液相色谱基本原理

3. 梯度洗脱装置 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的 溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的 强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效 果，缩短分析时间的目的。 梯度洗脱装置分为两类： 一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压 下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别 用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合， 再输至柱系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混 合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色 谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序 升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶 质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度 （温度程序）来达到。
• 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先 用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温 度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变 化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离 和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液 流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合 固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 • 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正 相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 • 正相色谱法 采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基 与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶 剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异 丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时 间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如 酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
一、高压输液系统 高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱 装置和压力表 等组成。 1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢 或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数 量、符合要求的流动相。 2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中 关键部件之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动 相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品 在色谱柱中完成分离过程。由于液相色谱仪所用 色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对 流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过
色 谱
液 相 色 谱
柱 色 谱 纸 色 谱 薄 层 色 谱
高 效 液 H P L C 相 色 谱
气 相 色 谱
• 四、色谱分离原理 • 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、 液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子 对色谱法及分子排阻色谱法。 • 1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱 上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。 分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂 为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量 200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型 化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。 • 2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面， 或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据 被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分 离过程是一个分配平衡过程。
• 色谱法分类 • 按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法 (LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相 不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以 GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、 热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液 色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临 界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用 CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短， 特别适用于手性化合物的拆分。 • 按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色 谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、 凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。（此外还有电泳。） • 按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱 法。
的解离，导致样品较快流出。 • 离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
• 4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色 谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试 剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固 定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主 要用于分析离子强度大的酸碱物质。 • 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐， 如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三 氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。 • 分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化 铵、四丁基铵磷酸盐。 • 离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为 甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子 对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组 分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其 pH值、离子强度有关。
四、检测器
检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测 器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、 死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。 在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是 溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理 化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧 光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它 对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于 此类检测器有示差折光检测器、电导检测器、蒸 发光散射检测器等。
• 3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙 烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接 上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子 交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电 离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子 进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电 荷吸引力而分离。 • 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子 交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基 团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影 响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定 相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品
• 5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流 动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入 孔中，滞留时间长；大分பைடு நூலகம்量的化合物不能进入孔中，直 接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组 分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物， 如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等被分离组分在柱中 的洗脱原理
• 二、HPLC的特点和优点
• • • • • • • • • • • HPLC有以下特点： 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可 完成。 分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。 柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏*，可以收集单一组 分或做制备。
二、进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样阀等， 它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上 进行分离。进样装置要求：密封性好，死体 积小，重复性好，保证中心进样，进样时对 色谱系统的压力、流量影响小。HPLC进样 主要方式可分为：阀进样（手动）、自动进 样。
三、分离系统
分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱 柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 ~ 6mm，柱 长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱 温一般为室温或接近室温。 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相 两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的 聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较 多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱 内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。一般在 分离前备有一个保护柱，保护柱内填充物和分离柱完全一 样，这样可使流动相由于经过保护柱为其中的固定相饱和， 使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的 性能不受影响。
色谱柱，就需要高压泵注入流动相。 对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒 定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此 外，还应耐腐蚀，密封性好。 高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两 大类。 恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相 粘度和柱渗透无关。 恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力 变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵 就能提供恒定的流量。 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵， 它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多 的是机械往复泵。
二、基本原理
• 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压 下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱 效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典 液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论 而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗 粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用 高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称 为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography， HSLP)。也称现代液相色谱。
• 反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动 相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四 氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分 离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应 用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。 • 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大， 现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样 品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。 但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5 （2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键 合的烷基脱落。有新商品柱可在pH 1.5~12范围操作。
液相色谱基本原理
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一、概论
• 一、液相色谱理论发展简况 • 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase) 中的各组分经过固定相时，由于与固定相 (stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子 吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定 相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。 又称为色层法、层析法。 • 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett） 在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的， 色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基 础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、 液相色谱法。
三、高效液相色谱仪
• 高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分 离系统、检测系统、数据处理系统 等五大部分组 成。见下图 • 分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲 洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微 量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入 色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器 的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。 当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度 转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就 得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高 低的依据。