第十一章 荧光分析法

合物等。
造成荧光熄灭的原因有多种： （1）激发态荧光分子和熄灭剂分子碰撞，将能量转移到熄灭剂而使荧光熄灭； （2）荧光分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配合物； （3）荧光物质分子中引入重原子后，易发生系间窜越而转变为三重态； （4）当荧光物质浓度较大时，激发态分子和基态分子发生碰撞，产生荧光自
液池
激 发 单 色 器
光电倍增管 （参比信号）
光电倍增管
发 射 单 色 器
（样品信号）
WGY-10型荧光分光光度计具有双单色器，可以记录物质 的激光光谱和荧光光谱。采用计算机完成仪器的系统控制和数 据采集。其工作原理如下：
由光源发出的光，通过激发单色器后变成单色光，而后照
在荧光池中的被测样品上，由此激发出的荧光被发射单色器收
可见，凡是使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素均可
增加荧光量子产率。通常，kF 由分子结构决定（内因），而其 它参数则由化学环境和结构共同决定。
（二）影响荧光及其强度的因素。
跃迁类型：如上所述，物质必须在紫外可见区有强吸收和高荧光
效率才能产生荧光。具有—* 跃迁的分子才有强吸收。—*
（一）荧光的检测
光源发出的紫外可见光通过激 发单色器分出不同波长的激发 光，照射到样品溶液上，激发 样品产生荧光。样品发出的荧 光为宽带光谱，需通过发射单 色器分光后再进入检测器，检 测不同发射波长下的荧光强度 F。由于激发光不可能完全被 吸收，可透过溶液，为了防止 透射光对荧光测定的干扰，常 在与激发光垂直的方向检测荧 光（因荧光是向各个方向发射 的）。
荧光分析法具有灵敏度高，比分光光度法高
103~104倍。线性范围宽，方法简便快速且选 择性较好等多优点。 近20年来，各式各样新型荧光分析仪不断问 世，荧光分析法发展迅速，应用面日益拓宽， 尤其是在生物试样的分析及生命科学研究方面 （如DNA序列分析等）展现出广阔的前景。
第一节 基本原理
岛津荧光分光光度计
RF-5301荧光分光光度计是由日本岛津公司生产 ，采用对应的windows工作站直接控制主机，并进 行数据处理，在windows的操作环境下，利用鼠标 ，按键，进行测定，数据分析，编辑和记录等系 列操作。采用图表复制功能。能方便地把测定数 据集光谱输入、文字处理和表处理软件结合在一 起的全自动操作系统。 本光度计的样品室宽大可安装微型样品池，高灵 敏度样品池或流动样品池等附件。适用于多种测 定采用全息光栅光学系统和数字信号处理使本仪 器能达到很高的灵敏度。
当abc≤0.05（即溶液很稀）时，
F 2.3KΦ I 0 abc
(2.3abc) F KΦ I 0 [2.3abc ] 2!
2
对于一定的荧光物质，当测定条件固定时，
F K'c
3. 荧光强度与浓度的关系
对同一物质而言，若abc << 1（＜0.05 或0.03），即对很稀的溶液，荧光强度F与该 物质的浓度c有以下的关系： F = 2.303Фf I0 a•b • c 式中：Фf－荧光过程的量子效率；I0－入射光 强度；a－荧光分子的吸收系数；b－试液的 吸收光程。I0 和b不变时： F=K•C 式中K为常数。因此，在低浓度的情况下， 荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。
（二）激发光谱与荧光光谱的形成 任何荧光物质，都具有两种特征光谱， 即激发光谱(excitation spectrum)和荧光发射光
谱(fluorescence emission spectrum)。
1. 激发光谱 保持荧光发射波长不变（即固定发射单色 器），依次改变激发光波长（即调节激发单色 器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧
O C COO

荧光物质（荧光素）
菲荧光物质（酚酞）
取代基团
温度 溶剂 pH值
荧光熄灭 由于荧光物质分子间或与其它物质相互作用，引起荧光强度显著下降的 现象叫做荧光熄灭（quenching）或猝灭。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭 剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化
即对一定的荧光物质的稀溶液（abc≤0.05），
在一定的温度下，当激发光的波长、强度和液
层厚度都固定后，其荧光强度与该溶液的浓度
成正比。这是荧光分析定量的基础。
第三节 仪器
一、仪器的构造及原理
仪器类型很多，基本结构相似，一般包括五部分：激 发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。
1. 光源 能发射紫 外到可见区波长 的光、强度大、 稳定。常用的有 溴钨灯、高压汞 灯、氙灯。
再选定激发波长297nm（正在检索激发波长） 工作模式：发射扫描 起始波长：350 终止波长：500 负高压为：100（90） 点击“单程”输入通道号，出现发射光谱（通道2）然后点击 “读取数据”进入“自动寻峰”保存[txt文件]→ 清除当前 （建立）在曲线上找最大激发波长397 nm点击文件，选择 保存。 再选定发射波长397nm，起始波长改为250nm点击“单程”选 择通道2。则出现水杨酸溶液的光谱图（含激发光谱和发射 光谱）点击保存文本文件，在点确定，输入文件名，“保 存” 点击“工作”再点“定量测量”出现“定量测量-标准曲线”, 点击“编辑”，修改浓度单位ug/mL，确定点击“添加” 依次输入浓度0、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0再分别点击“本 底测量”、“单项测量”最后点击“计算标准曲线”最后 “样品测量”。
二、仪器类型 1. 光电荧光计 用滤光片作单色器（激发滤 光片和荧光滤光片），溴钨灯或高压汞灯作光 源，光电管为检测器。 2. 荧光分光光度计 发光谱和荧光光谱。 用氙灯作光源、光栅作 单色器，光电倍增管为检测器。可连续扫描激
闪烁Xe灯
仪器光路示意图
狭缝 光栅
反光镜
滤光片
参 反光镜 比 检 棱镜 测 器
和氟离子浓度成反比。
第二节 定性定量分析
一、荧光强度与溶液浓度的关系
分光光度法是测定物质对光的吸收程度；荧光
分析法是测定物质吸收了一定频率的光之后，物质
本身所发射的荧光强度。当溶液中的荧光物质被入
射光激发后，可以在各个方向观察到荧光，由于激 发光一部分可透过溶液，所以在透射光方向观察荧 光是不适宜的，一般是在与透射光垂直的方向观察 荧光。
测定荧光强度时，要选择两个不同的波长：一
个是物质吸收的光，即激发光的波长；另一个是被 激发物质发射的光，即荧光的波长。
在稀溶液中，荧光强度If与入射光的强度Io、荧光量子效率ψ f 以及荧
光物质的浓度c等有关，可表示为If=Kψ fIoε bc。 （式中K为比例常数， 与仪器性能有关，ε 为摩尔吸光系数，b为液层厚度）。由此可见，当仪 器的参数固定后，以最大激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光 的强度时，荧光强度 If与荧光物质的浓度c成正比。（对于某种荧光物 质的稀溶液，在一定的频率及强度的激发光照射下，当溶液的浓度足够 小使得对激发光的吸光度很低时，所测溶液的荧光强度才与该荧光物质 的浓度成正比。）
岛津荧光分光光度计 一、操作步骤 1.启动RF-5301软件进入RF-5301系统，仪器开始自检。 2.在CONFIGURE（参数）菜单栏中选择PC COMNFIGURATION（电脑参数设置）栏。选择PC机接口为 1打开光度计电源 3. 在ACQUIRE MODE（工作方式 获得模式）菜单栏中选择工作方式： SPECTRUM光谱 QUANTITATIRE定量分析 TIME COURSE时间扫描 4.在CONFIGURE栏中选择ＰＡＲＡＭＥＴＥＲ（参数栏）进行试验 参数设定 如激发波长 检测荧光范围 本试验先固定发射波长400nm，在250－350nm进行激发波长扫描获得溶液的激发光谱图在固定激发波长 为λａ（最大激发波长），在350－500ｎｍ进行发射波长扫描获得溶液的发射光谱图 5. 放置样品 6. 单机显示屏右下角的ｓｅｒａｃｈ入键查找最佳发波长扫描激发光谱 得 excitation：300nm emission：400nm 7.单机显示屏右下角的start菜单键开始扫描并记录发光谱 8.再重复至（４－７）改为发射光谱固定激发波长为300nm得发射光谱图 9. 选择presentation（描述，表达）菜单栏中的graph图形处理） limits（坐标） yaxis竖坐标 xaxis横坐标 把激发、发射光谱图放到一起，在选择plot打印谱图 定量分析 在acquire mode菜单中选择quantitattire定量分析选择ｍultipoint intworking gurre 通过计算,样品含量分别为0 ２.４ ４.８ ７.２ ９.６. １２ １５０ug/mL ２．４ug/mL 在concentration Units：ug/ml Range:0.000 to 18 Recording range Low 0.00 high 200 点击standard 先做空白 输入浓度为0 ，依次放入标样 , 点击read 依次输入浓度 , 得到标准曲线.
一、荧光的产生 物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和转动能级。
分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发



态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快， 大约10-15 s），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定， 可以通过以下几种途径释放能量返回基态。 1. 振动驰豫 2. 内转换 3. 荧光 4. 系间窜跃 5. 磷光
长不变（即固定激发单色器），依次改变荧光
发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光
强度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为
纵坐标作图，得到荧光发射光谱。荧光发射光
பைடு நூலகம்
谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发
射波长。
三、影响荧光产生及荧光强度的因素
（一）物质产生荧光的必要条件 一种物质能否发荧光以及荧光强度的高低，与它的分子结构 及所处的环境密切相关。能够发射荧光的物质都应同时具备两个 条件：