基因工程 外源基因导入及转化子筛选鉴定
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抗药性筛选法可区分转化子
与非转化子、重组子与非重 组子 将外源DNA片段插在EcoRI位 非重组子呈 点： Apr、Tcr
Pvu I Pst I Apr EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH I
Tcr
pBR322
4363 bp
ROI ROP
Sal I
重组子呈 Apr、Tcr 将外源DNA片段插在BamHI位 非重组子呈 点： 重组子呈 Apr、Tcr
二、 转化率
（一）转化率的定义
转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义
为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体 细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下， 每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此 转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转 化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在 筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）
（2） 细菌原生质体的转化：
取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原 生质体），加入10 - 20 ml DNA重组连接液，同 时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀 （3）细菌原生质体的再生：
原生质体再生的主要目的是使细菌重新长
出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行， 内含脯氨酸和微量元素
昆虫细胞（家蚕）
具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁
殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定
DNA重组操作系统欠完善
适用于真核生物基因的高效表达
哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）
与人的亲缘关系近，分子重组表达系统
健全，具有合适的糖基化修饰系统 细胞培养条件苛刻，生长缓慢 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、
AP 氨基喋呤 TK 胸腺嘧啶核苷激酶
TR
dTMP
dTDP
dTTP
（三）显色筛选法
（1）显色筛选法的基本原理：
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可
区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携
带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色
反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒
pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质
Bal I
ori
Hind II
Apr、Tcs
（2）抗药性筛选法的基本操作：
先将转化液涂布含有Ap
的平板再将Ap平板上的
Ap
转化子影印至含有Ap和
Tc的平板上 挑 选 影 印
Ap + Tc
在Ap平板上生长、但在
Ap和Tc平板上不长的转 化子即为重组子
（二）营养缺陷型筛选法
（1）营养缺陷型筛选法的基本原理：
粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等
（2）显色筛选法的基本操作：
将 外 源 基 因 克 隆 在 pUC18 的
lacZ’ 标记基因内部，使之灭活， 此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄 色菌落；而非重组子则呈 Apr 、 lacZ+，蓝色菌落 Ap + X-gal 重组子（Apr + lacZ-）
原生质体转化
109 个原生质体
106 - 107 / mg DNA 105 - 106 / mg DNA 107 - 108 / mg DNA 106 - 109 / mg DNA
50 ng DNA
转化方法：
Ca2+诱导转化 原生质体转化 l-DNA转染 电穿孔转化
三、转化细胞的扩增 扩增操作
转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞
用于接受l-DNA：LE392、ED8654 酵母菌
毕赤酵母 啤酒酵母
哺乳动物细胞 CHO
2.5.2 重组DNA导入受体细胞的途径 转化的原理与技术
转化率 转化细胞的扩增
一、转化的原理与技术
（一）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴 性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，
插入片段的大小：
对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低
（2）受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如： pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低； 但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高
（3）转化方法方面：
受体细胞的预处理：影响最大 供受体的比例：
Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA
感染寄生缺陷型
防止重组细菌扩散污染，生物武器除外
二、各种基因工程受体的特性
大肠杆菌
遗传背景清楚，载体受体系统完备，生
长迅速，培养简单，重组子稳定
产结构复杂、种类繁多的内毒素
适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生
物基因的高效表达、基因文库的构建，是
DNA重组实验和基因工程的主要受体菌
枯草杆菌
遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长 迅速，培养简单，不产内毒素
需 2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也
就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA
（二）转化率的用途
利用转化率和重组率等参数可以帮助设计 DNA重组实验
规模 例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg 载体，经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍， 欲获得104个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？ 若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要： 104 / 107 X 10 - 2 = 0.1 mg 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5 mg 载体DNA 载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求
如果外源DNA片段也是2.7 kb，
lacZ’ pUC18 2.7 kb Apr ori
最好选用单一切口的酶将质粒线
型化，然后通过其长度来鉴定其 是否为重组子
1.0 kb 区分重组子与非重组子
如果外源DNA片段插在pUC18 的SphI位点处，原则上也可用
0.8 kb P S
S
B
4.0 kb
（四）电穿孔转化
将待转化的质粒或 DNA 重组连接液加在电穿孔转化
仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，
细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或 DNA 重组分子便 可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结 构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验
（1）全酶解图谱法：
区分重组子与非重组子 用BamHI酶切转化子质粒DNA 电泳观察酶解产物片段 重组子： 2.7 kb + 4.0 kb 非重组子： 2.7 kb 1.0 kb B E
4.0 kb
0.8 kb P B
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
（三）l噬菌体DNA的转染
（1）感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养 基中培养至OD600 = 0.5 （2）吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟 （3）转染裂解： 加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养 液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选
遗传欠稳定，载体受体系统欠完备
适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋
白多肽的有效分泌
链霉菌
抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简
便，不产内毒素 遗传不稳定，生长相对缓慢 主要用于抗生素生产菌株的改良
酵母菌
具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅 速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 内源性蛋白产物种类繁多且含量高 适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因 的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调 控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性 受体菌
2.5 重组DNA导入受体细胞
受体细胞 重组DNA导入受体细胞的途径
克隆子的筛选
2.5.1 受体细胞 一、受体细胞应具备的条件
限制性缺陷型
外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）
重组整合缺陷型
用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）
具有较高的转化效率
具有与载体选择标记互补的表型
例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克 pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18 共有3.4X1011个分子（ 6.02X1017 / 2686X660），也就是 说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞
另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共
算出（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选
（三）转化率的影响因素 （1）载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质：
不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同
载体的空间构象：
质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载
体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的 超螺旋质粒低两个数量级
（二）细菌原生质体的转化
革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）
接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类 细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态） 转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体 法进行转化
（1）细菌原生质体的制备：
不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以 链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如 34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞 壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始 终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体 接触的所有器皿应保持无水无去污剂
（2）大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：
取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组 DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温 2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 加入1 ml 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选
的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化
操作偶联在一起，如：
Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时
原生质体转化后的再生过程
l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作
扩增操作的目的
增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞
用于筛选程序
扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选
表达外源基因，便于筛选和鉴定
Βιβλιοθήκη Baidu
其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶
结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出
现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态
（1）大肠杆菌感受态细胞的制备：
100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体 用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，
离心收集菌体
用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用
lacZ' ori
pUC18
r Ap
二、 克隆DNA序列检测
（一）限制性酶切图谱法
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入 的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目 的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅 能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重 组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选 时，工作量极大，实验成本也高。
基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主
要哺乳动物受体
植物细胞（拟南芥菜、烟叶）
农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于 分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用
遗传操作繁琐
适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药
物的生产，农作物品质的改良
三、 实验室常用的基因工程受体
大肠杆菌 用于接受质粒：C600、W3110、HB101、 JM83、 JM101（Aps、Tcs、Cms）
营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转
化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原
理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基
因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，
将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，
长出的便是转化子
（2）常见的营养缺陷型筛选标记：
用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激 酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型 哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径： AP dCDP TK dTDP dTTP
2.5.3 转化子的筛选和鉴定（检）
载体遗传标记检测
克隆DNA序列检测
外源基因产物检测
由于重组率和转化率不可能达到理想极限， 因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子 与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子 与非目的重组子
转化子
重组子
目的重组子
一、 载体遗传标记检测
（一）抗药性筛选法
（1）抗药性筛选法的基本原理：
与非转化子、重组子与非重 组子 将外源DNA片段插在EcoRI位 非重组子呈 点： Apr、Tcr
Pvu I Pst I Apr EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH I
Tcr
pBR322
4363 bp
ROI ROP
Sal I
重组子呈 Apr、Tcr 将外源DNA片段插在BamHI位 非重组子呈 点： 重组子呈 Apr、Tcr
二、 转化率
（一）转化率的定义
转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义
为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体 细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下， 每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此 转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转 化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在 筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）
（2） 细菌原生质体的转化：
取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原 生质体），加入10 - 20 ml DNA重组连接液，同 时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀 （3）细菌原生质体的再生：
原生质体再生的主要目的是使细菌重新长
出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行， 内含脯氨酸和微量元素
昆虫细胞（家蚕）
具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁
殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定
DNA重组操作系统欠完善
适用于真核生物基因的高效表达
哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）
与人的亲缘关系近，分子重组表达系统
健全，具有合适的糖基化修饰系统 细胞培养条件苛刻，生长缓慢 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、
AP 氨基喋呤 TK 胸腺嘧啶核苷激酶
TR
dTMP
dTDP
dTTP
（三）显色筛选法
（1）显色筛选法的基本原理：
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可
区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携
带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色
反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒
pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质
Bal I
ori
Hind II
Apr、Tcs
（2）抗药性筛选法的基本操作：
先将转化液涂布含有Ap
的平板再将Ap平板上的
Ap
转化子影印至含有Ap和
Tc的平板上 挑 选 影 印
Ap + Tc
在Ap平板上生长、但在
Ap和Tc平板上不长的转 化子即为重组子
（二）营养缺陷型筛选法
（1）营养缺陷型筛选法的基本原理：
粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等
（2）显色筛选法的基本操作：
将 外 源 基 因 克 隆 在 pUC18 的
lacZ’ 标记基因内部，使之灭活， 此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄 色菌落；而非重组子则呈 Apr 、 lacZ+，蓝色菌落 Ap + X-gal 重组子（Apr + lacZ-）
原生质体转化
109 个原生质体
106 - 107 / mg DNA 105 - 106 / mg DNA 107 - 108 / mg DNA 106 - 109 / mg DNA
50 ng DNA
转化方法：
Ca2+诱导转化 原生质体转化 l-DNA转染 电穿孔转化
三、转化细胞的扩增 扩增操作
转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞
用于接受l-DNA：LE392、ED8654 酵母菌
毕赤酵母 啤酒酵母
哺乳动物细胞 CHO
2.5.2 重组DNA导入受体细胞的途径 转化的原理与技术
转化率 转化细胞的扩增
一、转化的原理与技术
（一）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴 性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，
插入片段的大小：
对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低
（2）受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如： pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低； 但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高
（3）转化方法方面：
受体细胞的预处理：影响最大 供受体的比例：
Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA
感染寄生缺陷型
防止重组细菌扩散污染，生物武器除外
二、各种基因工程受体的特性
大肠杆菌
遗传背景清楚，载体受体系统完备，生
长迅速，培养简单，重组子稳定
产结构复杂、种类繁多的内毒素
适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生
物基因的高效表达、基因文库的构建，是
DNA重组实验和基因工程的主要受体菌
枯草杆菌
遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长 迅速，培养简单，不产内毒素
需 2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也
就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA
（二）转化率的用途
利用转化率和重组率等参数可以帮助设计 DNA重组实验
规模 例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg 载体，经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍， 欲获得104个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？ 若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要： 104 / 107 X 10 - 2 = 0.1 mg 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5 mg 载体DNA 载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求
如果外源DNA片段也是2.7 kb，
lacZ’ pUC18 2.7 kb Apr ori
最好选用单一切口的酶将质粒线
型化，然后通过其长度来鉴定其 是否为重组子
1.0 kb 区分重组子与非重组子
如果外源DNA片段插在pUC18 的SphI位点处，原则上也可用
0.8 kb P S
S
B
4.0 kb
（四）电穿孔转化
将待转化的质粒或 DNA 重组连接液加在电穿孔转化
仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，
细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或 DNA 重组分子便 可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结 构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验
（1）全酶解图谱法：
区分重组子与非重组子 用BamHI酶切转化子质粒DNA 电泳观察酶解产物片段 重组子： 2.7 kb + 4.0 kb 非重组子： 2.7 kb 1.0 kb B E
4.0 kb
0.8 kb P B
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
（三）l噬菌体DNA的转染
（1）感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养 基中培养至OD600 = 0.5 （2）吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟 （3）转染裂解： 加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养 液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选
遗传欠稳定，载体受体系统欠完备
适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋
白多肽的有效分泌
链霉菌
抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简
便，不产内毒素 遗传不稳定，生长相对缓慢 主要用于抗生素生产菌株的改良
酵母菌
具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅 速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 内源性蛋白产物种类繁多且含量高 适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因 的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调 控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性 受体菌
2.5 重组DNA导入受体细胞
受体细胞 重组DNA导入受体细胞的途径
克隆子的筛选
2.5.1 受体细胞 一、受体细胞应具备的条件
限制性缺陷型
外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）
重组整合缺陷型
用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）
具有较高的转化效率
具有与载体选择标记互补的表型
例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克 pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18 共有3.4X1011个分子（ 6.02X1017 / 2686X660），也就是 说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞
另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共
算出（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选
（三）转化率的影响因素 （1）载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质：
不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同
载体的空间构象：
质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载
体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的 超螺旋质粒低两个数量级
（二）细菌原生质体的转化
革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）
接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类 细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态） 转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体 法进行转化
（1）细菌原生质体的制备：
不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以 链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如 34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞 壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始 终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体 接触的所有器皿应保持无水无去污剂
（2）大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：
取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组 DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温 2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 加入1 ml 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选
的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化
操作偶联在一起，如：
Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时
原生质体转化后的再生过程
l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作
扩增操作的目的
增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞
用于筛选程序
扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选
表达外源基因，便于筛选和鉴定
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其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶
结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出
现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态
（1）大肠杆菌感受态细胞的制备：
100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体 用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，
离心收集菌体
用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用
lacZ' ori
pUC18
r Ap
二、 克隆DNA序列检测
（一）限制性酶切图谱法
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入 的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目 的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅 能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重 组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选 时，工作量极大，实验成本也高。
基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主
要哺乳动物受体
植物细胞（拟南芥菜、烟叶）
农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于 分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用
遗传操作繁琐
适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药
物的生产，农作物品质的改良
三、 实验室常用的基因工程受体
大肠杆菌 用于接受质粒：C600、W3110、HB101、 JM83、 JM101（Aps、Tcs、Cms）
营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转
化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原
理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基
因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，
将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，
长出的便是转化子
（2）常见的营养缺陷型筛选标记：
用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激 酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型 哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径： AP dCDP TK dTDP dTTP
2.5.3 转化子的筛选和鉴定（检）
载体遗传标记检测
克隆DNA序列检测
外源基因产物检测
由于重组率和转化率不可能达到理想极限， 因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子 与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子 与非目的重组子
转化子
重组子
目的重组子
一、 载体遗传标记检测
（一）抗药性筛选法
（1）抗药性筛选法的基本原理：