电泳技术

1967年Shapiro A L等在凝胶电泳的基础上建立 了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。 70年代以后根据不同需要推出了多种电泳模 式，如圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、 脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等 技术。
• 80年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电
泳。 多年来科学家们对电泳结果的分析做了大量 的工作，建立了各种实验方法，电泳后对分离 物质可方法进行分析，得到所需 数据。
EQ / 6r E
又： M=V/E 以（5）代入得： EQ/6πrη M= —————— E 整理，得： M= Q/6πrη ------------------------------(6) 由式（6）可知，迁移率与粒子所带电荷量成正比， 与粒子的半径、介质的粘度成反比。粒子荷电量 越多，r越小，越近球形，泳动越快；反之越慢。
二、电泳速度表示法——迁移率

带电粒子在电场中的泳动速度（migration velocity） 用迁移率（或泳动率mobility, M）来表示。即：从 原点起，在电场强度为1伏/cm时，每秒钟的泳动 距离。也就是单位电场强度下的泳动速度。

M = V/E = d/t／v/l =dl/vt
(cm2/伏特 · )-----(2) 秒
电极
电极
U形管
Tiselius自由界面电泳装置示意图
（二）区带电泳（zone electrophoresis）

电泳在固相支持物上进行。在固相或胶状 介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后 在介质上加电场，带电颗粒在支持介质上 或支持介质内迁移，此支持物将溶液包绕 在其网孔中，避免了溶液中的物质自由移 动的弊端，使混合物的各组分在支持物上 分离为区或带。是目前应用最多的电泳方 法。
1．支持物类型 根据支持物对电泳的影响分为两大类： （1）单纯支持物：支持物相对惰性，对被分离物几 乎无作用。分离作用取决于待分离物的Q/r。荷 质比相同的不同粒子M相等而不能分离。属于这 类支持物的有：滤纸、醋酸纤维薄膜、玻璃纤维 纸 、薄层物质、琼脂及琼脂糖凝胶、单纯纤维 素纤维等 （可用于分析和制备目的）；淀粉和 石膏、海绵橡皮（仅用于制备目的）。 （2）分子筛支持物：多孔网状结构的凝胶具有分子 筛作用。Q/r(荷质比)相同而分子量不同的混合 物粒子，可用此法进行分离。属于这类支持物的 有：淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。
三、影响电泳的因素
对电泳的影响包括对速度的影响和效果的影响。 影响电泳的因素很多，如：


样品颗粒本身所带电荷的种类、数量、粒子大小、 形状； 支持物化学性质、带电状况、有无分子筛作用； 缓冲液的pH、离子强度、缓冲容量、粘度、化学 成分； 电场电压、电流、热效应与水分蒸发、水的电解 等。

（一）样品粒子
根据有无固体支持物分为自由电泳和区带电泳。 （一）自由电泳 又称界面电泳（moving boundary electrophoresis）, 即在溶液中进行电泳。这是瑞典Uppsala大学的著名 科学家Tiselius最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中 进行电泳，无支持介质，因而分离效果差，现已被 其他电泳技术所取代。 属自由电泳的还有：显微电泳 ，将一种大的胶体 颗粒或细胞置于显微镜下的电泳池中进行电泳，可 用来直接测定电泳迁移率；密度梯度和pH梯度并存 的柱状等电聚焦电泳；等速电泳等。
二、电泳技术的发展过程 1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现 象。


1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中 的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U 形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳 移动和等电点。 1937年瑞典Uppsala大学（乌普萨拉大学 ） 的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了 Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动 界面电泳方法，并首次证明了血清蛋白是 由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于 Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献 而获得了1948年的诺贝尔化学奖。
扩散层 + + + + + + + + + + + ++++ + + + + + + + + + + + + ++++ + +
±±±±±±±±±±±±±±±±±±±±±
㈠
吸附层 ㈩
如果物质是向正极移动（如血清蛋白质电泳）， 则H3+O的泳动方向与蛋白质泳动方向相反，影 响蛋白质的泳动速度，甚至将泳动最慢的γ-球蛋 白带到相反方向（这个原理是对流免疫电泳的理 论依据） ；如果原来是向负极移动，那么移动速 度会更快。因此，实际泳动速度由颗粒本身的泳 动速度和电渗作用所决定。
2．电渗（electro-osmosis）现象 电场中液体对于固体支持物的相对移动称 为电渗（图 ）。它是由缓冲液的水分子和 支持物表面之间所产生的一种相关电荷所 引起。
扩散层 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
吸附层
㈩
±±±±±±±±±±±±±±±±±
2.

按支持物的装置形式分为：
（1）平板式电泳 支持物水平放置于左右 电极槽之间； （2）垂直板式电泳 支持物垂直放置于上 下电极槽之间； （3）垂直柱式电泳 支持物制成柱状垂直 放置于上下电极槽之间。 （4）连续液动电泳（幕状电泳） 首先应用 于纸电泳，将滤纸垂直，两边各放一电极， 溶液自上向下流，与电泳方向垂直，可用 于物质的分离与制备。
注： M 迁移率；V 泳动速度（㎝/秒）；E 电场强度（伏/ ㎝）；d 泳动距离（㎝）；l 支持物有效长度（㎝）；v 支 持物有效电压（伏）； t 通电时间（秒）。

相对迁移率(relative mobility)：用mR表示蛋 白质样品的迁移距离与示踪染料的迁移距 离之比即为相对迁移率。即: 蛋白质的迁移距离(cm) mR = ————————————— 示踪染料的迁移距离(cm)
凝胶成像分析系统
第二节 电泳的基本原理
一、动力和方向


带电粒子在电场中为什么能移动？是因为 带电粒子在电场中受到电场引力（F）的作 用，F的大小取决于粒子所带电荷量Q及电 场强度E, 即： F=QE ---------------------(1) 粒子在电场中移动的方向由粒子本身所带 电荷的性质决定，带正电荷向负极移动， 带负电荷向正极移动。
两类电泳的比较：
自由电泳 组分重叠，分离欠佳，有2n个界面
区带电泳 组分分离，无重叠，得到n个区带
区带电泳又可根据支持物的类型、理化性质、电压、 电泳方式等进一步分类。 1. 按支持物的物理性状分为： （1）滤纸及其他纤维薄膜（如醋酸纤维薄膜、 聚氯乙稀膜、赛璐玢薄膜）电泳 适用于小量样 品的分析鉴定； （2）粉末电泳 如淀粉、纤维素粉、玻璃粉调 制成平板； （3）凝胶电泳 如琼脂胶、琼脂糖凝胶、淀粉 胶、聚丙烯酰胺凝胶等为支持物的电泳； （4）缘线电泳 如尼龙丝、人造丝电泳。


已知带电粒子在电场中所受的作用力 F = EQ ,根据 Stokes定律，球形粒子在液体中运动时所受到的阻力 F’,与粒子运动的速度V，粒子的半径r,介质的粘度η 的关系为： F’=6πrηV ----------------------------(3) 当电泳达到平衡，粒子在电场中作匀速运动时 F=F’ ， 即： EQ=6πrηV ------------------------(4) ∴： V=EQ/6πrη------------------------(5) 也即电泳速度与电场强度、粒子带电量成正比，与 粒子的半径、介质的粘度成反比。
㈠
电渗现象示意图
某些支持物表面带有电荷。如： 滤纸纤维素带有负电性基团（－OH） ： －OH → －Oδ－－H 或 －O－＋H+ ； 琼脂多糖含有大量硫酸根（－SO4－），支 持物可以使水感应产生正电离子（H3+O）。 在电场中由于支持物固定，H3+O（水合质 子）向阴极移动，并捷带着缓冲液中的盐 类和一些待分离物质一起移向负极，形成 介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。


在相同条件下（E、介质性质如η等相同）， M= Q/6πrη M∝ Q/r 不同种类的带电物质由于其Q/r（球形分子 也即电荷/质量比）各不相同而具有不同的 泳动率。这种移动速度的差异就是电泳技 术的基本依据。
（二）支持物因素

对支持物的一般要求是质地均匀，吸附力 小，惰性，电渗作用小，不与被分离的样 品或缓冲液起化学反应。并具有一定坚韧 度，不易断裂，容易保存。
目前，电泳技术与其他技术 如层析、扩 散、免疫、放射性同位素技术、质谱技术等 联用，使电泳技术的应用范围得以扩大。电 泳技术以设备简单，操作方便，分辨率高等 优点，目前已成为生物化学、分子生物学、 免疫学、生物技术等学科和专业的常用研究 工具，也是医、药学、工农业生产等各领域 的重要分析手段。
三、电泳的分类


1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸 作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分 离进行过研究。 20世纪50年代，以支持介质为主的电泳模式 不断涌现，如滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀 粉薄膜、琼脂糖凝胶电泳等。

1959年Davis和Weintraub利用人工合成的凝胶作 为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大 地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的 新时代。近半个世纪来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍 是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核 酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析 鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电 泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的 标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物 大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即 “Last Check”。