绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达
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菌体内成功诱导表达。
实验用品
PEGFP -N3模板、菌株E. coli DH5 α、E. coli BL21 、质粒 pET28a 、 限制性内切酶 EcoRⅠ、 Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、1 kb DNA ladder
DNA 凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒、DNA 纯化试剂盒及 IPTG、 PCR用试剂、卡那霉素、琼脂糖及 PCR 合成引物等、蛋白胨、酵母浸出 粉、琼脂粉等。
（4）Pet28a的抗性是kana 抗性，通常所用的表达菌株 是BL21（DE3），BL21（DE3） Gold等BL21（DE3）系列的 宿主菌。
大肠杆菌的表达系统：
BL21（DE3）带有 T7 RNA 聚合酶基因的λ DE3溶原菌,T7 RNA 聚 合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适 合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。
目
1 实验背景
2 实验用品及方法介绍
录
3 实验流程
4 实验原理
5 具体实验步骤
6 实验结果预测
7 参考文献
实验背景
200810月8日，瑞典皇家科学院宣布，2008年诺贝尔化学奖由 日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学 家钱永健获得，他们三人在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)方 面取得了突出成就。
实验流程
实验原理
1.质粒DNA的提取
1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是 具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和 真菌细胞中。质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的 复制数，可表达它携带的遗传信息。它可以独立游离于细胞质内， 也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控 制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
PCR仪、 凝胶成像系统、荧光显微镜DYY-6C电泳槽和电泳仪、高速台 式离心机、UV2300 紫外可见分光光度计
目的基因：
EGFP (720bp)的基因片段:
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGA CGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGA CCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGA CCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCG CCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACC CGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTT CAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATA TCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGAC GGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCT GCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATC ACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGT AA
目的基因内限制性酶切位点如下：
154 Eco57I
198 Eco57I
397 Eco57I
710
Bsp1407I 181 BsiI
序列来源：pEGFP-N3质粒
pET28a质粒
表达质粒—— pET28a质粒 （1）含有T7Lac启动子 （2）含有寡聚组氨酸链 （His-tag) （3）其N端含有Thrombin蛋 白酶切位点。
GFP 的应用
(1) 研究基因表达的调控元件和蛋白定位。 (2) 研究基因表达的时序控制与空间定位 。 (3) 可用于发育分子机理研究。 (4) 筛选药物 。 (5) 临床检验。 (6) 转基因动物和植物的筛选标记 。
电泳检测 PCR扩增 EGFP目的基因获取 引物设计
干扰素
重组质粒的构建 感受态细胞的制备
转化 筛选及复筛及酶切验证
PCR检测 IPTG诱导表达
SDS-PAGE检测目的蛋白
包涵体检测 分离纯化
电泳检测 酶切
pET28a质粒酶切位点选择
实验用品及方法介绍
方法介绍
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌Baidu Nhomakorabea内的基因克隆和表达。通过质粒重 组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌 体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导 表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆
2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不 同的需要采用不同的方法。碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是 根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。十 二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌 细胞裂解，又能使一些蛋白质变性碱变性法因其抽提效果好，收得 率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广 泛采用。抽提过程中在加入溶液II后，碱性条件使DNA的氢键断裂， 宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两 条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主DNA相对分子质量 大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分 子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速 配对恢复原来的构型而溶解在TE溶液中。
目前应用较多的是GFP的突变体—增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）。 EGFP将GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光 强度比GFP大6倍以上。
所以，EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、调控、细胞 分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等
GFP性质
1、检测方便 2、荧光稳定 3、无毒害 4、具有共用性和通用性 5、易于构建载体 6、可进行活细胞定时定位观察
绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962 年从多管水母中发 现并分离得到的一种发光蛋白。
它是由238 个氨基酸构成的“β-桶” 型三维立体结构, 其中 第 65 ~ 67 位氨基酸( 丝氨酸 -酪氨酸 -甘氨酸) 形成发光团, 为主要发光的位置。
GFP的演化
通过生物化学的方法将基因做小小的改变, 就可以改变GFP中的氨基 酸, 得到变异GFP。
实验用品
PEGFP -N3模板、菌株E. coli DH5 α、E. coli BL21 、质粒 pET28a 、 限制性内切酶 EcoRⅠ、 Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、1 kb DNA ladder
DNA 凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒、DNA 纯化试剂盒及 IPTG、 PCR用试剂、卡那霉素、琼脂糖及 PCR 合成引物等、蛋白胨、酵母浸出 粉、琼脂粉等。
（4）Pet28a的抗性是kana 抗性，通常所用的表达菌株 是BL21（DE3），BL21（DE3） Gold等BL21（DE3）系列的 宿主菌。
大肠杆菌的表达系统：
BL21（DE3）带有 T7 RNA 聚合酶基因的λ DE3溶原菌,T7 RNA 聚 合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适 合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。
目
1 实验背景
2 实验用品及方法介绍
录
3 实验流程
4 实验原理
5 具体实验步骤
6 实验结果预测
7 参考文献
实验背景
200810月8日，瑞典皇家科学院宣布，2008年诺贝尔化学奖由 日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学 家钱永健获得，他们三人在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)方 面取得了突出成就。
实验流程
实验原理
1.质粒DNA的提取
1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是 具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和 真菌细胞中。质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的 复制数，可表达它携带的遗传信息。它可以独立游离于细胞质内， 也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控 制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
PCR仪、 凝胶成像系统、荧光显微镜DYY-6C电泳槽和电泳仪、高速台 式离心机、UV2300 紫外可见分光光度计
目的基因：
EGFP (720bp)的基因片段:
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGA CGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGA CCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGA CCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCG CCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACC CGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTT CAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATA TCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGAC GGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCT GCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATC ACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGT AA
目的基因内限制性酶切位点如下：
154 Eco57I
198 Eco57I
397 Eco57I
710
Bsp1407I 181 BsiI
序列来源：pEGFP-N3质粒
pET28a质粒
表达质粒—— pET28a质粒 （1）含有T7Lac启动子 （2）含有寡聚组氨酸链 （His-tag) （3）其N端含有Thrombin蛋 白酶切位点。
GFP 的应用
(1) 研究基因表达的调控元件和蛋白定位。 (2) 研究基因表达的时序控制与空间定位 。 (3) 可用于发育分子机理研究。 (4) 筛选药物 。 (5) 临床检验。 (6) 转基因动物和植物的筛选标记 。
电泳检测 PCR扩增 EGFP目的基因获取 引物设计
干扰素
重组质粒的构建 感受态细胞的制备
转化 筛选及复筛及酶切验证
PCR检测 IPTG诱导表达
SDS-PAGE检测目的蛋白
包涵体检测 分离纯化
电泳检测 酶切
pET28a质粒酶切位点选择
实验用品及方法介绍
方法介绍
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌Baidu Nhomakorabea内的基因克隆和表达。通过质粒重 组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌 体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导 表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆
2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不 同的需要采用不同的方法。碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是 根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。十 二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌 细胞裂解，又能使一些蛋白质变性碱变性法因其抽提效果好，收得 率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广 泛采用。抽提过程中在加入溶液II后，碱性条件使DNA的氢键断裂， 宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两 条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主DNA相对分子质量 大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分 子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速 配对恢复原来的构型而溶解在TE溶液中。
目前应用较多的是GFP的突变体—增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）。 EGFP将GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光 强度比GFP大6倍以上。
所以，EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、调控、细胞 分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等
GFP性质
1、检测方便 2、荧光稳定 3、无毒害 4、具有共用性和通用性 5、易于构建载体 6、可进行活细胞定时定位观察
绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962 年从多管水母中发 现并分离得到的一种发光蛋白。
它是由238 个氨基酸构成的“β-桶” 型三维立体结构, 其中 第 65 ~ 67 位氨基酸( 丝氨酸 -酪氨酸 -甘氨酸) 形成发光团, 为主要发光的位置。
GFP的演化
通过生物化学的方法将基因做小小的改变, 就可以改变GFP中的氨基 酸, 得到变异GFP。