常用紫外分光光度法测定蛋白质含量

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紫外分光光度法测定蛋白质含量

紫外分光光度法测定蛋白质含量化学2班李永亮41007061【实验目的】（1）学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；（2）掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术；（3）掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

【实验原理】本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。

蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。

在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。

该测定法具有简单、灵敏、快速高、选择性，且稳定性好，干扰易消除，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，其主要原因有两个：其一对于测定那些与标准蛋白质中赖氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；其二若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。

【实验仪器与试剂】仪器：TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管，胶头滴管试剂：标准蛋白质溶液（3.00mg/mL）,0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液【实验步骤】一、准备工作1、启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。

2、在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。

3、将空白放入测量池中，点击开始扫描空白，点击基线校零。

4、标准曲线的绘制二、测量工作1、吸收曲线的绘制用吸量管吸取2mL3.00mg/mL 标准蛋白质溶液于10mL 比色管中，用0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。

用1cm 石英比色皿，以0.9% NaCl 溶液为参比，在190 nm ～400nm 区间，每隔2nm 测量一次吸光度，记录数据。

2、标准曲线的制作用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 3.00 mg/mL 标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。

常用紫外分光光度法测定蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。

含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。

经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。

收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。

实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。

如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

测定范围为1-10mg蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差。

因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。

常用紫外分光光度法测定蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl ）定氮法样品与浓硫酸共热。

含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。

经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so---- 2co2+3so2+4h2o+nh3 ⑴2nh3+h2so4 --- （n h4）2so4 （2）（nh4）2so4+2nao- 2h2o+na2so4+2 nh3 ⑶反应（1）、（2）在凯氏瓶完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。

收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。

实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。

如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25 即得。

二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180°C左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

测定围为1-10mg蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差。

因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材1•试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。

试验三紫外分光光度法测定蛋白质

实验三紫外分光光度法测定蛋白质一、原理由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm 。

在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，这是由于：(1)对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。

故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

(2)若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。

核酸强烈吸收波长为280nm 的紫外光，它对260nm 紫外光的吸收更强。

但是蛋白质恰恰相反，在280nm 的紫外吸收值大于260nm 的紫外吸收值。

利用这些性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质含量的干扰作用。

但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差。

在测定工作中，可利用在280nm 及260nm 下的吸收差求出蛋白质的浓度。

蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280nm —0.74A260nm ，式中：A280nm 是蛋白质溶液在280nm 下测得的光吸收值；A260nm 是蛋白质溶液在260nm 下测得的光吸收值。

Warburg 和Christian 用结晶的酵母烯醇化酶和纯的酵母核酸作为标准，对有核酸存在时所造成的误差作了评价，并作出了一个校正表(如下)。

紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子F0.6565.500.8461.1160.001.750.6320.6070.5850.5650.5450.5080.4780.4220.3770.3220.2786.006.507.007.508.009.0010.0012.0014.0017.0020.000.8220.8040.7840.7670.7530.7300.7050.6710.6440.6150.5951.0811.0541.0230.9940.9700.9440.8990.8520.8140.7760.7430.6820.250.500.781.001.251.502.002.503.003.504.005.001.631.521.401.361.301.251.161.091.030.9790.9390.874校正因子核酸%A 280nm /A 260nm校正因子核酸%A 280nm /A 260nm注：一般纯蛋白质的A280nm/A260nm 值为约1.8，而纯核酸的A280nm/A260nm 值为约0.5。

紫外分光光度法测定蛋白质含量_百度文库(精)

教材1 紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理;掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术;掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法, 它是研究分子吸收190nm ～750nm 波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。

进行定性:利用紫外-可见吸收光谱法进行定性分析一般采用光谱比较法。

即将未知纯化合物的吸收光谱特征，如吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状与已知纯化合物的吸收光谱进行比较。

定量分析: 紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的依据是朗伯-比尔定律：A=lgI0/I=εbc ，当入射光波长λ及光程b 一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A 与该物质的浓度c 成正比，即物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成线形关系。

因此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，就可求出溶液中物质浓度和含量。

由于最大吸收波长λmax 处的摩尔吸收系数最大，通常都是测量λmax 的吸光度，以获得最大灵敏度。

光度分析时，分别将空白溶液和待测溶液装入厚度为b 的两个吸收池中，让一束一定波长的平行单色光非别照射空白和待测溶液，以通过空白溶液的透光强度为I 0，通过待测溶液的透光强度为I ，根据上式，由仪器直接给出I 0与I 之比的对数值即吸光度。

紫外-可见分光光度计:紫外-可见吸收光谱法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，即由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光, 该单色光通过样品池静样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A 。

可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池; 紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。

紫外分光光度法测定蛋白质的含量

１．３方法
１．３．１吸收曲线的绘制
１．３．３待测样品的测定
取２ｍＬ的待测蛋白质溶液，用０．９％的ＮａＣ１溶液稀释至
１０ｍＬ，按上述方法测定２７９ｎｌｎ处的吸光度值。平行测定三次。结果见表３。
＝
０．６００ｍｇ／ｍＬ；样品标准偏差ｓ＝［ ∑ （ｘ一ｘ）／（ｎ一１）＝０．０７８；相对
标准偏差Ｓｒ＝Ｓ／ｘ＝Ｏ．０２６。
２．２结果分析
２＿２．１影响本测定方法的因素
ｒｅｓｅａｒｃｈ．ＴｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｔｅｓｔｅｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙＵＶｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｗｅｃｏｕｌｄａｎａｌｙｚｅａｎｄｓｕｍｍａｒｉｚｅｔｈｅｔｒａｉｔｓａｎｄｔｈｅｓｕｉｔａｂｌｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｔｗａｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙ，ｒａｐｉｄｉｔｙａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｉｎｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙ．Ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｓｕｉｔａｂｌｅｏｒｆｔｈｅｄｅｔｅｍｉｒｎａｔｉｏｎｏｆｌｏｗｃｏｎｔｅｎｔｓａｍｐｌｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＵＶｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ；ｐｒｏｔｅｉｎ；ｄｅｔｅｍｉｒｎｉｎｇ

紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理

紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理介绍紫外分光光度法是常用的一种测定蛋白质浓度的方法。

本文将详细介绍紫外分光光度法的原理以及其在蛋白质浓度测定中的应用。

紫外分光光度法原理紫外分光光度法利用蛋白质溶液对紫外光的吸收特性进行测量，从而确定蛋白质的浓度。

蛋白质分子中的色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）等芳香族氨基酸在紫外光区域具有吸收峰，通过测量吸光度可以间接测定蛋白质的浓度。

实验步骤以下是使用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的一般实验步骤：1. 制备蛋白质样品制备含有待测蛋白质的溶液样品。

确保溶液浓度适中，避免过高或过低浓度对测定结果产生影响。

2. 预热紫外分光光度计打开紫外分光光度计并进行预热，使其达到稳定的工作温度。

3. 校准光程使用标准样品校准紫外分光光度计的光程，确保准确测量待测样品的吸光度。

4. 测定吸光度将待测样品倒入光度池，使用紫外分光光度计测量样品溶液在特定波长下的吸光度。

常用波长为280nm，其对色氨酸具有最大吸收峰。

5. 绘制标准曲线制备一系列已知浓度的蛋白质标准溶液，分别测定它们的吸光度。

利用这些测定值绘制标准曲线，用于计算待测样品的蛋白质浓度。

6. 计算蛋白质浓度根据标准曲线，计算出待测样品的蛋白质浓度。

根据不同的光吸收系数和波长，可以得出不同氨基酸的摩尔吸光系数，再根据摩尔吸光系数进行计算。

紫外分光光度法的优势紫外分光光度法具有以下优势：1.灵敏度高：对浓度较低的蛋白质样品也能够进行准确测量。

2.快速便捷：测量过程简单，不需要复杂操作。

3.非破坏性：样品在测量过程中不受损伤，可以进行进一步的分析。

紫外分光光度法的局限性紫外分光光度法也存在一定的局限性：1.干扰物质：一些样品中可能含有其他吸收波长与蛋白质相近的物质，会对测定结果产生干扰。

2.重复性：在批量测定时，光度池的装填和清洗对结果的重复性有一定影响。

3.波长选择：根据不同蛋白质的吸收特性，选择适当的波长进行测量，否则会导致测定结果不准确。

蛋白质测定常用的几种方法

I. 紫外分光光度法测定蛋白质的含量一、实验目的掌握紫外分光光度法测定蛋白质的含量的方法。

二、实验原理蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，使蛋白质对280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。

该法操作简单、快捷，并且测定的样品可以回收，低浓度盐类不干扰测定，故在蛋白质和酶的生化制备中广泛被采用。

但此方法存在以下缺点：1．当待测的蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差别较大是会产生一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的样品。

2．若样品中含有其他在280nm吸收的物质如核酸等化合物，就会出现较大的干扰。

但核酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm两处的光吸收值，通过计算可以适当的消除核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。

但因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽经校正，测定结果还存在着一定的误差。

三、实验器材1．紫外分光光度计2．移液管3．试管及试管架4．石英比色皿四、材料与试剂1．标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮校正的牛血清清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。

2．待测蛋白溶液：酪蛋白稀释溶液，使其浓度在标准曲线范围内。

五、操作方法1．标准曲线的制作按表1加入试剂。

表1 标准曲线的制作度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出血清蛋白的标准曲线。

2．未知样品的测定取待测蛋白质溶液1mL，加入3mL蒸馏水，在280nm下测定其吸光度值。

并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。

II. Bradford法测定蛋白质的含量一、实验目的学习考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质的原理和方法。

二、实验原理1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的原理，迅速而准确的定量蛋白质的方法。

染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm。

蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1μg）。

实验3 紫外分光光度法测定蛋白质含量

本法适用于微量蛋白质浓度测定，本法适用于微量蛋白质浓度测定，对盐类混杂的情况比较合适，为简便起见，对混合蛋白质溶液，况比较合适，为简便起见，对混合蛋白质溶液，可用 A280×0.75来表示蛋白质大概浓度来表示蛋白质大概浓度。 A280×0.75来表示蛋白质大概浓度。注意事项】【注意事项】由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，显色深浅随不同蛋白质改变，显色深浅随不同蛋白质改变，因而本法只适用于蛋白质相对浓度的测定，核酸对结果也有影响，质相对浓度的测定，核酸对结果也有影响，尽管进行了公式校正，但是不同样品干扰成分差异较大，了公式校正，但是不同样品干扰成分差异较大，致使 280nm紫外吸收法检测的准确性较差紫外吸收法检测的准确性较差。 280nm紫外吸收法检测的准确性较差。思考题】【思考题】紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么？ 1. 紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么？影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些？ 2. 影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些？
【实验步骤】实验步骤】 1、标准曲线法标准曲线的制作：只试管按表2 加入试剂，（1）标准曲线的制作：取8只试管按表2-5加入试剂，摇选择光程1cm 石英比色皿， 280nm波长测定A280，波长测定A280 匀。选择光程1cm 石英比色皿，在280nm波长测定A280， A280值为纵坐标蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。值为纵坐标，以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
6 2.5 1.5 0.62 5
7 3.0 定：样品测定：配制待测蛋白质溶液1ml 加入蒸馏水3ml 1ml， 3ml，配制待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，测定A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度。测定A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度。 A280 2. 直接测定法在紫外分光光度计上，在紫外分光光度计上，将待测蛋白质溶液加入比色皿，以生理盐水为对照，测定280nm 280nm和比色皿，以生理盐水为对照，测定280nm和260nm 波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度：波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度：蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260 (C为蛋白质浓度，mg/ml,A280和A260分别为 (C为蛋白质浓度，mg/ml,A280和A260分别为为蛋白质浓度蛋白质溶液在280nm 260nm处测得的吸光度值 280nm和处测得的吸光度值) 蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)。

紫外分光光度法测定蛋白质含量

紫外分光光度法测定蛋白质含量实验目的1、学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理。

2、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。

实验原理本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。

蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm 附近（不同蛋白质的吸收波长略有差别）。

在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯—比尔定律。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，其主要原因有两个：其一，测定的蛋白质与标准蛋白质中色氨酸、酪氨酸的含量不同，会造成一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质；其二，若样品中含有嘌呤、嘧啶（核酸）等吸收紫外光的物质，会产生较大的干扰。

核酸强烈吸收波长为280nm的紫外光，对260nm 波长的紫外光吸收更强，其与蛋白质不同，蛋白质在280nm处的吸收大于260nm 的吸收，故可利用这一性质，通过计算适当校正核酸对于测定蛋白质含量的干扰作用。

由于不同的蛋白质与核酸的紫外吸收不同，故测定的结果还是会产生一定的误差。

在测定工作中，可利用在280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质的浓度。

蛋白质浓度（mg·mL-1）=1.45A280—0.74A260其中A280、A260分别为蛋白质溶液在280nm与260nm 处测得的吸光度值。

Warburg 和 Chirstian 用结晶的酵母烯醇化酶和纯的酵母核酸作为标准，对于有核算存在时所造成误差做出了评价，并作出校正表。

A280与A260的比值为校正因子F，可从校正表中查出，同时可查出该样品溶液中混杂核酸的百分含量，将F值代入，再由经验公式直接计算该溶液的蛋白质浓度。

蛋白质浓度（mg·mL-1）=F * 1/d * A280* D其中d为石英比色池的厚度；D为溶液的稀释倍数。

紫外吸收法在蛋白质含量为20~100μg·mL-1范围内服从比尔定律，氯化钠、硫酸铵以及0.1mol·L-1磷酸、硼酸和Tris 等缓冲溶液都无显著干扰，但是，0.1mol·L-1乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲溶液在215nm 下的吸收较大不能应用，必须降至0.005mol·L-1才无显著影响。

紫外分光光度法测定蛋白质含量

紫外分光光度法测定蛋白质含量2007-02-07 17:04一、实验目的1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。

2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。

3.掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外光：10-400nm可见光：400-780nm，（可被人们的眼睛所感觉）特点：带光谱、分子光谱应用：定性分析-最大吸收波长；定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）a.定性分析原理：吸收曲线：吸收峰的数目、位臵、相对强度以及吸收峰的形状.b.定量分析原理：根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。

定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。

c.仪器组成部件:各种类型的紫外-可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装臵。

2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理：（1）蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。

在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。

该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。

（2）由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。

据初步统计，浓度为1.0mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。

紫外分光光度法测蛋白质的含量

紫外分光光度法测蛋白质的含量一、实验目的1、学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。

2、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。

3、掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。

在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。

该测定方法简单、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。

1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外光：10-400 nm可见光：400-780 nm特点：带光谱、分子光谱应用：定性分析-最大吸收波长；定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）a.定性分析原理：吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状.b.定量分析原理：根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。

c.仪器组成部件:各种类型的紫外-可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。

在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。

该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。

国标紫外分光光度法测定蛋白质含量

国标紫外分光光度法测定蛋白质含量蛋白质是构成生物体内各种细胞、器官和组织的主要物质之一，其含量的测定对于科学研究和工业生产具有重要意义。

目前国际上常用的测定蛋白质含量的方法有比色法、低力荧光素法和生物素-四硫化物法等，而国家标准推荐使用紫外分光光度法测定蛋白质含量，因其准确性和可靠性较高，具有广泛适用性。

一、实验原理国标紫外分光光度法利用蛋白质分子内含有色氨酸（W）、酪氨酸（T）和苯丙氨酸（F）等氨基酸团的紫外吸收特性，即在近220nm处有吸收峰。

通过分析样品在220nm处的吸光度值，就可以计算出其蛋白质含量。

二、实验步骤1. 样品的制备将所需测定的物质按照预定比例溶解在适量的缓冲溶液中，混合均匀，离心沉淀物质后，称取上清液并记录其质量，得到样品洗脱液。

2. 样品的测定(1)制备含有对照蛋白质的样品洗脱液。

将已知浓度的蛋白质按需求浓度稀释后，制成一系列的对照样品，称取适量的对照样品，经过与样品液的处理过程相同的操作后，得到对照样品洗脱液。

(2)利用紫外分光光度计测量样品洗脱液和对照样品洗脱液在220nm处的吸光度，记录数据。

(3)计算样品洗脱液中蛋白质的含量。

根据统计学方法，将同一浓度蛋白质的对照样品的吸光度取平均值，并绘制标准曲线。

根据样品洗脱液的吸光度值和标准曲线，计算出样品中蛋白质的含量。

三、实验注意事项1. 操作时需严格按照实验指导书的规定操作。

2. 紫外分光光度计在对样品洗脱液进行吸光度测定时，应使用二元芳香胺半波长试管作为样品池。

3. 为防止各种最终洗涤液误差的影响，应利用含有NaHCO3 or Na2CO3的去离子水作为纯化洗涤液。

四、实验结果的分析利用国标紫外分光光度法测定出的蛋白质含量，可点评该样品是否符合质量要求。

若蛋白质含量低于标准要求，则说明样品质量不好，需再次提取纯化；若蛋白质含量超过标准，则说明提取效率较好，但仍需注意实验中的误差，以获得更加准确的结果。

总之，国标紫外分光光度法测定蛋白质含量是一种可靠、简便、经济的方法，可广泛应用于生物科学、医药研究、食品工业等领域，对于推动相关研究和产业发展起到了积极的促进作用。

紫外分光光度计——蛋白质含量测定

紫外分光光度计——蛋白质含量测定紫外可见分光光度法是在190～760nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。

当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。

因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。

从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。

物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。

因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。

用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。

紫外分光光度法测量光谱法（spectrometry）是基于物质与电磁辐射作用时，测量由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度进行分析的方法。

光谱法可分为发射光谱法、吸收光谱法、散射光谱法；或分为原子光谱法和分子光谱法；或分为能级谱，电子、振动、转动光谱，电子自旋及核自旋谱等。

分光光度法是光谱法的重要组成部分，是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。

常用的技术包括紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、荧光分光光度法和原子吸收分光光度法等。

物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。

在一定条件下，物质的吸收系数是恒定的，且与入射光的强度、吸收池厚度及样品浓度无关。

当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。

在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称之为比色分析。

蛋白质与生命的起源、存在和进化都密切相关,蛋白质测定涉及到生产和利研的众多领域。

紫外分光光度法测定蛋白质的含量

紫外分光光度法测定蛋白质的含量一、实验目的：（1）学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理；（2）掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术；二、实验原理：蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近。

最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯尔比尔定律：A=abc“A”为溶液的吸光度值，“b”为石英比色池的厚度，“c”为蛋白质溶液的浓度。

紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。

紫外-可见分光光度法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，如下所示：由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光,该单色光通过样品池对样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A。

可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池;紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。

本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。

三、仪器与试剂：TU-1901双光束紫外可见分光光度计、比色管、吸量管标准蛋白质溶液（5.00mg/mL）、0.9%NaCl溶液、待测蛋白质溶液四、实验步骤：1.准备工作：⑴启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。

⑵在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。

⑶将空白放入测量池中，点击START扫描空白，点击ZERO校零。

⑷标准曲线的制作。

2.测量工作：⑴.吸收曲线的绘制：用吸量管吸取2mL5.00mg/mL标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。

用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在190 nm～400nm区间，测量吸光度。

紫外分光光度法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量

紫外分光光度法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量一、本文概述本文旨在探讨紫外分光光度法在快速测定液体奶和奶粉中蛋白质含量方面的应用。

紫外分光光度法是一种基于物质对紫外光的吸收特性进行定量分析的方法，具有操作简便、快速准确、适用范围广等优点，因此在食品营养成分分析中得到了广泛应用。

本文将详细介绍紫外分光光度法的基本原理、实验步骤及注意事项，并通过实例分析验证该方法在液体奶和奶粉中蛋白质含量测定中的准确性和可靠性。

本文还将讨论该方法相较于传统蛋白质测定方法的优势，以及在实际应用中的潜力和局限性。

通过本文的研究，旨在为液体奶和奶粉生产的质量控制、食品安全监管以及营养学研究提供有力支持。

二、紫外分光光度法原理紫外分光光度法是一种基于物质在紫外光区（通常指波长范围在200-400纳米）对光的吸收性质进行分析的方法。

在液体奶和奶粉中蛋白质含量的测定中，该方法主要利用蛋白质分子中的芳香族氨基酸（如色氨酸和酪氨酸）以及某些特定的肽键在紫外光区具有吸收峰的特性。

当紫外光通过这些含有蛋白质的样品时，部分光能被蛋白质分子吸收，导致光的强度减弱。

根据朗伯-比尔定律，光强度的减少与样品中蛋白质的浓度成正比。

因此，通过测量紫外光通过样品前后的强度变化，可以计算出样品中蛋白质的浓度。

在紫外分光光度法中，常用的波长通常为280纳米，因为这是大多数蛋白质在紫外光区的主要吸收峰。

为了消除其他可能干扰测定的物质（如核酸）的影响，通常还会使用多个波长（如260纳米）进行校正。

通过比较不同波长下的吸光度值，可以更加准确地计算出蛋白质含量。

紫外分光光度法具有快速、简便、灵敏度高和成本较低等优点，因此在食品工业中得到了广泛应用。

然而，需要注意的是，该方法只能提供蛋白质总量的信息，无法区分不同种类的蛋白质。

对于含有较多非蛋白质成分或具有特殊光学性质的样品，可能需要采用其他方法进行蛋白质含量的测定。

三、实验材料与方法本实验采用紫外分光光度法快速测定液体奶、奶粉中的蛋白质含量。

分光光度法检测蛋白质含量

分光光度法检测蛋白质含量在生物化学和分子生物学领域，准确测定蛋白质的含量是一项至关重要的任务。

分光光度法作为一种常用且可靠的技术，为我们提供了一种快速、简便且相对准确的蛋白质含量检测手段。

分光光度法的基本原理是基于物质对光的吸收特性。

当一束特定波长的光通过含有蛋白质的溶液时，部分光会被蛋白质分子吸收，导致光强度的减弱。

通过测量光通过溶液前后的强度变化，我们可以根据特定的公式和标准曲线来计算蛋白质的含量。

在分光光度法中，常用的检测波长有 280nm 和 595nm 等。

在280nm 波长下，蛋白质中的芳香族氨基酸（如酪氨酸和色氨酸）对光有吸收作用。

然而，这种方法的局限性在于，如果溶液中存在核酸等其他具有吸收 280nm 波长光的物质，可能会对测量结果产生干扰。

相比之下，基于考马斯亮蓝 G-250 染色的方法，通常在 595nm 波长下进行测量，具有更广泛的适用性。

考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，会发生颜色变化，从红色变为蓝色，并且在 595nm 处有最大吸收峰。

为了使用分光光度法准确检测蛋白质含量，首先需要进行标准曲线的绘制。

我们选择一系列已知浓度的蛋白质标准溶液，用分光光度计在选定的波长下测量它们的吸光度值。

然后，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。

标准曲线通常呈现出良好的线性关系。

在实际检测样品时，将待测蛋白质溶液按照相同的条件进行处理和测量，得到其吸光度值。

然后，根据标准曲线即可计算出样品中蛋白质的含量。

分光光度法检测蛋白质含量的操作过程相对简单，但仍需要注意一些关键步骤和细节。

例如，在样品制备过程中，要确保蛋白质充分溶解，避免出现沉淀或团聚。

同时，所用的试剂和仪器都需要进行严格的质量控制和校准。

在选择分光光度法检测蛋白质含量时，还需要考虑样品的特性。

如果样品中含有大量的干扰物质，可能需要先进行预处理，以去除这些干扰因素。

此外，不同的蛋白质可能与显色剂的结合能力有所不同，这也可能会影响测量结果的准确性。