第四章、第二讲

（二）影响培养基灭菌的主要因素
1、微生物热阻 （前述）
影响培养基灭菌的主要因素（continued）
2、pH
微生物在pH6.0～8.0范围内耐热性最大
◆
pH低于6.0时，氢离子极易渗入微生物细胞，从而改 变细胞的生理反应而促进其死亡，故培养基酸度愈高， 则所需的杀菌时间愈短。
◆
影响培养基灭菌的主要因素（continued）
因高浓度有机物会环绕细菌的四周形成一层薄膜，影响热的 传入。
◆
而高浓度的盐类、色素等则削弱其抗性
影响培养基灭菌的主要因素（continued）
5、泡沫
泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去杀死其 中潜伏的微生物；
易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。
6、颗粒
颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。
′随反应物质种类和温度不同
在化学反应中，其他条件不变，′和温度的关系也可用阿 仑尼乌斯方程表示：
′= A′ e
A ′— 比例常数；
E′ －— RT
E′ — 分解活化能，(E′) （×4.18 J/mol）; T — 绝对温度，(K) R — 气体常数，[1.978×4.18 J/(mol〃K)]
◆
Svante August Arrhenius
was a Swedish physical chemist best known for his theory that electrolytes, certain substances that dissolve in water to yield a solution that conducts electricity, are separated, or dissociated, into electrically charged particles, or ions, even when there is no current flowing through the solution. In 1903 he was awarded the Nobel Prize for Chemistry.
◆
一般取N = 0.001，即1000次灭菌中有1 次失败。
例：
有一发酵罐内装40m3培养基，在121℃温度下进行实罐灭 菌。原污染程度为每ml有2×105个耐热细菌芽孢， 121℃时灭 菌速度常数为1.8min－1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭 菌时间。
解： N0 = 40×106 × 2×105 = 8 ×1012 (个)
每一种微生物都有一定的生长温度范围； 当微生物处在最低生长温度以下，代谢作用几乎停止，而 处于休眠状态；当温度超过最高限度时，细胞中原生质体和 酶的基本成分就发生不可逆的变性，使微生物死亡。
不同种类微生物对热的抵抗力不同。
微生物对热的抵抗力称为热阻（heat resistance）。
某些微生物对湿热的相对热阻（与大肠杆菌比较）
降温 D
min
V = V加热 + V维持 + V冷却
RT2 (E –2RT)
V 加热 = ———————— ·t 加热 (T-T0)E2 RT2 (E –2RT)
V 冷却 = ———————— ·t 冷却
(T-T0)E2
R ：气体常数；= 1. 986 [ 卡/克分子〃K]
E ：耐热孢子致死的活化能；= 65000 [卡/克分子]
=Ae
A — 比例常数；
E －— RT
Arrhenius equation
E — 杀死细菌所需的活化能，(E) （×4.18 J/mol）; T — 绝对温度，(K) R — 气体常数，[1.978×4.18 J/(mol〃K)]
e — 2.71 (exp)
=Ae
E －— RT
－E lg = ——— + lgA 2.303RT
＝
E 叶酸
ln2/1＞ln2′/1′
即随着温度的上升，灭菌的速度常数的增加倍数大于培养 基成分破坏的增加倍数。或者说，当灭菌温度上升时，微生 物杀灭速度的上升超过培养基成分破坏的速度。
根据这一理论，培养基灭菌采用高温短时间的 方法，有利于减少营养成分的破坏。
灭菌温度/℃ 100 110 115 120 130 145 150 灭菌时间/min 400 36 15 4 0.5 0.08 0.01 维生素B1破坏量/% 99.3 67 50 27 8 2 ＜1
以lg对1/T作图，得一直线，其斜率为-E/2.303R，截距为lgA， 从斜率和截距科求得A和E值。 lg
斜率 = －E/2.303R 截距 = lgA
1/T
培养基成分受热破坏是化学分解反应，为一级动力学反应：
- dC / d = ′C
C — 对热不稳定物质的浓度, (mol/L); ′— 分解速率常数 （s－1）； — 分解反应时间 （s）
pH对灭菌时间的影响
温度 孢子数 灭菌时间 (min)
(℃)
(个/ml)pH=6.1 5.3 5.0 4.7 4.5
120 115 110
10000 10000 10000
8 25 70
7 25 65
5 16 35
3 13 30
3 13 24
100Biblioteka 10000740720 180 150
150
影响培养基灭菌的主要因素（continued）
三、分批灭菌
（一）操作
（实罐灭菌）
1、在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的 分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。 若已先行空罐灭菌，此步可不进行
2、 预热
向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至70℃左右。
作用： 利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音
有的工厂省却此步；需通过试验掌握冷凝水的生成量， 确保培养基的浓度。
T：灭菌维持温度； 121℃ （393 K） T0：开始计算灭菌效果的温度；100℃ （373 K）
例： 1）小型发酵罐在120℃灭菌维持15分钟，由100℃ （100℃以 下灭菌效果不计）加热至120℃的时间为5分钟，由120℃冷却 到100℃的时间为3分钟，计算总的灭菌时间。
1.986×3932(65000 – 2×1.986 ×393) V加热 = ————————————————× 5 = 1.15 (393-373) × 650002 1.986×3932(65000 – 2×1.986 ×393)
第四章、第二讲
4.3 发酵工业的无菌技术
4.4 发酵培养基及设备管道 灭菌
4.3 发酵工业的无菌技术
• • • • 干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌 法 • 过滤除菌法 • 火焰灭菌法
4.4 发酵培养基及设备管道灭菌
培养基灭菌的有关理论——湿 热灭菌原理
（一）加热灭菌原理
1、微生物的热阻
微生物 大肠杆菌 细菌芽孢 霉菌孢子 病毒及噬菌体
相对热阻 1 3×106 2-10 1-5
下面介绍与热阻相关的几个概念
1）致死温度（Death temperature）
——杀死微生物的极限温度称为致死温度。
2）热力致死时间 (Thermal Death Time; TDT)
—— 在特定条件、特定温度下，杀死某种微生物 所需的最短时间。
e.g 伤寒杆菌58℃ 30min 变形杆菌55℃ 60min
2、微生物的热死规律——对数残留定律
微生物的热死是指微生物的受热失活，但物理性质不变。
◇ ◇
微生物虽然是一复杂的高分子体系，但受热死亡是由于 蛋白质变性所致。
◇
在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论。
对数残留定律的概念：
—— 对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死 亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定 律。 数学表达式：
升 温 阶 段
3、开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。
4、罐压达1kg/cm2 ( 0.1 MPa)时，按装在发酵罐封
头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。
保 温 阶 段
5、保温 调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度
保持在一稳定水平，维持一定时间。
在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都 应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽， 这样才能保证灭菌彻底，不留死角。
4、培养基灭菌温度的选择
培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基 成分被破坏，在加热下氨基酸、维生素等受破坏。
◆
培养基灭菌时，必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养 基成分破坏减至最少的条件。
◆
灭菌过程微生物死亡属于一级反应动力学类型（从对数残 留定律表达式可知）。
◆
在其它条件不变时，比死亡速率与温度的关系可用阿仑尼 乌斯方程式表示。
ln
2 ′ 1 ′
〔T T 〕 = R 1 2
E ′1
1
上面两式相除，得
名称
E (J/mol)
70.3 87.9 96.7 92.1 283 318 343
ln(2 /1) ln(2′ /1′)
泛酸 E′ 维生素B12 维生素B1 由于灭菌的E大于培养基成分分解的E′ 嗜热脂肪芽孢杆菌 枯草杆菌 因此 肉毒梭菌
N = 0.001;
= 1.8 (min－1)
=
2.303

lg
N0 N
=
2.303
1.8
lg (8×1015) = 20.34 (min)
3、死亡速率常数 （比死亡速率）
死亡速率 常数 是微生物耐热性的一种特征，它随 微生物种类和灭菌温度而异。
◆ ◆
相同温度下，值越小，则此微生物越耐热。
e — 2.71 (exp)
在灭菌时，当温度变化，菌死亡速率常数和培养基成分破坏速率常数 ′都变化。