禾谷镰刀菌拮抗菌筛选探究方案

由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是小麦重要病害之一，也是影响中国小麦生产的重要病害[2]。

小麦赤霉病别名红麦头、烂麦头、麦穗枯。

在全世界普遍发生，气候湿润多雨的温带地区受害比较严重，在潮湿和半潮湿区域发生率较高。

从幼苗到抽穗都可受害，主要引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐，其中穗腐的危害最为严重。

小麦赤霉病的表现小麦赤霉病主要引起穗腐、苗腐和杆腐等症状。

最常见的是穗腐。

初期在颖片和小穗上会出现浅褐色斑，小穗也会慢慢感染，接着蔓延到邻近小穗，导致小穗枯黄。

湿度大时，会产生红色霉层；湿度小时，病小穗枯白，没有霉层产生[3]。

种子带菌或土壤中病残体侵染小麦会产生苗腐，刚感染小麦会变得瘦小，时间长了可能会病死。

穗下第一、二节则容易发生杆腐，叶鞘上会先出现淡褐色斑点，再向节部内部蔓延，严重时不能抽穗。

小麦赤霉病的发病条件在充足的湿度和空气条件下，赤霉病会形成子囊壳和子囊孢子，最适和的生长温度为24～25℃，最低9～10℃，最高32℃。

在适宜的条件下2～3d 即可产生子囊壳，5～10d 形成子囊孢子。

在小麦抽穗前后，子囊孢子会随风飘散，飘落在麦穗上，子囊孢子会在颖内花药上腐生，接着整个花器及小穗都会被感染。

还会产生分生孢子群，分生孢子会接着随风飘散，接着侵染其它小麦，使病害扩展蔓延[4]。

气象条件对小麦赤霉病的影响较大。

当平均气温为9℃以上，3～5d 的雨天时，便形成了子囊孢子。

这会十分有利于子囊孢子的释放和侵染，小麦赤霉病很有可能大流行。

小麦赤霉病的危害小麦赤霉病是造成农业损失的主要原因之一[5]，联合国粮农组织（FAO）统计，每年由植物病害引起的减产平均损失为总产量的10%～15%，而其中的80%的损失是由真菌引起的[6]。

小麦赤霉病会严重影响小麦的产量，同时还会降低小麦的品质。

该还能产生以脱氧雪腐镰刀菌烯醇为主的真菌毒素，能较大的危害人、畜。

当有4%的病麦时就不能使用了，这时小麦已经失去了利用价值。

1950年以来全国赤霉病大流行12年，中度流行17年，流行的频率为46.8%。

1985年全国赤霉病又大流行，仅河南省发病面积就达3.0×106 hm2。

2000以来赤霉病在中国大流行频率不断增加，发病面积呈明显扩大趋势，有9个年份赤霉病的发生面积就超过了3.3×106 hm2。

其中仅河南省就有7年的发病面积超过6.7×105 hm2。

在2012年的赤霉病大流行中，山东省南部和西南部较重，河南省整体偏重，豫南更重，安徽和江苏普遍严重[7]。

1赤霉病严重威胁小麦的安全生产，一般的流行年份可引起5%～10%的产量损失，大的流行年份可导致相当多的田块绝收。

根据调查2008～2009年度全国11 个省的1018个饲料样品的毒素污染情况发现，DON毒素的检出率达95.8%，超标率达17.7%，其中西北地区的超标率高达38.1%，华北和华中地区的超标率则分别为21.0%和20.1%[8]。

本课题便是用牛肉膏蛋白胨培养基涂布平板法从小麦根际土壤中分离出细菌，纯化后用平板对峙法进行初筛和复筛。

通过形态学方法、生理生化分析进行初步鉴定，研究其抗菌活性，为寻找有效抵御小麦赤霉病的方法奠定基础。

2 材料与方法2.1 供试病原菌和小麦根际土样供试植物病原真菌：禾谷镰刀菌（9435实验室保存）。

小麦根际土样：河南工业大学西门大谢村麦田。

2.2 试剂及仪器2.2.1 试剂名称及生产厂家试剂名称规格生产厂家蛋白胨蔗糖牛肉浸膏BRARBR北京双旋微生物培养基制品厂天津市瑞金化学品有限公司北京双旋微生物培养基制品厂可溶性淀粉BR 天津市瑞金特化学品有限公司对二甲基氨基苯甲醛AR 上海试剂三厂氯化钠AR 天津市德恩化学试剂有限公司酵母膏AR 北京奥博星生物技术有限责任公司琼脂粉BR 上海化学试剂厂有限公司溴百里香酚兰AR 上海三爱思试剂有限公司葡萄糖AR 天津市科密欧化学试剂有限公司氢氧化钠AR 天津市科密欧化学试剂有限公司磷酸氢二钾AR 天津市化学试剂三厂柠檬酸钠AR 湖南省医药公司化玻站硫酸镁AR 天津市永远化学试剂开发中心乳糖无水乙醇ARAR天津市科密欧化学试剂有限公司天津市永大化学试剂开发中心磷酸二氢铵AR 天津化学试剂三厂二甲苯AR 洛阳昊华化学试剂有限公司硝酸钾AR 天津市瑞金化学品有限公司乙酸（冰醋酸）AR 开封市芳晶化学试剂有限公司浓盐酸AR 洛阳昊华化学试剂有限公司三氯化铁AR 天津市化学试剂工厂碘AR 天津市科密欧化学试剂有限公司甲基红AR 天津市科密欧化学试剂有限公司结晶紫AR 天津市化学试剂三厂次氯酸钠AR 天津市光复精细化工研究所番红花红T AR 天津市科密欧化学试剂研究所2.2.2 实验仪器仪器名称仪器型号生产公司电热恒温鼓风干燥箱XMTD-8222 上海精宏试验设备公司高压蒸汽灭菌锅SX-700 日本TOMY震荡培养箱HZQ-X100 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司电热恒温培养箱DHP-9052 上海浦东荣本科学仪器有限公司台式离心机TDL-5A 上海菲恰尔分析仪器有限公司漩涡混合器HQ-60-Ⅱ北京北方同正生物技术发展有限公司无菌操作台SW-CJ-2F 苏州净化设备有限公司移液枪KHB 上海科华实验系统有限公司电子天平JJ200 常熟市双杰测试仪器厂冰箱BCD-155TDGA 青岛海尔股份有限公司BCD-232MA/X1 海信容声冰箱有限公司洁净操作台SW-CJ-1FD 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司万用电炉DL-1 北京中兴伟业仪器有限公司3pH计DELTA 320 梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）2.3 试验方法2.3.1 常用培养基的配制方法１、牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏0.5ｇ；蛋白胨1ｇ；氯化钠0.5ｇ；琼脂2ｇ；蒸馏水100 mL；pH 7.2～7.6。

步骤：(1) 称量：准确地称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠放入烧杯中。

牛肉膏要玻棒挑取，放在小烧杯中称量，用热水溶化后倒入三角瓶。

也可放在称量纸上，称量后直接放入三角瓶中，按比例加水后再稍微加热，牛肉膏便会溶于水中，然后立即取出称量纸。

另外称取蛋白胨时要迅速准确。

(2) 融化：可先加少许水量在电炉上加热使其溶解。

药品完全溶解后，再补充水分。

将琼脂加到融化的药品中，不断搅拌加热，防止琼脂糊底，烧杯破裂。

最后再补充所失的水分。

(3) 调pH：先用精密纸测量培养基的pH值，一般pH偏酸，再向培养基中逐滴加入1mol/L的NaOH，一边加一边搅拌，并不停的用pH试纸测其pH值，直至pH达7.2～7.6。

注意慢调，以避免过碱，再回调pH，否则，会影响培养基内各离子的浓度，还有可能破坏培养基的成分。

如果有pH计，还可以用pH计。

(4) 分装，加塞，包装：按要求可将培养基分装于试管内或三角烧瓶内。

分装时要注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，避免沾污棉塞而引起污染。

固体若装于试管，则其装量不应超过管高的1/5，灭菌倾斜放置，制成斜面。

三角瓶的装量不应超过容积的一半。

(5) 灭菌，无菌检查：将上述培养基以1.05 kg/cm2，121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。

如不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

灭过菌后再将培养基放入37℃的温室中培养24～48小时，以检查灭菌是否彻底。

２、PDA培养基配方：马铃薯100ｇ；葡萄糖10ｇ；琼脂10ｇ；蒸馏水500 mL；自然pH。

步骤：(1) 称量：先把马铃薯洗干净，除去皮,再称取100ｇ马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用8层纱布过滤。

(2) 溶解：可加热后再加琼脂，搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍微冷却后再补充水分至500 mL。

分装、加塞、包扎、灭菌与上面的相似，如需备用，可冷存。

３、LB液体培养基配方：胰蛋白胨10ｇ；酵母提取物5ｇ；NaCl 10ｇ；蒸馏水1000 mL；pH：7.0 步骤：根据配方配置培养基，液体分装时不超过试管的1/4为宜，不超过三角瓶的1/2为宜，包扎灭菌等步骤与上面的相似。

2.3.2 采取土样在河南工业大学西门口的大谢村小麦地采取土样，用小铲挖取小麦根系土壤，选取５个点的小麦根系土壤，混合后备用。

2.3.3 分离土样中的细菌将采集到的麦田土壤作为内生细菌分离对象。

取采集到的10ｇ土样置于装有90ml 无菌水的三角瓶中，200r/min震荡30min即成10-1菌悬液，将所得的菌悬液吸取10ml置于装有90ml的无菌水三角瓶中，依次稀释成10-4、10-5、10-6，取0.1ml 稀释液涂布于装有牛肉膏蛋白胨培养基的平板上。

4次重复，28℃培养3～4d，记录单菌落数量。

根据平板上长出菌落的形态、颜色、大小等特征挑取不同单菌落，反复纯化后接斜面保藏。

2.3.4 筛选拮抗细菌1、拮抗细菌的初筛用对峙培养法，取直径为8 mm的禾谷镰刀菌菌饼置于PDA培养基平板( d = 90 mm) 中央，用接种环挑取细菌菌株点接在距离平板中央30mm处，28℃培养3～5d后测量抑菌带宽度，以仅接种禾谷镰刀菌的处理为对照，每个处理重复4次。

观察菌落的生长变化，根据公式计算抑制率，筛选出具有拮抗活性的菌株。

抑菌率(%) = [ (对照菌落直径（mm）-处理菌落直径（mm）) /对照菌落直径] ×100%2、拮抗细菌的复筛对有明显抑菌效果的细菌接种于装有100mL液体LB培养基的三角瓶中，三角瓶置于37℃摇床中，培养2d，将混浊的菌悬液注入无菌离心管中离心10min(5000 rpm) 可得到上清液。

在无菌操作台上，抽取上清液，用细菌过滤器滤去上清液中的细菌。

取200uL 无菌发酵液，涂布平板，待其凉干，接病原菌菌饼，每菌种三个重复并做对照，5～7d后观察对峙效果，测量抑菌圈直径或者半径。

2.3.5 细菌的生理生化鉴定１、形态学观察采用插片法、埋片法, 对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。

用革兰氏染色进行油镜观察。

5①革兰氏染色溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95%乙醇，番红复染液等。

试验步骤：(1) 涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干燥和固定。

(2) 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出水无色。

(3) 媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，水洗至流出水无色。

(4) 脱色：在上述涂片上流加95%乙醇溶液（一般20～30s），当脱色至流出液无色时立即用水洗去乙醇。

(5) 复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，用吸水纸吸去残水晾干。

(6) 镜检：用油镜观察。

②芽孢染色(1) 制片：按常规方法涂片、干燥及固定。

(2) 加热染色：向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５min，加热时应注意补充染液，切勿让涂片干涸。