新城疫病毒的分离鉴定

青岛农业大学

兽医微生物学课程论文

题目：新城疫病毒的分离家鉴定

姓名：王梅州

学院：动物科技学院

班级：马业科学1201班

学号： 20121658 任课教师：温建新

二0一四年四月十五日

新城疫病毒的分离鉴定

马业科学1201 王梅州

任课教师温建新

摘要：病毒的分离鉴定在兽医研究中长用于禽源病毒的分类、培养、生物学特性鉴定、疫苗制备和药物筛选等工作。是防疫、确诊病毒类疾病的重要手段。

关键词：新城疫病毒接种鸡胚

引言：鸡胚的优点是，来源充足价格低廉，操作简单，无需特殊设备和条件，乙肝病毒谱较广，对接种病毒不产生抗体等。

新城疫是禽类的一种急性、高度接触性传染病，由一种侵害呼吸道、肠道以及中枢神经系统的新城疫病毒引起。NDV属于副黏病毒科的腮腺炎病毒属成员，有囊膜，表面有纤突，内含血凝素神经氨酸酶和融合蛋白。NDV有血凝特性，能凝集禽类、两栖动物、爬行动物等多种动物的红细胞以及人的O型红细胞。

目录

摘要.................................................. 错误！未定义书签。关键词................................................ 错误！未定义书签。引言.................................................. 错误！未定义书签。

1 材料 (1)

1.1 鸡胚 (1)

1.2 病毒 (1)

1.3 实验试剂 (1)

1.4 实验器材 (1)

2 实验方法 (1)

2.1鸡胚的选择和孵育 (1)

2.2 鸡胚接种前的准备 (1)

2.2.1照蛋 (1)

2.2.2 消毒 (1)

2.3 鸡胚接种 (1)

2.4 接种后的观察 (1)

2.5 微量α法血凝抑制试验 (2)

3 结果观察 (2)

4 结论 (3)

参考文献 (3)

1 材料

1.1鸡胚

9-11日龄SPF或非免疫ND疫苗种鸡所产的白壳鸡蛋

1.2 病毒

待捡病毒液

1.3 实验药剂

NDV阳性血清、1％鸡红细胞悬液、生理盐水

1.4 实验器材

微量移液器及吸头、石蜡、照蛋器、打孔器、注射器、孵化箱、蛋架、镊子、酒精灯、96孔“V”形微量反应板

2 实验方法

2.1 鸡胚的选择和孵育

选取9-11日龄的正常鸡胚

2.2 鸡胚接种前的准备

2.2.1 照蛋

用照蛋器照蛋，根据鸡胚的纹理用铅笔标出气室位置及气室打孔部位，并在气室底边胚胎附近无大血管除标出接种部位。

2.2.2消毒

先后用碘酒和75％的酒精棉球消毒准备接种部位的蛋壳表面。

2.3 鸡胚接种

选用9-11日龄发育良好的鸡胚，其气室向上置于蛋架上，在所标记接种部位用经火焰的钢锥钻一个小孔，注意要恰好使蛋壳打通而又不伤及壳膜。再在非气室部位的蛋壳上无血管的标记处用经火焰的钢锥钻一个小孔，以打开蛋壳而又不伤及壳膜为宜，然后用1ml 注射器抽取接种物，与蛋壳成30°角斜刺入小孔3-5mm，注入接种物。一般接种量为

0.1-0.2ml。注射后用融化的石蜡或消毒胶布封闭注射小孔。气室朝上置于37℃温箱中孵育。

2.4 接种后的检查

接种后每天检查3-4次。接种后24h内死亡的鸡胚多数是由于鸡胚受损或污染细菌引起的，一般弃去。但有些病原微生物（如高致病力禽流感病毒）也可能会在短时间内引起

鸡胚死亡，只是应对可疑尿囊液做进一步鉴定。

2.5 微量α法血凝抑制试验

取洁净的96孔V形微量滴定板用微量移液器从滴1孔至第12孔各加生理盐水50µL。用微量移液器吸取尿囊液50µL，加入第1孔并吸吹3-5次，使其与生理盐水充分混匀后依次倍比稀释至第11孔，弃去50µL，第12孔不加病毒液作为对照，做相同的2排。后用液器向第一排的1-12孔各加50µL的生理盐水。第二排没空各加一定稀释度的新城疫阳性血清50µL，后在第一排和第二排每孔各加１％的鸡红细胞悬液50µL，将滴定板放在微量震荡混匀器上（或用手工旋转）混匀，于20-30℃或室温静置15-20min，待对照孔完全沉淀后判定并记录结果。

结果判定：血凝实验结果以++++（#）、+++、++、+和—表示。

++++（#）：红细胞均匀平铺与V型孔底。

+++：红细胞平铺孔底，但孔中心稍有红细胞聚集。

++：孔周围有凝集，孔中央有红细胞聚集。

+：孔中央有红细胞聚集形成小团，但边缘不光滑，四周有小凝块。

—：孔中央有红细胞聚集，边缘光滑。

血凝实验第一排和α法血凝抑制试验（第2排）两排孔的血凝价相差2个滴度以上判为阳性，即判定待检病毒为新城疫病毒；如两排孔的血凝价相等或差异小于2个滴度者为非特异性凝集，或为其他病毒引起，应判为阴性。

3 结果观察

将反应板倾斜成45℃角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。

能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清

的红细

胞凝集

抑制效

价，用

被检血

清的稀

释倍数

或以2为底的对数(log2)表示。如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1：64或HI效价为

6(log2)。第十一孔仅含稀释液和红细胞为不凝集对照孔，第十二孔含稀释液，病毒液和红细胞为凝集对照孔。

3.2

3.3

3.4

3.5

4结论

待捡病毒液为鸡的新城疫病毒。

参考文献：

[1]李一经，兽医微生物学，2011年1月第一版。

[2]陆承平，兽医微生物学第四版。

[3]兽医微生物学(原书第2版）