酶的固定化技术
酶的固定化
3.扩散限制效应
酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产 生了扩散阻力：
●
外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过
程中的一种扩散限制效应，发生在固定化颗粒周围的液膜
层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅 拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。
●
内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到
缺点：
● ● ●
固定化时，酶活力有损失； 增加了生产的成本，工厂初始投资大； 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物， 与完整的菌体相比不适于多酶反应，特别是需要辅 胞内酶必须经过酶的分离手续。
对大分子底物不适宜；
●
助因子的反应；
●
三、影响固定化酶性质的因素
分配效应 空间障碍效应 扩散抑制效应
在具体选择时，一般应遵循以下几个原则：
（1）必须注意维持酶的构象, 特别是活性中心的构象。
（2）酶与载体必须有一定的结合程度。
（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。 （6）固定化酶的成本适中。
1.吸附法
吸附法（Adsorption） 是通过载体表面和酶分子 表面间的次级键相互作用 而达到固定目的，是固定 化中最简单的方法。只需 将酶液与具有活泼表面的 吸附剂接触，再经洗涤除 去未吸附的酶便能制得固 定化酶。
●
●
●
1.分配效应
由于载体和底物的性质 差异引起了微环境和宏观 环境之间的性质不同。微 环境是在固定化酶附近的 局部环境，而将主体溶液 称为宏观环境。由这种不 同造成的底物、产物和各 种效应物在两个环境之间 的不同分配，被称为分配 效应。
2.空间障碍效应
酶的固定化技术
摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。
经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注目的领域。
本文简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术) 及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题,并对固定化酶技术的应用前景进行了展望。
关键词：固定化酶；制备；应用；磁性载体；定向固定固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。
酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。
物理方法包括物理吸附法、包埋法等。
物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。
但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。
化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。
酶固定化技术的方法
酶固定化技术的方法
酶固定化是将酶与载体物质结合在一起，以增强酶的稳定性和重复使用性的技术。
常见的酶固定化方法包括以下几种：
1. 吸附固定化：将酶溶液与载体物质（如活性炭、陶瓷颗粒）接触，酶分子通过吸附作用与载体物质结合。
2. 凝胶固定化：将酶溶液与凝胶物质（如明胶、琼脂）混合，酶通过物理交联或化学交联与凝胶物质牢固结合。
3. 包埋固定化：将酶溶液与聚合物物质（如聚乙烯醇、明胶）混合，然后通过共混或交联反应，使酶被包裹在聚合物内部。
4. 共价固定化：将酶溶液与活性基团多的载体物质（如硅胶、纳米颗粒、聚乙二醇）反应，形成酶与载体物质之间的共价键连接。
5. 薄膜固定化：在载体表面形成一层薄膜，然后将酶与薄膜固定在一起，常见的方法有溶液浸渍、层层自组装等。
这些方法各有优缺点，选择合适的固定化方法应根据具体的酶性质、应用需求和实际操作条件进行综合考虑。
固定化酶的三种方法
固定化酶的三种方法固定化酶是把酶结合到一定的表面上，使其失去活性的过程，因此可以用来改变酶的性质、增加酶的稳定性和提高酶的反应效率。
固定化酶的三种方法是物理化学固定化、生物化学固定化和免疫化学固定化。
一、物理化学固定化物理化学固定化是一种将未固定化酶与支架分子相互作用，使酶与支架分子结合，形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是通过多种物理、化学或生物学方法，将酶与支架分子进行结合，从而形成一个可操作的固定化酶系统。
物理化学固定化可以大大提高酶的反应活性、稳定性和重复利用性，并可以改变酶的特性。
常用的物理化学固定化方法有水解结合、热结合、冷结合、电结合、化学结合、离子结合和生物结合等。
二、生物化学固定化生物化学固定化是指将酶与生物聚合物结合，使酶形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是在酶表面分子和支架分子之间形成一种亲和力，使得酶和支架分子之间形成紧密的结合。
生物化学固定化的优势在于，它可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作，而且不必进行大量的实验，可以节省时间和费用。
常用的生物化学固定化方法有抗体结合法、抑制剂结合法和蛋白结合法等。
三、免疫化学固定化免疫化学固定化是一种将酶与抗体结合，形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是将酶和抗体进行结合，从而形成一个稳定的固定化酶系统。
免疫化学固定化具有较强的特异性，可以在具有极强抗性的环境中实现高效固定化；且不仅能实现酶的固定化，还可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作。
常用的免疫化学固定化方法有免疫结合法、单克隆抗体结合法和抗体体外表达法等。
综上所述，固定化酶的三种方法是：物理化学固定化、生物化学固定化和免疫化学固定化。
它们可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作，提高酶的反应活性、稳定性和重复利用性，从而更好地满足人们在实验中的需求。
固定化酶的方法和应用
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶催化系统的过程。
通过固定化，可使酶的活性和稳定性得到提高，并能够重复使用。
常用的固定化酶方法包括吸附法、共价连接法、包埋法和交联法等。
1. 吸附法：利用载体表面与酶相互吸附的原理将酶固定在载体表面。
常用的载体包括硅胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
2. 共价连接法：通过将酶分子与载体分子之间的化学键共价连接，在载体表面上固定酶。
常用的共价连接剂包括辛二酸二酐、戊二酸二酐等。
3. 包埋法：将酶包裹在聚合物中，在聚合物内部形成微观环境，保护酶免受外界环境的影响。
常用的包埋材料包括明胶、蛋白质和聚乙烯醇等。
4. 交联法：将酶和载体分子之间形成交联结构，将酶牢固地固定在载体表面上。
常用的交联剂包括戊二醛、葡萄糖等。
固定化酶在生物技术、食品工业、医药工业等领域有着广泛的应用。
其中，利用固定化酶在生物技术领域中最为突出。
例如，固定化酶可以应用于产生大量纯度高的特定酶，用于DNA重组、制备抗体和识别特定分子等。
此外，在医药工业中也广泛使用固定化酶，如利用固定化酶制备药物、检测生物标志物等方面。
在食品工业中，固定化酶可用于生产乳制品、果汁、啤酒等食品中。
总之，固定化酶是一种重要的生物技术手段，具有广泛应用前景，可推动生物技术、食品工业、医药工业等领域的发展。
食品酶学(酶固定化技术)
微胶囊包埋法： • 包埋法
包埋法的特点是:
微胶囊包埋法按制作特征不同，分界面聚合法、界面沉淀格内 乳化法。 A 不影响酶蛋白分子的结构和空间构型 , 固定
或包埋在高分子半通透膜中, 将酶蛋白控制在一个半封 ① 界面沉淀法： 利用某些高分子聚合物在水相和有机相的界面上溶 化的酶活收率高。 闭的空间，这种固定化方法即为包埋法。
一、 酶固定化方法 / 技术
•
• • • • • 按固定化反应类型分, 酶固定化方法分以下四种 吸附法 共价法 交联法 包脉法 近年来人们将吸附法和交联法结合起来，建立了 吸附－交联法
一、 酶固定化方法 / 技术
1 吸附法固定化技术 常用的固定化载体 : • 此法是酶固定化研究最早的方法 , 以吸附剂作 载体, 利用物理吸附的原理,对酶蛋白进行固定 高岭土、磷酸钙凝胶、多孔玻璃、羟基磷灰石; 化的一种方法。 DEAE-SephadexA50, SephadexA25, DEAE-纤维 • 此法的优点是: 素等。 • 固定化酶的制备简单; • 酶固定化载体的再生方便; • 缺点: • 酶与载体的结合不牢固 , 在固定化酶的应 用过程中, 受到介质的 pH、离子强度、反应温 度等因素的影响。
二、 固定化酶的性质
• 由于固定化酶由可溶性状态，变为不溶性状态，酶蛋 白的一系列酶学特性都要受到不同程度的影响。
• ① 酶的活力
• ② 最适温度 • ③ 最适pH • ④ 稳定性 • ⑤ Km
一、 酶固定化方法/技术
3 吸附－交联法固定化技术 • 吸附－交联法是将吸附法和交联法结合起来， 建立的一种良好方法，两种方法的结合，在一 定程度上克服了2种方法的不足。 ① 吸附法酶与载体结合不牢固； ② 交联法酶与载体交联效率低； ③ 交联法载体局限性；
第五章-固定化酶
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
酶固定化技术
酶固定化技术酶固定化技术是通过物理或化学的方法将酶连接在一定的固相载体上成为固定化酶，从而发挥催化作用。
固定化后的酶在保持原有催化活性的同时，又可以同一般催化剂一样能回收和反复使用，可在生产工艺上实现连续化和自动化，更适应工业化生产的需要。
固定化酶（immobilized enzyme）不溶于水的酶。
是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。
酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。
便于运输和贮存，有利于自动化生产。
固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。
固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。
酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。
物理方法包括物理吸附法、包埋法等。
物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。
但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。
化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法.。
酶工程制药—固定化酶技术
固定化技术 海藻酸钙包埋法装置 将水溶性的海藻酸钠配成水溶液， 并把酶或细胞分散在其中，然后 将其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶液），使海藻酸钠中的Na+， 部分被Ca2+所取代而形成由多 价离子交联的离子网络凝胶。
（3）角叉菜胶包埋法 角叉菜，属褐藻门，杉藻科，角叉菜属， 自然分布于大西洋沿岸和我国东南沿海 以及青岛、大连等海域，是中国的一种 重要经济海藻。角叉菜不仅是卡拉胶生 产的重要原藻，而且近年来越来越多地 应用于医药领域，引起人们的广泛关注。
交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作 用，制成网状结构的固定化酶的方法。 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺 丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广 泛的是戊二醛。 戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶 或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫 （Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联， 制成固定化酶或固定化菌体。
固定化技术 （1）琼脂凝胶包埋法 将一定量的琼脂加入到一定体积的水中，加热使之溶解，然后冷却至48~55°C，加入 一定量的酶液，迅速搅拌均匀后，趁热分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球 状固定化细胞胶粒，分离后洗净备用。 缺点：机械强度较差，底物、产物扩散困难，故使用受限制
（2）海藻酸钙凝胶包埋法 称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，经杀菌冷却后，与一定 体积的酶液或细胞混合均匀，然后用注射器或滴管将冷凝悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中。 优点：操作简便、条件温和，对细胞无毒害，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径。 使用时注意控制培养基中磷酸盐的浓度，维持一定的钙离子浓度。
课堂总结
固定化酶的特点
固定化技术与固定化酶概述
引入
固定化生物技术 通过化学或物理的手段将酶或游 离细胞定位于限定的空间区域内， 使其保持活性并可反复利用。
酶的固定化方法
酶的固定化方法1. 基本介绍酶的固定化技术是将活性酶分子吸附到不溶性载体上的技术，这些载体包括有机支架，金属合金，无机型号，复合支架，生物大分子和石墨。
与溶液型酶相比，固定化酶具有良好的耐热性，耐久性和稳定性。
可以在恒定的温度和pH值下多次重复使用，这使得固定化酶可以广泛应用于生物工程，食品技术和保健产品的制备中。
2. 固定化酶的优势（1）保持酶活性。
固定化酶能够有效地防止反应补充的游离酶的出现，充分保持其最初的功能和活性，极大地提高了反应中酶的活性和稳定性；（2）提高回收率。
固定化酶具有彼此独立的结构，可以在反应中迅速回收，特别是对于产物特性复杂的反应；（3）可扩展性强。
固定化酶可以根据应用环境的不同和操作条件的可控性，调整载体的参数；（4）可以重复使用。
固定化酶可以多次使用，可以充分利用其过程效率，减少反应次数，降低成本，提高产物纯度；（5）灵活性好，操作更加简单。
当需要调节反应中的酶功效时，可以通过简单的调节载体参数来控制。
3. 固定化酶的技术原理固定化酶主要是通过生物相容性，物理锁定，化学结合和选择性结合四种技术原理。
（1）生物相容性原理。
根据酶的物理化学性质，通过将酶与具有吸附效果的固定化载体搅拌至溶解，使酶外部改变，从而结合到固定体上，形成固定化酶。
（2）物理锁定原理。
通过将因子与特定形状的载体结合，物理力把酶和载体牢牢地结合在一起，形成固定化酶。
（3）化学结合原理。
通过改变因子的外部，形成含有非共价或共价结合的表面带正或负电荷，从而使酶能够结合至具有与之相匹配的电荷的固定体上，形成固定化酶。
（4）选择性结合原理。
通过给载体表面施加疏水或疏水性物质，形成选择性的活性基团，使载体具有低特异性，从而将酶与相应特异性表面结合，形成固定化酶。
4、固定化酶的方法固定化酶有多种固定化方法，如电冻定，脂质包覆，杂化，冻胶，结合支架和表面修饰等。
（1）电冻定：电冻定是一种通过电泳技术将酶通过载体电泳固定在离心管内壁上的一种方法。
固定化酶技术
1.4交联法 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白 之间的交联，使酶分子和多功能试 剂之间形成共价键，得到三向的交 联网架结构，除了酶分子之间发生 交联外，还存在着一定的分子内交 联。多功能试剂制备固定化酶方法 可分为：(1) 单独与酶作用；( 2) 酶 吸附在载体表面上再经受交联；( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功 能团的载体，再连接酶。交联剂的 种类很多，最常用的是戊二醛，其 他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二 联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。 交联法的优点是酶与载体结合牢固， 稳定性较高；缺点是有的方法固定 化操作较复杂，进行化学修饰时易 造成酶失活。
用固定化酶处理受污染水体中的农药也取 得了很好的效果。
用聚丙烯负载二氧化钛膜固定农药降解酶， 降解农药甲基对硫磷。研究发现，甲基对 硫磷在30 min 内降解了70%以上。尤其等 以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，固定 化真菌漆酶对农药氯苯嘧啶醇进行降解。 研究认为，在酸性条件下，固定化漆酶对 氯苯嘧啶醇具有良好的降解作用。
4.2.3 其他应用
CO2是一种重要的温室气体。目前全球每 年排放的数十亿吨CO2需要得到妥善的处 置。固定化酶技术在固定CO2方面也取得 了成果。据报道，以工业固体废弃物为原 料， 利用固定化碳酸酐酶和超重力强化反 应可得到CO2的有效固定 固定化酶技术在清洁生产领域具有潜在的 应用价值。固定化的木聚糖酶和漆酶用于 纸浆漂白， 可以避免产生传统造纸工艺过 程中用氯漂白产生的难以生物降解的各类 氯代有机物。
包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等 多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法 比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低， 但此法对大分子底物不适用。
(1)网格型 将酶包埋在凝胶细微网 格中，制成一定形状的 固定化酶，称为网格型 包埋法。也称为凝胶包 埋法。
酶的固定化技术
（3）溴化氰法
对于带-OH的载体如葡萄糖、纤维素、琼脂 糖来说是最常用的反应。在碱性条件下载体 -OH和BrCN反应生成极活泼的亚氨基碳酸酯 衍生物，它们在碱性条件下可与酶的氨基进 行共价偶联反应。
OH CNBr（ 碱 性 ）
R OH
碱性
O
R O
NH +ENZ
N
O R
水
OH
O R
OH O
R O
O R
五、如何进行酶固定化
吸附法、包埋法、结合法、交联法
固定化酶的模式图
（一）吸附法
定义；利用各种固体吸附剂将酶或含酶细胞 吸附在其表面上而使酶固定的方法称为物理吸
附法，简称吸附法。
常用的吸附剂：活性炭、氧化铝、硅藻土、 多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
▪优点：操作简便、条件温和、不易变性失活、 载体廉价、可反复使用。 ▪缺点：酶与载体结合不牢固，易脱落。
R-O-CH2 –CONH2-NH2 +HNO2 R-O-CH2 –CON3 +H2O
R-O-CH2 –CON3 +E-NH2 R-O-CH2 –CON3 +E-OH R-O-CH2 –CON3 +E-SH
R-O-CH2 –CONH-E R-O-CH2 –CO-O-E R-O-CH2 –CO-S-E
优点 条件温和、操作简便、活力损失少。 缺点 酶与载体结合不牢固，使用时需严格控
酶固定化的原理
酶固定化的原理
酶固定化是指将酶固定在载体上，形成酶固定化系统，用于生物催化反应。
其原理是将酶与载体通过物理或化学方法结合在一起，形成稳定的酶固定化系统，以提高酶的稳定性、重复使用性和操作性。
酶固定化的原理主要包括以下几个方面：
1. 物理方法：通过吸附、离子交换和包埋等物理方法将酶固定在载体上。
例如，将酶溶液与载体接触，通过物理吸附作用使酶附着在载体表面，形成酶固定化系统。
2. 化学方法：通过共价结合、交联和胶束等化学方法将酶固定在载体上。
例如，将酶与载体表面的功能基团发生共价键结合，形成稳定的酶固定化系统。
3. 复合方法：物理和化学方法可以结合使用，形成更稳定的酶固定化系统。
例如，先用物理方法将酶吸附在载体上，然后再进行化学修饰，增强固定效果。
酶固定化的原理主要是利用载体提供的稳定性和大面积接触酶的功能，从而增强酶的稳定性和重复使用性。
载体可以是天然的（如纤维素、凝胶等）或人工合成的（如高分子材料、纳米材料等）。
通过固定化酶，可以将其应用于工业生产中，提高反应效率，降低成本。
酶的固定化技术及其应用
酶的固定化技术及其应用
1 固定化酶
固定化酶（Enzyme immobilization）是指将酶物质由可溶解状态
变为固体状态，可以将活性较弱、易水解的酶，其重复利用、反应时
间长等优点而被广泛应用。
固定化酶的方法有很多，比如粒子固定化、介孔固定化、水膜固
定化、络合固定化、键合固定化和分子印迹固定化技术等等。
它们之
间的差异在于固定化酶对酶的原始活性变化情况。
2 固定化酶的应用
固定化酶除了具有重复利用、反应时间长等普遍优点外，还可以
应用于多种领域，比如医疗诊断、分析检测、药物合成、制药工业等，深受科研和工业界的重视。
固定化酶在药物合成中，用于集中化学反应、启动物料的转化，
可以有效提高反应产率，减少有害物质的排放，从而获取纯度较高的
有效成分，在药品工业中可实现大规模的批量生产，降低成本。
此外，固定化酶还可用于环境污染问题，比如某些微生物中含有
放射性元素，可使用固定化酶将其净化，解决环境污染的问题，维护
环境健康。
同时，固定化酶还有广泛的应用于食品工业、饮料工业、制糖、
乳品加工以及有机合成等领域中，为生产过程提供工艺改进和工艺优
化技术。
3 总结
固定化酶是将酶物质由可溶解状态变为固体状态，应用技术繁多，在医疗诊断、药物合成、制药工业等多个领域发挥着重要作用。
未来，随着固定化酶技术的发展，它在医药、食品、生物工程和环保等领域
的应用将更加广泛。
酶的固定化技术
5、热处理法
将含酶细胞在一定温度下加热处理一段
时间，使酶固定在菌体内而制备得到的固定
化菌体。
只适用于热稳定性较好的酶的固定化。
32
6.1.5 固定化酶操作的注意事项(★)
• 活性中心
• 功能基团
• 酶的高级结构
33
6.1.6 固定化酶的制备原则(★)
原则1、2
1、必须注意维持酶的催化活性及专一性。 2、有利于生产自动化、连续化，用于固定化的
Chapter 6 Enzyme and Cell Immobilization 第六章 酶与细胞固定化
Contents of chapter 6
1、固定化酶的概述 2、固定化酶的性质
3、固定化酶的应用
4、细胞、原生质体的固定化
2
6.1 固定化酶的概述
6.1.1 什么是固定化酶？
1. 固定化酶 (immobilized enzyme) ：固定在
常用的载体有活
性炭、多孔陶瓷、多
孔玻璃、硅胶、淀粉、 谷蛋白、单宁、纤维
素衍生物等。
13
1、物理吸附法
优点：操作简便，条件温和，载体廉价易
得，可反复使用。
弱点：结合力较弱，酶与载体结合不牢固，
易脱落。
14
2、结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离
子键与酶结合在一起的固定化方法(★) 。
15
2、结合法
8
6.1.3 固定化酶的研究历史
在 1971 年，确定固定化酶的统一英文名称为
Immobilized enzyme。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。
1973年，固定化大肠杆菌菌体。
70年代后期，出现了固定化细胞技术。
第三节酶的固定化
第三节酶的固定化随着酶学研究的深入和酶工程的发展，酶的应用越来越广泛。
将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不稳定性，具有可反复或连续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。
一、固定化酶的制备方法制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交联法等（图2-3）。
1．包埋法将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。
凝胶包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。
最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。
微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。
常用的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。
2．吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。
吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。
吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，而且可反复使用。
但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不太牢固而易脱落。
3．共价偶联法利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。
这种方法的优点是酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。
缺点是制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活。
共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。
4．交联法交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之间发生交联作用而制成固定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。
其中应用最广泛的是戊二醛。
用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。
固定化酶技术在工业生产中的应用
固定化酶技术在工业生产中的应用固定化酶技术是指将酶固定在载体上，形成固定化酶，在工业生产中应用广泛。
相比自由酶，固定化酶有很多优点，例如稳定性和重复使用性强，能够降低生产成本和环境污染，提高生产效率等。
下面本文将从固定化酶技术的概念、优点、应用以及未来发展等方面来阐述其在工业生产中的应用。
一、固定化酶技术的概念固定化酶技术是一个将酶固定到载体上，形成固定化酶的过程。
这种酶的形式可以是不同的，如固态酶或糖基载体。
使用固定化酶可以带来很多优点，如稳定性、重复使用性、环保、酶失活率低等，从而带来经济效益等显著效果。
固定化酶技术的应用范围非常广泛，包括医药、食品、工业生产等领域。
二、固定化酶技术的优点1、稳定性相比自由酶，固定化酶由于可以固定在载体上，因此可以提高酶的稳定性。
酶与载体形成的复合结构，可以使酶受到保护，减少不必要的结构或功能的损失，使酶的特殊性质更好地发挥，避免了一些化学反应和粘性的问题。
2、重复使用性固定化酶技术具有较高的重复使用性，而自由酶只能使用一次，因此，固定化酶更优越，在使用过程中，更可以起到长时间的使用和连续生产的作用，可降低生产成本，提高经济效益。
3、环保相比自由酶，固定化酶对环境污染要小得多。
自由酶使用后，会在环境中分解，产生污染。
而固定化酶则将酶固定在载体上，可以重复使用，不污染环境。
4、降低酶失活率自由酶使用过程中，受到温度、PH值等因素的影响非常大，会使酶失活，效果大打折扣。
而固定化酶则对外界因素的敏感性较低，因此失活率低，保证了其稳定性和生产效率。
三、固定化酶技术在工业生产中的应用1、生物质转化生物质转化在生物化学制药、生物化工和农业生产等领域中具有重要的地位和广阔的应用前景。
它是利用生物体无机盐、有机质分泌的酶来进行的。
在生物质转化生产过程中，固定化酶技术的应用变得越来越普遍和重要。
例如：在木质素降解中，采用固定化酶可以大幅度提高木质素的酶解效率和催化活性，因为固定化酶可以提高酶附着的载体稳定性和活性，使其能够持续进行反应，有效提高产量和质量。
第十三章 酶固定化
烷基化法
含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化， 然后与酶分子上的氨基、巯基、羟基发生烷基化反应， 制备固定化酶
共价结合法
特点：
优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连
续使用。
缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而
影响酶的催化活性。
4、交联法
定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间进行交 联反应，制备固定化酶的方法。 常用试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等双功能试剂。 特点：
喷雾干燥 淀粉 淀粉酶 液化液 糖化酶 糖化液 结晶 异构酶 结晶葡萄糖 果糖42% 葡萄糖55% 低聚糖 高果糖浆 果糖浆 果糖80-90% 果糖55% 葡萄糖39% 低聚糖 氢化还原 粉状葡萄糖 山梨醇
果葡糖浆 混合
分离
天门冬氨酸酶 青霉素酰化酶 延胡索酸酶 β-半乳糖苷酶 天门冬氨酸-β-脱羧酶 脂肪酶
各种固定化方法的优缺点比较
固定化方法
结合法 共价键结合法 离子键结合法 制备难易 难 易 包埋 法 吸附法 交联 法
较难
易
较难
结合程度
活力回收 再生 费用 底物专一性
强
低 不能 高 可变
中等
高 可能 低 不变
强
高 不能 低 不变
弱
高， 酶易流失 可能 低 不变
强
中等 不能 中等 可变
三、固定化酶的性质 1、酶的稳定性。
第十三章 酶固定化
第一节 酶的固定化
酶的固定化方法
固定化酶的性质 固定化酶的应用
为什么要将酶固定化？
游离酶在应用中的不足
稳定性较差； 难于回收重复利用；
给后续分离纯化增加困难。
酶的固定化
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。
1）离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。
常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
2）共价键结合法载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括：（1）天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等；（2）有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等（3）无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。
用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有：Asp Glu侧链的—COOH、C-末端的—COOH；Tyr的苯酚基；Cys的—SH；Lys的ε-NH2、N-末端—NH2；Thr、Ser的—OH；His的咪唑基。
在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。
载体活化方法：（1）重氮化法（2）叠氮法（3）溴基化法（4）烷基化法等。
4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。
常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。
其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个—NH2，戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。
交联酶法借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
可视为一种无载体的固定化方法。
如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2～7.2，0℃下交联24h，可制成固定化酶。
共交联法共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。
通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。
如一定量的脲酶加入到2.5mL含6%牛血清蛋白、0.2%戊二醛的0.02mol/L 磷酸缓冲液中，混合均匀后降温至-30℃，再升温至4℃，静置4h，形成泡沫状聚合物，冷冻干燥后，即为固定化酶。
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R-O-CH2 –CON3 +E-NH2 R-O-CH2 –CONH-E R-O-CH2 –CON3 +E-OH R-O-CH2 –CO-O-E R-O-CH2 –CON3 +E-SH R-O-CH2 –CO-S-E
定载体上，在一定空间范围内起催化作用的酶。
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
酶的固定化技术
三、固定化酶的制备原则
✓ 必须注意维持酶的催化活性及专一性 ✓ 固定化应该有利于生产自动化、连续化 ✓ 固定化酶应该有最小的空间位阻 ✓ 酶与载体必须结合牢固 ✓ 固定化酶应有最大的稳定性 ✓ 固定化酶成本要低
酶的固定化技术
（2）界面聚合法： 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合原
理包埋酶。 例：将酶和已二胺的水溶液与葵二酰氯的甲苯溶
液混合，再加SPAN乳化已二胺和葵二酰氯，在水相和 有机相的界面聚合形成包埋酶的颗粒。
酶的固定化技术
（三）结合法
1、离子键结合法 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素。
酶的固定化技术
四、固定化酶的优缺点
优点
➢ 固定化酶可以重复，使用效率高，成本低 ➢ 极易将固定化酶与底物、产物分开； ➢ 在大多数情况下，能提高酶的稳定性； ➢ 具有一定的机械强度可以在较长时间内进行反
复分批反应和装柱连续反应； ➢ 酶反应过程能够加以控制； ➢ 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； ➢ 较游离酶更适合多酶反应； ➢ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ➢ 酶的使用效率提高，成本降低。
酶的固定化技术
（3）溴化氰法
对于带-OH的载体如葡萄糖、纤维素、琼脂 糖来说是最常用的反应。在碱性条件下载体 -OH和BrCN反应生成极活泼的亚氨基碳酸酯 衍生物，它们在碱性条件下可与酶的氨基进 行共价偶联反应。
酶的固定化技术
Байду номын сангаас
OH CNBr（ 碱 性 ）
R OH
碱性
O
R O
NH +ENZ
N
O R
水
OH
O R
OH O
R O
O R
OH
H 2N O 氨基甲酸
O 衍生物
R
OH
亚氨碳酸
O
R
NH
O
酯衍生物
NH
N H ENZ 异脲型
亚氨碳酸酯型
N ENZ
O
氨基甲酸酯型
N H ENZ
酶的固定化技术
（4）烷基化法
含羟基的载体可用三氯-均三嗪、溴乙酸溴等 多卤代物活化。活化载体上的卤素基团可与 酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基化 反应，制备固定化酶。
附法，简称吸附法。
常用的吸附剂：活性炭、氧化铝、硅藻土、 多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。 ▪优点：操作简便、条件温和、不易变性失活、 载体廉价、可反复使用。 ▪缺点：酶与载体结合不牢固，易脱落。
酶的固定化技术
（二）包埋法
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载 体中，使酶固定化的方法称为包埋法。 根据包埋的材料和包埋方法的不同，可分 为：凝胶包埋法和半透膜包埋法两类。
氮化合物。活泼的叠氮基团可与酶分子中的NH2形成肽键，此外叠氮基团还可与酶分子中的 -OH、-SH等反应。使酶固定化。如：
酶的固定化技术
如：
CMC(羧甲基纤维素)
R-O-CH2 –COOH +CH3OH R-O-CH2 –COOCH3 +H2O R-O-CH2 –COOCH3 +NH2-NH2 R-O-CH2 –CONH2-NH2 + CH3OH
优点 条件温和、操作简便、活力损失少。 缺点 酶与载体结合不牢固，使用时需严格控
制好pH值、离子强度、温度等操作条件。
酶的固定化技术
2、共价键结合法
★通过共价键使酶与载 体结合的固定化方法。 载体主要有：纤维素、 琼脂糖凝胶、葡聚糖凝 胶、甲壳质、氨基酸共 聚物、甲基丙烯醇共聚 物等。 ※载体→活化→活化载体 基团＋酶分子基团
酶的固定化技术
（1）重氮法
适用于含有苯氨基的不溶性载体 载体先在稀HCl和亚硝酸钠中进行重氮反应，然后再
在温和条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基或咪
唑基进行偶联。
Tyr含量高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性 磷酸酶、β-葡萄糖苷酶可与多种重氮化载体连接。
酶的固定化技术
（2）叠氮法
含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠
酶的固定化技术
缺点
• 固定化时，酶活力有损失； • 工厂初始投资大； • 只能用于可溶性底物； • 胞内酶必须经过酶的分离。
酶的固定化技术
五、如何进行酶固定化
吸附法、包埋法、结合法、交联法
酶的固定化技术
固定化酶的模式图
酶的固定化技术
（一）吸附法
定义；利用各种固体吸附剂将酶或含酶细胞 吸附在其表面上而使酶固定的方法称为物理吸
酶的固定化技术
1、凝胶包埋法
❖将酶分子包埋在凝胶格子里。
❖凝胶包埋法用得最多、最有效，但不适用于底物或产 物分子很大的酶类的固定化。
条件温和，操作简便，对酶活 影响小，但强度差。
天然凝胶： 琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、
包埋材料
角叉菜胶、明胶等；
合成凝胶：聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等
强度高，对温度、pH值变化耐受性强， 需要特定的聚合条件，酶易变性。
酶的固定化技术
酶的固定化技术
主要内容
为什么要固定化 什么叫做固定化 如何固定 固定化的酶活力测量 固定化酶的特征 固定化酶的应用
酶的固定化技术
一、为什么要对酶进行固定化？
1、稳定性差 2、回收困难，一次使用 3、产物的分离纯化困难
酶的固定化技术
二、什么是固定化酶
固定化酶（Immobilized enzyme） ：固定在一
酶的固定化技术
2、半透膜包埋法（微囊化法）
将酶包埋在有各种高 分子聚合物制成的小 囊中，制成固定化酶。 半透膜：聚酰胺膜、 火棉胶膜等。 适用于底物和产物都 是小分子的酶的固定 化。
酶的固定化技术
制备方法：
（1）界面沉淀法： 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶 解度极低而形成皮膜将酶包埋。 例：先将含高浓度的酶液在与水互不相溶的 有机相中乳化形成油包水的微滴,再将高聚物 加入乳化液中,然后使高聚物在油水界面沉淀 析出,形成膜,将酶包埋,最后移入水相中。 此法条件温和,酶失活少,但是要除去膜上残 留有机溶剂很麻烦。