桦褐孔菌菌质提取物抗菌活性研究

桦褐孔菌菌质提取物抗菌活性研究郭佳佳;李东文;姚慧莹;谢小梅;苏明声;梁永红【摘要】目的:探讨桦褐孔菌菌质的体外抗菌活性.方法:采用牛津杯法比较桦褐孔菌菌质的水层、正丁醇层、乙酸乙酯层、粗多糖对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌以及白色念珠菌的抑制作用,并与桦褐孔菌菌核比较.通过连续倍比稀释的方法,观察桦褐孔菌菌质不同极性部位提取物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC).结果:桦褐孔菌菌质正丁醇层和乙酸乙酯层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌均具有不同程度的抑制作用.桦褐孔菌菌质正丁醇层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的MIC分别为0.025,0.0125,0.025,0.025 g·mL-1.MBC分别为0.05,0.025,0.1,0.05g·mL-1.桦褐孔菌菌质乙酸乙酯层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的MIC分别为0.0125,0.00625,0.025 g·mL-1,MBC分别为0.025,0.0125,0.05 g·mL-1.结论:桦褐孔菌菌质不同极性部位的提取物对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌具有一定的抑菌和杀菌的活性.【期刊名称】《黑龙江医药》【年(卷),期】2017(030)005【总页数】5页(P949-953)【关键词】桦褐孔菌菌质;牛津杯法;连续倍比稀释法;抑菌与杀菌【作者】郭佳佳;李东文;姚慧莹;谢小梅;苏明声;梁永红【作者单位】江西中医药大学药学院江西南昌330004;江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室,创新药物与高效节能降耗国家重点实验室江西南昌330004;江西中医药大学药学院江西南昌330004;江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室,创新药物与高效节能降耗国家重点实验室江西南昌330004;江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室,创新药物与高效节能降耗国家重点实验室江西南昌330004;江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室,创新药物与高效节能降耗国家重点实验室江西南昌330004;江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室,创新药物与高效节能降耗国家重点实验室江西南昌330004;江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室,创新药物与高效节能降耗国家重点实验室江西南昌330004【正文语种】中文【中图分类】R285桦褐孔菌（Inonotus obliquus(Fr.)Pilat）是一种在俄罗斯，芬兰等国家广泛应用的药用真菌，桦褐孔菌属担子菌亚(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、褐卧孔菌属(纤孔菌属)在俄语中桦褐孔菌被称作chaga[1]。

自16世纪以来，东欧的许多国家民间就开始使用桦褐孔菌的菌核来治疗癌症。

俄罗斯医学研究院证明桦褐孔菌能够治疗胃部和肺部的肿瘤[2]。

然而，目前桦褐孔菌野生资源枯竭，人工驯化栽培尚未成功，液体发酵的发酵条件要求严格、发酵过程容易染菌、设备投资大、且干物质含量低、生产成本高，致使桦褐孔菌资源匮乏。

本实验室已运用中药固体发酵技术，将桦褐孔菌分别接种于多种中药渣基质上进行固体发酵，获得了桦褐孔菌菌质，对该菌质进行了初步化学成分提取分析和药理学作用研究，表明该菌质有较好的开发应用前景。

本实验对该菌质的抗菌作用进行研究，以大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌作为试验菌株来研究比较桦褐孔菌菌质与菌核的抑菌活性，以期为桦褐孔菌的开发利用奠定基础。

桦褐孔菌菌核，延边华夏桑黄菌业有限公司；桦褐孔菌菌质，本实验室发酵；大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌均来自江西中医药大学基础医学院；盐酸左氧氟沙星片，广州某制药厂，批号：1140025；营养肉汤培养基、改良马丁培养基，青岛某生物技术有限公司，批号：HB0108-4、HB5222。

YXQ-LS-100STI立式压力蒸汽灭菌锅，上海某实业有限公司；LRH-150生化培养箱，上海某科技有限公司。

将桦褐孔菌菌质用70%乙醇提取2次，每次2 h，过滤，合并滤液，浓缩后，依次用乙酸乙酯、正丁醇、水进行萃取，得到乙酸乙酯、正丁醇和水层三个部位。

将得到的提取液旋蒸浓缩真空干燥烘干。

粗多糖的制备则采用水提醇沉的方法，真空干燥箱烘干。

桦褐孔菌菌核的提取方法同菌质。

将水提物、正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、粗多糖配制成0.1g·mL-1，阳性药（盐酸左氧氟沙星片）配制成0.01g·mL-1，121灭菌20 min备用。

营养肉汤培养基：取营养肉汤培养基固体18g，加热溶于1000mL的纯化水中，121高压灭菌15min，备用。

改良马丁培养基：取改良马丁培养基固体28.5g，加热溶于1000mL纯化水中，121高压灭菌15 min，备用。

取干净的4支试管，3支分别加入5 mL的营养肉汤培养基1支加入5 mL的改良马丁培养基，硅胶塞封口，121灭菌30 min。

将灭菌的试管在超净工作台放冷后用接种环取适量的4种菌放入试管中，混匀，置于培养箱中培养18-24 h后观察结果，其中大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌放置于37培养箱中，白色念珠菌放置于26.5培养箱中。

取4支无菌试管，分别加入5 mL的无菌生理盐水，用移液枪吸取1 mL活化的菌液，分别倒入试管中，混匀。

再用移液枪吸取300 μL菌悬液至固体培养基中，用涂布器涂布均匀。

用无菌镊子夹取牛津杯放至涂抹均匀菌液的培养基上，使牛津杯与培养基充分接触，不得留有缝隙。

牛津杯放置位置要适中。

每种菌做3个重复。

向各牛津杯中加入150 μL药液后，小心将培养皿放置培养箱中，大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌置于37培养箱，白色念珠菌置于26培养箱中，培养18-24 h，观察其抑菌圈大小，并用直尺量其直径。

将1.6中筛选的具有抑菌作用的提取物进行肉汤稀释法，确定其MIC和MBC。

取无菌试管10支，除第1管加入4 mL的浓度为0.1 g·mL-1提取物外，其余每管加入营养肉汤培养基2 mL（白色念珠菌的加入2 mL的改良马丁培养基），然后吸取第一管2 mL至第2管，混匀后再吸取2 mL至第3管，如此连续倍比稀释至第8管，并从第8管中吸取2mL弃去，第9管为不含药物的生长对照，第10管为不含药液也不含菌的空白对照。

制备菌悬液：将大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，白色念珠菌的菌液浓度调至1*106mL-1。

每支试管加入调整好浓度的菌悬液2 mL，使其终浓度为5*105mL-1，混匀后，放置培养箱培养，16-18 h后观察结果，以肉眼见不到浑浊的那管药物浓度为该药的MIC。

选取MIC结果中，MIC值以及比MIC值浓度高的，未见菌生长的几管含药菌液进行平皿培养，完全未见菌生长的那管对应的浓度即为MBC浓度。

抑菌圈直径的计算采用SPSS19.0软件进行统计学的分析，实验结果以（）表示。

由表1可知，桦褐孔菌菌质的水提物、粗多糖对4种菌均无抑制作用；菌质的正丁醇提取物对4种菌均具有不同程度的抑制作用且对白色念珠菌的抑菌作用最强；菌质乙酸乙酯提取物对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌有显著的抑菌作用。

菌核的水提物对白色念珠菌有抑菌作用；菌核的正丁醇提取物对4种菌均具有抑菌作用，菌核的乙酸乙酯提取物对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌具有抑菌作用；菌核的粗多糖不具有抑菌作用。

桦褐孔菌菌质正丁醇层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的MIC分别为0.025，0.0125，0.025，0.025 g·mL-1，桦褐孔菌菌质乙酸乙酯层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的MIC分别为0.0125，0.00625，0.025 g·mL-1，桦褐孔菌菌核水层对白色念珠菌的MIC为0.025 g·mL-1。

桦褐孔菌菌核正丁醇层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的MIC分别为0.025，0.00625，0.0125，0.05 g·mL-1，桦褐孔菌菌核乙酸乙酯层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的MIC分别为0.025，0.025，0.025 g·mL-1，详见表2至表5。

桦褐孔菌菌质正丁醇层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的MBC分别为0.05，0.025，0.1，0.05 g·mL-1。

菌质乙酸乙酯层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的MBC分别为0.025，0.0125，0.05 g·mL-1。

桦褐孔菌菌核水层对白色念珠菌的MBC为0.1 g·mL-1。

菌核正丁醇层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的MBC分别为0.05，0.0125，0.05，0.1 g·mL-1。

菌核乙酸乙酯层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的MBC分别为0.05，0.1，0.1 g·mL-1，详见表6至表9。

从本实验可得出桦褐孔菌菌质提取物具有抑菌的效果，菌质正丁醇层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的最低MIC分别为0.025，0.0125，0.025，0.025 g·mL-1，MBC分别为0.05 ，0.025 ，0.1，0.05 g·mL-1。

桦褐孔菌菌质乙酸乙酯层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的MIC分别为0.0125，0.00625，0.025 g·mL-1，MBC分别为0.025，0.0125，0.05 g·mL-1。

桦褐孔菌菌核水层对白色念珠菌的MIC为0.025 g·mL-1。

桦褐孔菌菌核正丁醇层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的MIC 分别为0.025，0.00625，0.0125，0.05 g·mL-1，MBC分别为0.05，0.0125，0.05，0.1 g·mL-1。

桦褐孔菌菌核乙酸乙酯层对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的MIC 分别为 0.025，0.025，0.025 g·mL-1，MBC 分别为0.05，0.1，0.1 g·mL-1。

由实验结果可知，桦褐孔菌菌质的抑菌活性与菌核相当，在未来有可能在抗菌活性方面替代菌核。

桦褐孔菌含有多糖、三萜类、色素、生物碱等多种化合物。

有研究表明酚类、多糖、生物碱、香草酸具有抑菌活性。

其酚类发挥抑菌作用主要是通过破坏细胞壁及细胞膜的完整性，促使细胞释放胞内成分从而引起膜的电子传递、营养吸收、核苷酸合成及ATP活性等功能障碍，进而抑制微生物的生长[7]。