形状或形式，亦即物体的性质，例如，用“有角的”或 “对称的”这样一些术语来表示物体的一般性质，以示三 角形（在几何图形中）或时间序列（在曲调中）的一些特 性。在这个意义上说，格式塔意即“形式”。另一种涵义 是指一个具体的实体和它具有一种特殊形状或形式的特征， 例如，“有角的”或“对称的”是指具体的三角形或曲调， 而非第一种涵义那样意指三角形或时间序列的概念，它涉 及物体本身，而不是物体的特殊形式，形式只是物体的属 性之一。
❖ 正式诞生：1912年惠特海默发表《于运动知觉的实验研 究》。
❖ 主要观点：强调经验和行为的整体性，认为整体不等于且 大于部分之和，主张从整体的动力结构观来研究心理现象。
二、格式塔心理学产生背景
1 整体观的思想传统
2
社会历史背景
3
哲学理论背景
4
心理学背景
5
科学背景
三、格式塔心理学的主要代表人物
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的表现
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种 不稳定性具有下列两种表现形式：
结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失
分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸（curing）
格式塔心理学
目录
❖ 第一部分：前言 ❖ 第二部分：格式塔心理学产生背景 ❖ 第三部分：格式塔心理学的主要代表人物 ❖ 第四部分：格式塔学派的研究成果 ❖ 第无部分：对格式塔心理学的评价
一、前言
❖ “格式塔”（Gestalt）一词具有两种涵义。一种涵义是 指形状或形式，亦即物体的性质，例如，用“有角的”或 “对称的”这样一些术语来表示物体的一般性质，以示三 角形（在几何图形中）或时间序列（在曲调中）的一些特 性。在这个意义上说，格式塔意即“形式”。另一种涵义 是指一个具体的实体和它具有一种特殊形状或形式的特征， 例如，“有角的”或“对称的”是指具体的三角形或曲调， 而非第一种涵义那样意指三角形或时间序列的概念，它涉 及物体本身，而不是物体的特殊形式，形式只是物体的属 性之一。
❖ 正式诞生：1912年惠特海默发表《于运动知觉的实验研 究》。
❖ 主要观点：强调经验和行为的整体性，认为整体不等于且 大于部分之和，主张从整体的动力结构观来研究心理现象。
二、格式塔心理学产生背景
1 整体观的思想传统
2
社会历史背景
3
哲学理论背景
4
心理学背景
5
科学背景
三、格式塔心理学的主要代表人物
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
工程菌的高效表达及稳定性护理课件
通过培养优化技术，可以显著提高工程菌的生长和代谢能力，从而提高目标产物的 产量和纯度。
CHAPTER 03
工程菌的稳定性护理
菌种保藏技术
01
02
03
低温保藏
将工程菌种保存在低温环 境下，如-80°C或-196°C ，以减缓菌种生长和变异 的速度。
真空干燥保藏
通过去除水分，降低菌种 活性，延长保藏时间。
基因编辑技术将有助于发现和鉴定新的基因和蛋白质，进 一步拓展工程菌的应用领域。
新型表达载体的研发
新型表达载体是提高工程菌表达效率 和稳定性的关键，未来将会有更多高 效、稳定的新型表达载体被研发和应 用。
新型表达载体将有助于解决现有表达 载体存在的问题，如表达水平低、易 污染等，进一步提高工程菌的应用价 值。
表达载体技术主要涉及载体的设计和 改造、外源基因的插入和表达调控等 。
表达载体技术的关键在于选择合适的 载体和构建高效的载体系统，以提高 外源基因的表达水平和稳定性。
培养优化技术
培养优化技术是通过优化培养条件，提高工程菌的生长和代谢速率，从而提高目标 产物的产量。
培养优化技术主要涉及温度、pH、氧气、营养物质等培养条件的调节和控制。
添加稳定剂
在培养基中添加抗氧化剂、抗紫 外线和重金属等稳定剂，提高工 程菌的抗逆性。
培养条件控制
温度控制
保持恒定的培养温度，避 免温度波动对工程菌生长 和稳定性的影响。
pH值控制
维持适宜的pH值范围，保 证工程菌的正常生长和代 谢。
溶氧量控制
根据工程菌的生长需求， 控制培养液中的溶氧量， 促进菌种的生长和稳定性 。
VS
工程菌的应用将有助于解决一些全球 性的问题，如抗生素耐药性、环境污 染等，对人类社会的可持续发展具有 重要意义。
CHAPTER 03
工程菌的稳定性护理
菌种保藏技术
01
02
03
低温保藏
将工程菌种保存在低温环 境下，如-80°C或-196°C ，以减缓菌种生长和变异 的速度。
真空干燥保藏
通过去除水分，降低菌种 活性，延长保藏时间。
基因编辑技术将有助于发现和鉴定新的基因和蛋白质，进 一步拓展工程菌的应用领域。
新型表达载体的研发
新型表达载体是提高工程菌表达效率 和稳定性的关键，未来将会有更多高 效、稳定的新型表达载体被研发和应 用。
新型表达载体将有助于解决现有表达 载体存在的问题，如表达水平低、易 污染等，进一步提高工程菌的应用价 值。
表达载体技术主要涉及载体的设计和 改造、外源基因的插入和表达调控等 。
表达载体技术的关键在于选择合适的 载体和构建高效的载体系统，以提高 外源基因的表达水平和稳定性。
培养优化技术
培养优化技术是通过优化培养条件，提高工程菌的生长和代谢速率，从而提高目标 产物的产量。
培养优化技术主要涉及温度、pH、氧气、营养物质等培养条件的调节和控制。
添加稳定剂
在培养基中添加抗氧化剂、抗紫 外线和重金属等稳定剂，提高工 程菌的抗逆性。
培养条件控制
温度控制
保持恒定的培养温度，避 免温度波动对工程菌生长 和稳定性的影响。
pH值控制
维持适宜的pH值范围，保 证工程菌的正常生长和代 谢。
溶氧量控制
根据工程菌的生长需求， 控制培养液中的溶氧量， 促进菌种的生长和稳定性 。
VS
工程菌的应用将有助于解决一些全球 性的问题，如抗生素耐药性、环境污 染等，对人类社会的可持续发展具有 重要意义。
3.2第三章_基因工程菌的稳定性_生物制药
遗传特性
载体的选择 宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上 培养基 生长速率 限制性基质 温度 pH 和溶氧 外源基因表达
发酵工艺
改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：
1.将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 2.正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 3.将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因
的稳定性，在第二级进行表达。
提高基因工程菌稳定性的策略
控制目的基因的过量表达
使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度
使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺
培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定
培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
提高基因工程菌稳定性的策略
分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、 连续培养中控制稀释速率等培养方法，都能在一定范围内控 制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用， 以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。 实质：控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和 呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的 产生，以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌 体生长速度。
连续培养：
连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度 后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。
连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研究
基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造了 良好的条件。 但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。在这
第六讲基因工程48ppt课件
2、构造重组•DNA分子
以质粒作载体为例
• 用与提取目的基因相同 的限制酶切割质粒使之 出现一个切口，将目的 基因插入切口处，让目 的基因的黏性末端与切 口上的黏性末端互补配 对后，在连接酶的作用 下连接形成一个环形的 重组DNA分子。
提取质粒并用 限制酶切割
用连接酶将目的 基因和质粒连接
目的基因与质粒的连接
3、将目的基因导入受体细胞并扩增
基因工程中常用的受体细胞有大肠杆 菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物 细胞等。
转化是指外源DNA分子或片段被细菌 细胞吸收，并整合进细胞染色体的遗 传现象，若受体细胞是动/植物细胞， 通常称为转染。
导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌 或者病毒侵染细胞的途径。通常还要 对一些受体细胞进行增大通透性的处 理。（氯化钙或高压电脉冲打孔）
先将细胞核内的基因组转录为RNA，以信使RNA（mRNA） 为模板，在逆转录酶的作用下根据碱基互补原则人工合成一段 与之互补的DNA片段，再以此单链DNA为模版，人工合成另 外一条互补的DNA子链，从而获得所需的目的基因。
mRNA→单链DNA→ 双链DNA（cDNA）
DNA合成仪
（3）聚合酶链式反应（PCR） （如目的基因的核酸顺序已知）
在植物转基因中多采用农杆菌作为目的基因受体，再利用 重组农杆菌感染植物细胞进行转化，将目的基因整合到植 物基因中。
（7）转基因动物
转基因动物主要用于生产器官移植的研究，生产对人类有价 值的产品，使动物具有某些可遗传的抗性对付某些疾病与不 良环境，目前出于对安全性考虑，禁止将转基因动物进入食 品。 目前将人的某些基因转入动物，生产某些蛋白类药物已经广 泛实施。一般动物转基因多采用受精卵注射法，将目的基因 直接注射入动物的受精卵中，有一部分生产出的动物细胞内 含有这些目的基因。还有胚胎干细胞法，将目的基因转化胚 胎干细胞，再进行胚发育，一旦成为生殖细胞，可获得稳定 的遗传。
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由于主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统， 从而保证了质粒的高度稳定。
GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
2 随机分配
在细胞分裂过程 中质粒拷贝数在两个 子细胞中随机分配。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
影响质粒载体稳定性的主要因素
新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应 拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应
目的基因获取-目的基因扩增-基因重组-重组载体 导入受体菌-筛选导入成功的受体菌
GXU
第一节 基因工程菌的概述
三、质粒的稳定性问题
基因工程技术是生物技术的核心和关键，通过 载体向受体细胞或细菌转入目的基因，从而使其表 达一系列与人类健康有关的重要物质，如抗生素、 氨基酸、疫苗等，在医药、环境治理等行业有广阔 应用前景。但是，质粒的稳定性问题是基因工程技 术工业化的瓶颈。
GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
二、质粒载体不稳定性的类型
结构不稳定
指结构(序列)不稳定性, 即重组质粒上某一区域的 DNA 序列发生插入、缺失、重排和修饰等现象, 导致 其表观生物学功能的丧失;
分离不稳定
指细胞分裂的过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNA拷贝，并最终增殖为无质粒的优势群体。GXU
GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
三、质粒拷贝分配到子细胞的途径
质粒拷贝分配到子细胞的途径可分为主动分配 和随机分配两种不同的方式。
1 主动分配的方式有两种:
平均分配--每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝
配对位点分配--只有一对质粒呈主动分配，其他的随机
分配
GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
1. 结构不稳定
原因：DNA的丢失，插入和重排。人工构建的多个 串联启动子的质粒载体容易发生丢失作用。寄主染色体 及质粒载体的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的 不稳定性。 共 同 特 征 ： 同 向 重 复 序 列 之 间 的 同 源 重 组 （ short direct repeat). 例如：用含有酪氨酸操纵子的多拷贝质粒载体转换 大肠杆菌tryR菌株时，由于IS1因子的插入效应，结果产 生出具有插入或者缺失的修饰型的质粒载体。
高密度培养 基因工程菌 选择培养基 周期操作 固定化基因工程菌
基因工程菌稳定性分析
GXU
基因工程菌稳定性分析
第一节 基因工程菌的概述
第二节 质粒载体不稳定现象及类型 第三节 提高质粒稳定性的方法
第四节 影响质粒载体稳定性的主要因素 第五节 对NHase重组质粒稳定性分析
GXU
Slide 2
第一节 基因工程菌的概述
一、 基因Leabharlann 程菌的定义基因工程菌( Gene Engineering Bacteria) 是利用 基因工程技术，将外源目的基因导入宿主细胞使其 表达所需蛋白的重组菌。 二、基因工程菌构建的基本路线
差异：同样的大肠杆菌培养物中，每个细胞所拥有的质粒 载体拷贝数是不尽相同的，这种不同的细胞个体之间的质 粒载体拷贝数差异程度，简称差度。
无质粒载体细胞的速度是由分裂细胞中的质粒载体拷贝平 均值数决定的。
差度是影响质粒载体丢失的速率，也是造成质粒载体不稳 定的原因之一。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
1. 新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应
质粒载体增加给宿主细胞DNA复制效应曲线。 即宿主细胞生长速度与质粒载体的分子量的大小成 正比，克隆的外源DNA段越大，寄主细胞生长缓慢 的时间就越长。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
2. 拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响
寡聚化作用普遍存在于含有大分子量插入片段的克隆载 体。实验证明，pBR322派生载体中，寡聚化程度与插入 片段大小存在相关性。
决定大肠杆菌培养物中含质粒寡聚体细胞的比例有两种
主要的因素：一、质粒DNA分子间的重组频率；二、含
质粒寡聚体细胞生长速率。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
具有低差度分布 特性的质粒载体相当 的稳定性，具有高差 度分布特性的质粒载 体稳定性较差。位于 后者的这种分布的低 拷贝数的一段产生无 质粒载体细胞的频率 相当高。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
3. 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应
质粒寡聚体，其稳定性比单体差，同样是造成质粒不稳 定性的重要原因之一。
影响质粒重组的突变
同样也会影响质粒的稳
定性。实验观察表明，
在 重 组 缺 陷 (rec-) 的 大 肠
杆菌寄主细胞中，基因
工 程 常 用 载 体 pBR322 和
pUC当以单体形式存在时
最稳定。随着质粒寡聚
体比例的逐渐上升，其
稳定性就相应的下降。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高生 长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。
GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
一、质粒载体不稳定的现象：
克隆有外源基因的质粒载体转移到大肠杆菌受体细 胞之后，会产生一系列的生理效应，影响到自身的 稳定性； 可能引起形态学上的变化：丝状现象和脆性增加； 产生无质粒的突变体或拷贝数低的突变体； 结构重排导致无法正常表达的突变体。
质1
950
粒
拷
贝 数 0.5
40
0
0.2
0.4
生长数率/h
β-半乳糖苷酶工程菌的连续养
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
一般情况下,质粒的结构不稳定性可以通过宿主 菌株的谨慎和恰当的选用来消除。因此在质粒 不稳 定性的研究过程中, 人们关注最多的,通常是质粒的 分离不稳定性。
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第四节 提高质粒稳定性的方法
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第二节 质粒载体不稳定现象及类型
2. 分离不稳定
原因：细胞分裂过程中的质粒的不平均分配。 由于缺陷性分配（defective partitioning）所造成的质 粒的丢失现象叫做质粒分离的不稳定性。 质粒稳定遗传的两个必要条件：一、平均每个时代每 个质粒至少发生一次复制；二、细胞分裂时，复制产生 的质粒拷贝必须分配到两个子细胞中去。
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第二节 质粒载体不稳定现象及类型
2 随机分配
在细胞分裂过程 中质粒拷贝数在两个 子细胞中随机分配。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
影响质粒载体稳定性的主要因素
新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应 拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应
目的基因获取-目的基因扩增-基因重组-重组载体 导入受体菌-筛选导入成功的受体菌
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第一节 基因工程菌的概述
三、质粒的稳定性问题
基因工程技术是生物技术的核心和关键，通过 载体向受体细胞或细菌转入目的基因，从而使其表 达一系列与人类健康有关的重要物质，如抗生素、 氨基酸、疫苗等，在医药、环境治理等行业有广阔 应用前景。但是，质粒的稳定性问题是基因工程技 术工业化的瓶颈。
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第二节 质粒载体不稳定现象及类型
二、质粒载体不稳定性的类型
结构不稳定
指结构(序列)不稳定性, 即重组质粒上某一区域的 DNA 序列发生插入、缺失、重排和修饰等现象, 导致 其表观生物学功能的丧失;
分离不稳定
指细胞分裂的过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNA拷贝，并最终增殖为无质粒的优势群体。GXU
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第二节 质粒载体不稳定现象及类型
三、质粒拷贝分配到子细胞的途径
质粒拷贝分配到子细胞的途径可分为主动分配 和随机分配两种不同的方式。
1 主动分配的方式有两种:
平均分配--每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝
配对位点分配--只有一对质粒呈主动分配，其他的随机
分配
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第二节 质粒载体不稳定现象及类型
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
1. 结构不稳定
原因：DNA的丢失，插入和重排。人工构建的多个 串联启动子的质粒载体容易发生丢失作用。寄主染色体 及质粒载体的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的 不稳定性。 共 同 特 征 ： 同 向 重 复 序 列 之 间 的 同 源 重 组 （ short direct repeat). 例如：用含有酪氨酸操纵子的多拷贝质粒载体转换 大肠杆菌tryR菌株时，由于IS1因子的插入效应，结果产 生出具有插入或者缺失的修饰型的质粒载体。
高密度培养 基因工程菌 选择培养基 周期操作 固定化基因工程菌
基因工程菌稳定性分析
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基因工程菌稳定性分析
第一节 基因工程菌的概述
第二节 质粒载体不稳定现象及类型 第三节 提高质粒稳定性的方法
第四节 影响质粒载体稳定性的主要因素 第五节 对NHase重组质粒稳定性分析
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Slide 2
第一节 基因工程菌的概述
一、 基因Leabharlann 程菌的定义基因工程菌( Gene Engineering Bacteria) 是利用 基因工程技术，将外源目的基因导入宿主细胞使其 表达所需蛋白的重组菌。 二、基因工程菌构建的基本路线
差异：同样的大肠杆菌培养物中，每个细胞所拥有的质粒 载体拷贝数是不尽相同的，这种不同的细胞个体之间的质 粒载体拷贝数差异程度，简称差度。
无质粒载体细胞的速度是由分裂细胞中的质粒载体拷贝平 均值数决定的。
差度是影响质粒载体丢失的速率，也是造成质粒载体不稳 定的原因之一。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
1. 新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应
质粒载体增加给宿主细胞DNA复制效应曲线。 即宿主细胞生长速度与质粒载体的分子量的大小成 正比，克隆的外源DNA段越大，寄主细胞生长缓慢 的时间就越长。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
2. 拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响
寡聚化作用普遍存在于含有大分子量插入片段的克隆载 体。实验证明，pBR322派生载体中，寡聚化程度与插入 片段大小存在相关性。
决定大肠杆菌培养物中含质粒寡聚体细胞的比例有两种
主要的因素：一、质粒DNA分子间的重组频率；二、含
质粒寡聚体细胞生长速率。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
具有低差度分布 特性的质粒载体相当 的稳定性，具有高差 度分布特性的质粒载 体稳定性较差。位于 后者的这种分布的低 拷贝数的一段产生无 质粒载体细胞的频率 相当高。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
3. 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应
质粒寡聚体，其稳定性比单体差，同样是造成质粒不稳 定性的重要原因之一。
影响质粒重组的突变
同样也会影响质粒的稳
定性。实验观察表明，
在 重 组 缺 陷 (rec-) 的 大 肠
杆菌寄主细胞中，基因
工 程 常 用 载 体 pBR322 和
pUC当以单体形式存在时
最稳定。随着质粒寡聚
体比例的逐渐上升，其
稳定性就相应的下降。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高生 长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。
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第二节 质粒载体不稳定现象及类型
一、质粒载体不稳定的现象：
克隆有外源基因的质粒载体转移到大肠杆菌受体细 胞之后，会产生一系列的生理效应，影响到自身的 稳定性； 可能引起形态学上的变化：丝状现象和脆性增加； 产生无质粒的突变体或拷贝数低的突变体； 结构重排导致无法正常表达的突变体。
质1
950
粒
拷
贝 数 0.5
40
0
0.2
0.4
生长数率/h
β-半乳糖苷酶工程菌的连续养
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
一般情况下,质粒的结构不稳定性可以通过宿主 菌株的谨慎和恰当的选用来消除。因此在质粒 不稳 定性的研究过程中, 人们关注最多的,通常是质粒的 分离不稳定性。
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第四节 提高质粒稳定性的方法
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第二节 质粒载体不稳定现象及类型
2. 分离不稳定
原因：细胞分裂过程中的质粒的不平均分配。 由于缺陷性分配（defective partitioning）所造成的质 粒的丢失现象叫做质粒分离的不稳定性。 质粒稳定遗传的两个必要条件：一、平均每个时代每 个质粒至少发生一次复制；二、细胞分裂时，复制产生 的质粒拷贝必须分配到两个子细胞中去。