桦褐孔菌多糖的乙酰化修饰及其抗氧化活性

桦褐孔菌多糖的乙酰化修饰及其抗氧化活性邵珠领;吴艳丽;张宇;王宇亮;赵宏;赵芷萌【摘要】采用乙酰化修饰方法对桦褐孔菌多糖进行结构修饰,并评价其抗氧化活性,为桦褐孔菌多糖结构修饰提供新的思路和方向.以桦褐孔菌为原料,采用水提醇沉法提取桦褐孔菌多糖,过AB-8大孔吸附树脂,得纯化后的桦褐孔菌多糖.在氢氧化钠水溶液中以不同体积的乙酸酐制备乙酰化桦褐孔菌多糖,盐酸羟胺比色法测定其取代度.在此基础上,对3种不同取代度的乙酰化桦褐孔菌多糖进行抗氧化活性研究.结果表明,桦褐孔菌多糖经纯化后,通过乙酰化修饰得到三个取代度分别为0.2810、0.3136、0.4072的乙酰化产物,随着乙酰化试剂的体积增加,多糖取代度逐渐增大;三个不同取代度的乙酰化产物对DPPH自由基最大清除率分别为71.8％、74.9％、78.5％;对超氧阴离子的最大清除率分别为71.8％、74.9％、78.5％;对羟基自由基的最大清除率分别为74.5％、79.9％、81.1％.随着取代度的增加,乙酰化桦褐孔菌多糖抗氧化活性逐渐增强.桦褐孔菌多糖经乙酰化修饰后,可显著提高体外抗氧化活性,且抗氧化活性的强弱与乙酰基取代度有关.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2019(040)009【总页数】5页(P73-77)【关键词】桦褐孔菌;多糖;乙酰化;抗氧化活性【作者】邵珠领;吴艳丽;张宇;王宇亮;赵宏;赵芷萌【作者单位】黑龙江省新药创制与药效毒理评价重点实验室,佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;生命科学与环境科学研究中心,哈尔滨商业大学,黑龙江哈尔滨150070;黑龙江省新药创制与药效毒理评价重点实验室,佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;黑龙江省新药创制与药效毒理评价重点实验室,佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;黑龙江省新药创制与药效毒理评价重点实验室,佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;黑龙江省新药创制与药效毒理评价重点实验室,佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007【正文语种】中文【中图分类】TS201.1桦褐孔菌Inonotus obliquus(Fr.)Pilat属担子菌亚门层菌纲锈革孔菌目锈革菌科褐卧孔菌属[1]。

桦褐孔菌主要分布在北半球北纬 40～50°的地区,如北美(北部)、芬兰、波兰、俄罗斯(西西伯利亚、远东部分地区、堪察加半岛)、日本北海道等国家和地区[2]。

我国桦褐孔菌主要分布在吉林长白山地区、黑龙江大小兴安岭以及内蒙古等地[3]。

桦褐孔菌具有降血糖、降血脂、免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗寄生虫等多种药理活性,而其大部分生物活性与其中的多糖成分密切相关[4]。

多糖结构的化学修饰主要是利用多糖分子中的羟基、羧基、氨基等活性基团进行化学反应以引入新的基团,如硫酸基、磷酸基、羧甲基、烷基等[5]。

多糖的乙酰化是一种重要的多糖修饰方法。

乙酰基的引入使分子的伸展状态发生变化,导致多糖极性基团暴露,增加了多糖在水中的溶解性,同时乙酰基的数量和位置对多糖活性也有显著影响[6]。

真菌多糖的生物活性与其结构密切相关,经化学修饰后,可能会提高多糖抗氧化、降血糖等作用[7-8]。

杨春瑜等研究发现,对黑木耳多糖进行乙酰化修饰后,其抗氧化活性增加[9]。

李淑琴等研究表明,乙酰化乌龙茶多糖溶解性增强,还原活性显著提高[10]。

目前的文献对研究桦褐孔菌多糖的研究主要集中在提取分离等方面[11-12],关于其乙酰化修饰及其修饰后活性的研究还未见报道。

因此,本文以乙酸酐作为酰化试剂，对提取纯化后的桦褐孔菌多糖进行乙酰化修饰，并评价其抗氧化活性,为桦褐孔菌多糖抗氧化活性的构效关系研究和资源开发利用提供参考。

1 材料与方法1.1 材料与仪器桦褐孔菌购自黑龙江省佳木斯市亮子河山特产店；苯酚、氢氧化钠、浓盐酸、盐酸羟胺、三氯化铁、无水乙酸钠、三氯甲烷、正丁醇、浓硫酸、乙酸酐、无水乙醇均为国产分析纯;葡萄糖、氯化乙酰胆碱购自阿拉丁生化科技股份有限公司;透析袋Mw3000 购自源叶生物科技有限公司。

FDU-1200冷冻干燥机日本东京理化;RE-2000A旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;DL-5-B 低速多管离心机上海安亭科学仪器厂;765紫外可见分光光度计上海仪电科学仪器股份有限公司;DBS100 自动馏分收集器上海嘉鹏科技有限公司;Vortex-1/2 涡旋混合器上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.2 实验方法1.2.1 桦褐孔菌多糖的提取桦褐孔菌菌体粉碎后过80目筛,25 ℃条件下用95%乙醇浸泡1 d,减压过滤,滤饼(半径:7 cm,高:3 cm)50 ℃烘干24 h后备用。

取一定量烘干后的桦褐孔菌滤饼加入5倍体积的双蒸水95 ℃浸提3 h[11],过八层纱布保留滤液,滤渣重复提取一次,合并滤液,减压浓缩。

浓缩液加入一定量的乙醇,使乙醇浓度达到80%,充分搅拌后放入4 ℃冰箱中醇沉12 h。

25 ℃,4000 r/min离心10 min,收集沉淀,依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤沉淀3次,130 Pa 45 ℃真空干燥12 h后得到桦褐孔菌粗多糖。

按照以下公式来计算桦褐孔菌多糖的得率。

得率1.2.2 桦褐孔菌多糖的纯化取真空干燥后的桦褐孔菌粗多糖适量,使用双蒸水配制成10%多糖溶液,按体积比1∶4加入Sevag试剂,充分振荡30 min后静置4 h。

4000 r/min 25 ℃离心15 min,弃去下层蛋白,重复上述操作,紫外扫描检测,直至桦褐孔菌多糖溶液在260和280 nm波长处无明显紫外吸收,表示溶液中游离蛋白质类杂质已除尽。

将脱蛋白后的多糖溶液55 ℃条件下减压浓缩至原溶液1/3后冷冻干燥,得到桦褐孔菌粗多糖。

取5 g脱蛋白的桦褐孔菌粗多糖溶于10 mL双蒸水中,4000 r/min 25 ℃离心15 min后,取上清液在已准备好的AB-8大孔树脂柱上进行上样。

吸附24 h后用双蒸水进行洗脱,自动馏分收集器收集洗脱液,采用苯酚-硫酸法在490 nm波长(紫外可见分光光度计)隔管检测吸光度,合并洗脱液。

洗脱液55 ℃条件下减压浓缩至原溶液1/3后透析(44 mm),冷冻干燥得到纯化后的桦褐孔菌纯化多糖。

纯化后的桦褐孔菌多糖以D-葡萄糖为标准品,采用苯酚-硫酸法测定其总糖含量。

1.2.3 桦褐孔菌多糖的乙酰化修饰取0.5 g桦褐孔菌纯化多糖溶于10 mL三蒸水中,用3%的氢氧化钠调节溶液pH至11.0。

30 ℃油浴下,分别交替加入氢氧化钠溶液和乙酸酐各1 mL,控制反应溶液pH在7.0～11.0,直至加完乙酸酐。

30 ℃条件下维持搅拌3 h(pH=8)。

反应结束后,用1 mol/L盐酸中和反应溶液(pH=7),将反应液置于自来水中透析48 h,三蒸水中透析24 h。

将透析液减压浓缩,冷冻干燥后得到乙酰化桦褐孔菌多糖[13]。

另取两份相同量的桦褐孔菌纯化多糖,加入乙酸酐的量分别为2、3 mL,其余实验条件不变。

1.2.4 傅里叶红外光谱分析取纯化桦褐孔菌多糖与加入1 mL乙酸酐乙酰化后得到的桦褐孔菌多糖各2 mg,采用溴化钾压片法,使用傅里叶红外光谱仪在400～4000 cm-1范围内进行光谱扫描。

1.2.5 乙酰基取代度的测定1.2.5.1 标准曲线的绘制用0.001 mol/L醋酸钠溶液将氯化乙酰胆碱标准品配制成浓度为1.064 mg/mL的溶液。

精密移取氯化乙酰胆碱标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于试管中,加水至1 mL,加入2 mL碱性羟胺溶液,涡旋混合器混合均匀,于25 ℃放置4 min,加入1 mL 4 mol/L盐酸(pH为1.2±0.2),加入1 mL 0.37 mol/L三氯化铁-盐酸溶液,摇匀后在540 nm波长测定其吸光度。

同步做上述各个标准系列溶液的空白对照,先加入盐酸后加入碱性羟胺,其余步骤与上述相同。

1.2.5.2 取代度测定取桦褐孔菌多糖乙酰化溶液1 mL按照标准溶液的操作方法进行测定。

根据标准曲线得到乙酰化桦褐孔菌多糖的乙酰基质量M1,按照以下公式计算出三个不同取代度的乙酰化桦褐孔菌多糖的取代度[14]。

乙酰基百分含量(W,%)=M1/M2×100取代度式中：M1-乙酰化桦褐孔菌多糖中乙酰基的质量(mg);M2-乙酰化桦褐孔菌多糖的质量(mg);162-葡萄糖相对分子质量;43-乙酰基相对分子质量;1-氢原子相对原子质量。

1.2.6 体外抗氧化活性研究1.2.6.1 DPPH自由基清除率的测定取3种不同取代度,不同浓度的桦褐孔菌乙酰化多糖及纯化后桦褐孔菌多糖样品溶液3 mL,加入新鲜配制的DPPH-乙醇溶液1 mL,涡旋混合器混合10秒,25 ℃水浴避光反应30 min,在517 nm处测定吸光度;以VC为阳性对照,同时测定空白组(样品不加DPPH)和阳性对照组样品吸光度。

按如下公式计算对DPPH自由基清除率。

DPPH·清除率(%)=1-(A1-A2)/A0)×100式中:A0-无样品溶液吸光度值；A1-样品溶液的吸光度值;A2-无DPPH样品溶液的吸光度值。

1.2.6.2 超氧阴离子清除率的测定在试管中分别加入3 mL 0.05 mol/L Tris-HCl溶液及不同浓度的桦褐孔菌多糖和不同浓度、不同取代度的乙酰化桦褐孔菌多糖,25 ℃水浴10 min。

加入0.03 mol/L预热的邻苯三酚12 μL反应4 min。

在320 nm处测吸光度。

Tris-HCl溶液和VC分别作为空白和阳性对照组。

按以下公式来计算超氧阴离子清除率(%)。

清除率(%)=(A1-A2)/(A1-A0)×100式中:A0-Tris-HCI溶液吸光值;A1-不加样品的Tris-HCI和邻苯三酚溶液的吸光度;A2-样品溶液的吸光度。

1.2.6.3 羟基自由基清除率的测定在试管中依次加入不同浓度、不同取代度的三种乙酰化桦褐孔菌多糖及桦褐孔菌多糖样品溶液1 mL、0.75 mmol/L邻菲罗啉溶液1 mL、0.75 mmol/L硫酸亚铁1 mL、0.01%双氧水1 mL、0.15 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)1.5 mL混匀,室温静置10 min,37 ℃加热1 h,在536 nm波长处测吸光度。

蒸馏水和VC分别作为空白对照和阳性对照,按以下公式来计算羟自由基(·OH)的清除率(%)。

·OH清除率(%)=(A1-A0)/(A2-A0)×100式中:A0-空白组样品溶液吸光值;A1-样品溶液吸光度值;A2-对照品溶液的吸光度(双氧水和样品溶液用蒸馏水来代替)。

1.3 数据分析以上实验均平行进行3次,所得数据经SPSS 19.0 处理,使用Duncan’s检验分析显著性,p<0.05表示差异显著。