α-淀粉酶的固定化以及淀粉水解作用的检测

《α-淀粉酶的固定化与淀粉水解作用的检测》实验方案第二实验班一组组长：张金昌组员：胡建军、朱恩梅、石仙竹、谢娟丽、李昀奕、郭天天2013．10.15α-淀粉酶的固定化与淀粉水解作用的检测一、实验背景资料：1、酶：活细胞产生的具有催化作用的有机物，其中绝大多数酶是蛋白质；具有高效性、专一性，同时，也有高度不稳定性，因为绝大多数酶的本质是蛋白质，凡是能使蛋白质变性的因素，如高温、高压、强酸、强碱等都会使酶丧失活性。

2、酶促反应：指由酶作为催化剂进行催化的化学反应；3、α-淀粉酶：为枯草杆菌的α-淀粉酶，其作用的最适PH为5.5~7.5，最适温度为50~70℃。

广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。

此酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖；在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。

4、固定化酶：借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定的空间内并仍具有催化活性的酶制剂。

酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化。

吸附法是酶分子吸附于水不溶性的载体上，它的优点是操作简便，条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可以反复使用。

5、吸附剂：常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

活性炭：活性炭是一种多孔性的含炭物质, 它具有高度发达的孔隙构造, 是一种极优良的吸附剂, 每克活性炭的吸附面积更相当于八个网球埸之多. 而其吸附作用是藉由物理性吸附力与化学性吸附力达成. 其組成物质除了炭元素外，尚含有少量的氢、氮、氧及灰份，其結构则为炭形成六环物堆积而成。

由于六环炭的不规则排列，造成了活性炭多微孔体积及高表面积的特性。

硅胶：硅胶是由硅酸凝胶mSiO2·nH2O适当脱水而成的颗粒大小不同的多孔物质。

具有开放的多孔结构，比表面（单位质量的表面积）很大，能吸附许多物质，是一种很好的干燥剂、吸附剂和催化剂载体。

硅胶的吸附作用主要是物理吸附，可以再生和反复使用。

在碱金属硅酸盐（如硅酸钠）溶液中加酸，使之酸化，再加入一定量的电解质进行搅拌，即生成硅酸凝胶；或者在较浓的硅酸钠溶液中加酸或铵盐也能生成硅酸凝胶。

将硅酸凝胶静置几小时使之老化，然后用热水洗去可溶性盐类,在60～70℃下烘干并在约300℃时活化，即可得硅胶。

氧化铝：影响活性氧化铝吸附性能的主要因素包括以下几方面：（1）颗粒粒径：粒径越小，吸附容量越高，但粒径越小，颗粒强度越低，影响其使用寿命。

（2）原水PH值：当PH值大于5时，PH值越低，活性氧化铝吸附容量越高。

⑶原水初始氟浓度：初始氟浓度越高，吸附容量较大。

（3）原水碱度：原水中重碳酸根浓度高，吸附容量将降低。

（4）氯离子和硫酸根离子。

（5）砷的影响：活性氧化铝对水中的砷有吸附作用，砷在活性氧化铝上的积聚造成对氟离子吸附容量的下降，且使再生时洗脱砷离子比较困难。

6、石英砂：是石英石经破碎加工而成的石英颗粒，石英石是一种非金属矿物质，是一种坚硬、耐磨、化学性能稳定的硅酸盐矿物，其主要矿物成分是SiO2，石英砂的颜色为乳白色、或无色半透明状，硬度7，石英砂是重要的工业矿物原料，非化学危险品，广泛用于玻璃、铸造、陶瓷及耐火材料、冶炼硅铁、冶金熔剂、冶金、建筑、化工、塑料、橡胶、磨料等工业。

因为其性质稳定、能耐酸、耐碱、耐磨，腐蚀性小，不易燃烧，廉价，所以选择石英砂作为酶的吸附剂。

7、为何选用石英砂？石英砂作为酶的吸附剂的优缺点：固定化酶有许多方法，本实验中采用的是吸附法。

吸附法有物理交换法和离子交换法两种。

其中本实验采用的又是物理交换法。

该方法是将酶蛋白的分子吸附在惰性载体上，但要选择不引起变性且能保持一定酶活力的载体，且对蛋白质要有高度吸附能力。

自然界中有机硅胶、活性炭和石英砂等都可以被用于做载体。

现已了解其中石英砂对固定化α-淀粉酶、胰蛋白酶作用较好。

优点：石英砂表面带正电荷，蛋白质为两性物质，在大于其等电点的条件下，蛋白质带负电荷，由此能吸附在石英砂表面，α-淀粉酶被石英砂吸附属于物理吸附法，将蛋白质分子吸附在惰性载体（石英砂）上，酶不会引起变性，且能保持一定酶活力，对蛋白质有高度吸附能力。

缺点：是非金属矿物质，不具有多孔结构，在吸附性上稍差，同时，石英砂质脆，坚硬，易磨细，不利于过滤。

吸附剂一般有孔结构，对吸附质有强烈吸附能力，一般不与吸附质和介质发生化学反应，有良好机械强度等，如活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

8、固定化酶与游离酶的比较：9、淀粉遇碘变蓝：直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。

这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。

纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度。

10、碘遇淀粉和糊精显不同的颜色：以前认为，淀粉能吸附碘，使碘吸收的可见光的波长向短的波长方向移动，棕色的碘液就变成蓝色。

同理，支链淀粉和糊精也能吸附碘，不过吸附的程度不同，因此呈现的颜色不同。

这种解释的有力根据是碘的淀粉液在加热时蓝色消失。

这就被认为是加热后分子动能增大，引起解吸的缘故。

近年来用先进的分析技术(如X射线、红外光谱等)研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。

直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。

碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。

碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。

在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。

淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。

在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。

例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32 000～160 000时，包合物的颜色是蓝色。

分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。

糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。

11、对比中学课本上的这个实验步骤，和我们实验指导上的有何不同？中学课本在该实验的第六步添加了与样品2 做对比，课本没有这一步。

注意：加入“稀释1倍的流出液”这一步，目的是防止所取的流出液，由于流速没有控制好的原因，会导致所取的溶液中掺有淀粉，稀释一倍后，加入KI-I2，使更加偏红色，使其与对照组的颜色差异更明显。

二、实验目的1、中学中，在必修一中学习了“酶的作用和本质、酶的特性”，而此实验在选修一《生物技术实践》中出现，为了让同学通过实验来具体的了解酶的作用，化抽象为具象，对酶的作用加深理解；2、了解制备固定化酶的方法—吸附法，让中学生理解固定化酶对淀粉水解的作用；3、理解并掌握实验室中淀粉水解的测定方法；4、进一步掌握运用对照来观察实验结果。

三、实验原理1、淀粉（遇碘显蓝色）→【α-淀粉酶】→糊精（遇碘显红色）→【ß-淀粉酶】→麦芽糖（遇碘不显色）→【糖化淀粉酶】→葡萄糖（遇碘不显色）2、运用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上。

一定浓度的淀粉溶液经过固定化的α-淀粉酶催化后，生成糊精，使流出液加入KI-I2指示液后呈红色，表明水解产物糊精生成。

3、固定化装置—层析柱四、实验器具和试剂1、α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测试剂盒（α-淀粉酶、石英砂、可溶性淀粉、5mmol/L KI-I2溶液），固定化酶装柱（层析柱），滤布，电炉，水浴锅，50ml烧杯，5ml 试管4支，5ml量筒，胶头滴管，玻璃棒，电子天平，支架。

2、5mol/L KI-I2溶液的配置方法：碘化钾0.83g；蒸馏水100ml；碘0.127g。

先将碘化钾溶于蒸馏水中，待全部溶解后再加碘，振荡溶解。

（注：将此液保存在棕色玻璃瓶内。

）【注意：配置时KI的作用：在三种可溶于水中的卤素单质中碘的溶解度是最小的，不过由于在第四层有空的七个f轨道，这些轨道可以用来容纳其它能够为碘提供电子的原子、离子或原子团，而恰好，碘原子就是那个可以为碘提供电子的供体，每个碘原子可以为一个碘的阴离子提供一个电子，而每个碘的阴离子可以接受两个碘原子的两个电子，形成了一种I3-的原子团，而这种原子团和很多阴离子或酸根一样是可溶于水的，所以间接增加了碘单质在水中的溶解度。

稳定的碘化物（只要能电离出碘离子就可以和碘形成配合物——I3-离子）可以作为碘在水中的助溶剂，而且碘与碘离子不会因为形成I3-离子而使碘失去原有性质与功能是因为碘与碘离子的反应是可逆的（当碘在消耗过程中减少时，I3-离子就会逆过来变成碘离子和碘单质了，碘又变回来，并且随着碘的不断消耗，I3-离子会不断逆向进行直至接近完全分解成碘单质和碘离子，这样碘就不怕因反应而消耗掉了）所以增加碘化钾这类可以提供碘离子的可溶于水的溶质可以增大碘单质在水中的溶解度，否则试验配置的碘溶液浓度即便很小，但对于碘来说可能早就过饱和了，所以增加适量的像碘化钾这样的助溶剂才可得到试验要求的浓度的。

】五、实验步骤【配置→固定→洗→吸附→装柱→洗柱→溶解淀粉过柱→检测】1、配置可溶性淀粉溶液。

（已完成）取可溶性淀粉溶于沸水。

（可溶性淀粉先用冷水调成糊状，再加入沸水中。

这样溶解才会形成澄清的溶液）将配置好的淀粉溶液放置在60℃（酶的最适温度50℃~70℃，使后期淀粉酶经过时能达到酶的最高催化活性）的水浴锅（水浴锅中添加去离子水）中备用。

【此处淀粉浓度配置过低，有待预实验期间调试。

】调试方法：设置淀粉浓度梯度2、α-淀粉酶的固定化。

（材料已称量好，固定15min ）在50ml 烧杯中将5mg α-淀粉酶溶于4ml 蒸馏水中。

（注意：由于酶不纯，可能有些不溶物。

）再加入5g 石英砂，不时搅拌（搅拌切忌太用力），固定15min 。

（使酶能吸附到石英砂表面）3、检验未吸附的游离淀粉酶。

（5min ）小心倒掉上清液后（未吸附的游离淀粉酶应该在上清液中），用10~15ml 的蒸馏水小心清洗石英砂2~3次，每次取其上清液0.5ml 于试管中，同时滴加淀粉溶液充分混匀。

再加入1滴KI-I2溶液，若溶液变为蓝色，说明上清液中已无游离α-淀粉酶，如果溶液为红色，继续用蒸馏水清洗，直至淀粉溶液变为蓝色为止。

（检验未吸附的游离淀粉酶是否洗涤干净，每次蒸馏水洗涤都可以使未吸附的游离淀粉酶溶于上清液，而游离淀粉酶可以与加入的淀粉溶液反应，产生的糊精遇碘变红。

单纯的淀粉溶液与碘反应会变蓝色。

）4、先把滤布（可以考虑滤纸片，使石英砂不从注射器中漏出）放于固定化酶柱中，再装入有α-淀粉酶的石英砂约4ml ，装柱过程中可在装有石英砂的烧杯中加入少量蒸馏水（便于石英砂流入层析柱），同时适当打开层析柱的调节装置（使多余的液体流出）。