【精品课件】质粒和噬菌体
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噬菌体展示技术和其应用ppt课件
2024/3/30
25
应用举例：
部分做过的工作
2024/3/30
26
一、半合成噬菌体抗体库的构建
构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总 RNA 扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插 入pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗 体（HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化 CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随 机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链 质粒库中，得半合成人Fab质粒库。
成3节段
2024/3/30
17
M13噬菌体
丝 状 噬 菌 体
λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体
蝌 蚪 形 噬 菌 体
2024/3/30
18
T7与M13相比优势明显
T7Select的优势 解释
是在细胞质中表 达的裂解性噬菌 体
C-端融合
与M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白无需分泌。
插入序列被克隆到T7Select载体基因10 的C-端，可以使带有终止密码子的 插入子得以表达和展示。
2024/3/30
34人源噬菌体Fab抗体半合成的构建将酶切纯化的重链重叠PCR产M13的超感染 下，繁殖出表算出κ＋Fd（包括CDR3-5个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR： 其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率 为60％左右。
κ 链 文 库 的 容 量 为 5.03×106,λ 链 文 库 的 容 量 为 6.8×106(多次建库混合后的库容量)。
从平板上随机挑取10个菌落，涂为70％。
载体克隆容量大 T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不稳定。
大肠杆菌、质粒和噬菌体
细菌质粒性质：
5、质粒对于细菌的生长不是必须的
代表性细菌质粒（1）
F因子（fertility factor）
F因子，又称致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，环状双链DNA，编码94个中 等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。 存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。
★ 菌株基因优化：生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型 （例如β 半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆实验。 ★ 操作简便，表达量高：大肠杆菌操作和培养条件简单，适于大规模发酵。表 达的外源基因蛋白量甚至可以达到细菌总蛋白的80%。
大肠杆菌在分子生物学实验中的应用
缺点：
★ 基因结构差异：大多数真核基因含有内含子，细菌中没有除去内含子机制，外源基因 编码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和5’非编码区 原核：CDNA 真核：DNA
划线到LB平板上。
质粒概述
质粒（plasmid）是染色体以外能 自主复制的遗传因子
不具有胞外期
对寄主细胞来说是非必需的 符合这三条标准的染色体外DNA或 RNA分子都可以称为质粒。 狭义的质粒：一般是指细菌染色体外的 环状DNA分子。 质粒的命名：一个小写字母p加2-3个 大写字母和数字，如pBV220，pET30 。
大肠杆菌、质粒和噬菌体
郑丽舒
中国疾控中心 病毒病预防控制所
2015.04.15
主要内容
一、大肠杆菌：概述 应用 基本操作 二、质粒：常见质粒 质粒的分离纯化 感受态细胞 质粒转化 三、噬菌体：λ噬菌体及其载体 M13噬菌体及其载体 四、分子克隆
大肠杆菌
大肠杆菌
中文名称： 外文名称： 大肠杆菌 Escherichia coli (Theodor Escherich 1885)
6第六章细菌和噬菌体的遗传-PPT课件
（1）F－×F+
杂交时，F+的性纤毛在二者间形成接合管→F+中 的F质粒在O点处切开，以O为先导，F拖后，按 滚环复制的方式拷贝并转移到F－中→产生两个 F+→F+的染色体几乎没有进入F－→两种细菌的染 色体未发生重组。 O F F质粒
染 色 体
F质粒
接合
F＋ F－
（2）Hfr× F－
杂交时，Hfr细菌的性纤毛在二者间形成接合 管→结合态的F质粒在O点处切开，形成两端－ 一端为O点,一端为基因F→以O为先导，F拖后， 按滚环复制方式向F－转移→进入F－的Hfr菌染 色体上的基因与F－染色体间发生交换重组→重 组频率高于游离态1000倍，因此称高频重组菌 株。
·
这种通过不同时间分别阻断细菌的有性接合， 从而确定细菌染色体上的基因距离的方法，称 细菌阻断交配基因作图法。
3、重组方式
接合时，供体染色体片段（外基因子）进 入受体细胞→同受体染色体的同源区段 （内基因子）进行配对→形成部分二倍体 →发生交换重组： 单交换→产生不平衡的线性染色体 双交换→有活性的重组体和线性片段（在 细胞分裂中丢失。
第六章 细菌和病毒的遗传重组
第一节 第二节 细菌的遗传基础和遗传分析 噬菌体的遗传基础和和遗传分析
第一节 细菌的遗传基础和遗传分析
一、细菌的遗传基础
原核生物 真核生物
裸露的DNA分子 DNA呈环状 单倍体，基因单个存 在
DNA与蛋白质结合成染色体 DNA呈线状 二倍体，常染色体上基因成 对
（一）细菌细胞
整合过程 O F F质粒
主染色体
整合过程 O F F质粒 O F
a bHfr细菌 d
e
根据F因子，细菌分为： 雌性细菌(受体细菌，F－）－不含F因子，表面无性 纤毛。
《质粒和噬菌体》课件
根据质粒的复制子可分为滚环复制型质粒和复制环复制型质粒。
根据质粒的用途可分为抗生素抗性基因质粒、代谢缺陷型质粒、温度敏感型质粒等 。
02
质粒的复制和传播
质粒的复制
自主复制
质粒能够独立于宿主染色体进行复制，并保持稳定的遗传特性。
复制起点
质粒复制起始于特定的DNA序列，称为复制起点或Ori。
复制酶
质粒复制需要特定的复制酶，这些酶能够识别并催化Ori序列，启动DNA复制。
自我复制
噬菌体在宿主细胞内复制 增殖，最终导致宿主细胞 裂解，释放出子代噬菌体 。
无独立生活能力
噬菌体没有独立的代谢和 能量转化能力，只能在宿 主细胞内才能进行正常的 生命活动。
噬菌体的种类
根据基因组的不同，噬菌体可以分为 DNA噬菌体和RNA噬菌体两大类。
根据形态的不同，噬菌体可以分为蝌 蚪形、微球形、丝形、棒形等不同类 型。
生物信息学研究
质粒和噬菌体的基因序列 可用于生物信息学分析， 研究基因组学、进化关系 等生物学问题。
THANKS
感谢观看
质粒复制和传播的机制
复制与传播的关联
质粒复制和传播机制密切相关， 复制酶在复制过程中也参与质粒
的传播。
接合作用
在转化过程中，质粒DNA通过细 菌的膜通道进入受体细胞，与受体 细胞染色体整合或独立复制。
重组与整合
在转导过程中，质粒DNA与噬菌体 DNA发生重组，通过噬菌体的感染 和整合酶的作用，将质粒DNA整合 到受体细胞染色体中。
04
噬菌体的复制和生命周期
噬菌体的复制周期
侵入
噬菌体通过融合、出芽或注入 等方式将遗传物质注入宿主细 胞内。
组装
新的噬菌体DNA与蛋白质外壳 结合，形成完整的噬菌体粒子 。
根据质粒的用途可分为抗生素抗性基因质粒、代谢缺陷型质粒、温度敏感型质粒等 。
02
质粒的复制和传播
质粒的复制
自主复制
质粒能够独立于宿主染色体进行复制，并保持稳定的遗传特性。
复制起点
质粒复制起始于特定的DNA序列，称为复制起点或Ori。
复制酶
质粒复制需要特定的复制酶，这些酶能够识别并催化Ori序列，启动DNA复制。
自我复制
噬菌体在宿主细胞内复制 增殖，最终导致宿主细胞 裂解，释放出子代噬菌体 。
无独立生活能力
噬菌体没有独立的代谢和 能量转化能力，只能在宿 主细胞内才能进行正常的 生命活动。
噬菌体的种类
根据基因组的不同，噬菌体可以分为 DNA噬菌体和RNA噬菌体两大类。
根据形态的不同，噬菌体可以分为蝌 蚪形、微球形、丝形、棒形等不同类 型。
生物信息学研究
质粒和噬菌体的基因序列 可用于生物信息学分析， 研究基因组学、进化关系 等生物学问题。
THANKS
感谢观看
质粒复制和传播的机制
复制与传播的关联
质粒复制和传播机制密切相关， 复制酶在复制过程中也参与质粒
的传播。
接合作用
在转化过程中，质粒DNA通过细 菌的膜通道进入受体细胞，与受体 细胞染色体整合或独立复制。
重组与整合
在转导过程中，质粒DNA与噬菌体 DNA发生重组，通过噬菌体的感染 和整合酶的作用，将质粒DNA整合 到受体细胞染色体中。
04
噬菌体的复制和生命周期
噬菌体的复制周期
侵入
噬菌体通过融合、出芽或注入 等方式将遗传物质注入宿主细 胞内。
组装
新的噬菌体DNA与蛋白质外壳 结合，形成完整的噬菌体粒子 。
噬菌体PPT课件
效价指噬菌体悬液的浓度。即噬菌体数/ml样品。
斑点试验法 液体稀释管法 双层平板法 单层平板法 快速玻片法
涂布菌液液
45C培养
···
斑点试验法
噬菌斑
液体稀释管法
试样（ 未知效价的噬菌体液）
计数管中完整宿主细胞数 （定时取样对活细胞计数）
培养液和宿主细胞
噬菌体数=原细胞数 — 活细胞数
双层平板法
4、糖浆剂(Syrupus, syr.)：系 指含有药物(药材提取物)或芳香 物质的浓蔗糖水溶液制剂，其目 的在于掩盖某些药物的不良气味 。使药物易于服用，尤适于儿童
，如咳必清糖浆、急支糖浆。
5、注射剂(Injection, Amp·)：
系指药物制成的无菌溶液， 无菌混悬液或供临用前配成液 体，无菌粉末，专供注射入体 内的制剂，前二者称液体注射 剂(注射液)后者包括注射用粉 剂(粉针剂，如青霉素等)。 大输液（＞100ml)
噬菌体的应用
细菌的鉴定与分型 分子生物学研究的工具
依据：结构简单，基因数目少，培 养方便，生长迅速，遗传和变异易于控制 和辨认。
细菌感染的诊断与治疗 若在某一标本中检出某种噬菌体数
量较多，表明有相应的细菌存在。
复习思考题
一、名词解释： 温和噬菌体、毒性噬菌体、前噬菌 体、溶源性细菌
二、问题： 1、简述两种不同噬菌体的生活史。
法，第二卷（1981）和第三卷（1998）均收 载质量标准规格。
二、药物剂型
剂型：为了发挥药物最大的疗效，减少副作用及 毒性，便于应用及贮存运输，根据药物的性质， 用药目的及给药途径，将原料药加工制成适宜的 给药形式。 制剂：根据药典、制剂规范或其它现成的处方，
常用剂型：按形态可分为液体剂型、半固体
斑点试验法 液体稀释管法 双层平板法 单层平板法 快速玻片法
涂布菌液液
45C培养
···
斑点试验法
噬菌斑
液体稀释管法
试样（ 未知效价的噬菌体液）
计数管中完整宿主细胞数 （定时取样对活细胞计数）
培养液和宿主细胞
噬菌体数=原细胞数 — 活细胞数
双层平板法
4、糖浆剂(Syrupus, syr.)：系 指含有药物(药材提取物)或芳香 物质的浓蔗糖水溶液制剂，其目 的在于掩盖某些药物的不良气味 。使药物易于服用，尤适于儿童
，如咳必清糖浆、急支糖浆。
5、注射剂(Injection, Amp·)：
系指药物制成的无菌溶液， 无菌混悬液或供临用前配成液 体，无菌粉末，专供注射入体 内的制剂，前二者称液体注射 剂(注射液)后者包括注射用粉 剂(粉针剂，如青霉素等)。 大输液（＞100ml)
噬菌体的应用
细菌的鉴定与分型 分子生物学研究的工具
依据：结构简单，基因数目少，培 养方便，生长迅速，遗传和变异易于控制 和辨认。
细菌感染的诊断与治疗 若在某一标本中检出某种噬菌体数
量较多，表明有相应的细菌存在。
复习思考题
一、名词解释： 温和噬菌体、毒性噬菌体、前噬菌 体、溶源性细菌
二、问题： 1、简述两种不同噬菌体的生活史。
法，第二卷（1981）和第三卷（1998）均收 载质量标准规格。
二、药物剂型
剂型：为了发挥药物最大的疗效，减少副作用及 毒性，便于应用及贮存运输，根据药物的性质， 用药目的及给药途径，将原料药加工制成适宜的 给药形式。 制剂：根据药典、制剂规范或其它现成的处方，
常用剂型：按形态可分为液体剂型、半固体
入噬菌体及质粒载体
理想的质粒载体
(1)分子量小、多拷贝、松弛控制型; (2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点; (3)能插入较大的外源DNA片段; (4)具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和 筛选。 (5)对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一 般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、 PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
Β-半乳糖苷酶失活的插入型载体
• 载体基因组中含有一个大肠杆菌的 lac5区段，编码着Β-半乳糖苷酶基因 lacZ。由这种载体感染到的大肠杆菌 lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal 的培养基上就会形成蓝色的噬菌斑。
替换型载体
• λ噬菌体的中央部分有一个可以被外源插入 的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。
质粒载体的优缺点
• 质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源 蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。 • 1.与外源DNA重组操作简便； • 2.外源DNA在质粒载体中相对较稳定， • 3.质粒DNA的制备和纯化方便，快速简单，所以 得到广泛应用。 • 缺点： • 1.它容纳外源DNA片段有限，通常最多为15kb左 右，因为当质粒大于15kb时，转化效率明显下降。
质粒载体
质粒特点
• ①染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed
circuar DNA,cccDNA）可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯
化，＞15kb的大质粒则不易提取。
• ②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous
注 意
• λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶
菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基
大肠杆菌分子克隆载体课件
ⅰ) 调控基因： CⅢ 、N 、CI 、Cro 、CⅡ— 决定进入溶源 化还是裂解状态
ⅱ) DNA复制： O 、P 、Q
ⅲ)λ重组： int 、xis 、redβ和gam
ⅳ)噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头(A-F)、尾(E-J) 、S & R (细胞裂解) λ中部约1/3的DNA(b2)与λ存活无关 。
如插入片段的5’段定向缺失: XbaI→SphI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase; 插入片段的3’-端亦可采用类似的方法进行缺 失(SmaI→SstI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase)
不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又 例如: pBS+ 多克隆位点区的排列顺序是(见图)： 假设有一EcoRI→HindⅢ DNA片段，并要求在其3’末端或5’-端接上另外的DNA片段(如终止子、启动子)， 显然， pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用 pBS+ 中的多克隆位点区就能满足要求。
ⅲ. 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的
绘制。
除上述三个特点外， pUC系列载体还可用于表达外源 基因 (噬菌体载体
1. 噬菌体λ载体
1) λ的结构和特点
i. 一般结构： 48,502bp，线状ds-DNA，两端具有12n.t 5‘
- 突 起 ( 5 ’ - GGGCGGCGACCT- 3 ’ ) 该 末 端 称 为 cos位 点，可被λ编码的末端酶所识别(该酶由λ末端的两个 基因Nul和A编码蛋白gpNul和gpA组成) ii. 基因结构—46个基因，分为以下四类：
供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。 ⅲ.重组转移(conduction) —若质粒无oriT，该质粒只
ⅱ) DNA复制： O 、P 、Q
ⅲ)λ重组： int 、xis 、redβ和gam
ⅳ)噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头(A-F)、尾(E-J) 、S & R (细胞裂解) λ中部约1/3的DNA(b2)与λ存活无关 。
如插入片段的5’段定向缺失: XbaI→SphI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase; 插入片段的3’-端亦可采用类似的方法进行缺 失(SmaI→SstI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase)
不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又 例如: pBS+ 多克隆位点区的排列顺序是(见图)： 假设有一EcoRI→HindⅢ DNA片段，并要求在其3’末端或5’-端接上另外的DNA片段(如终止子、启动子)， 显然， pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用 pBS+ 中的多克隆位点区就能满足要求。
ⅲ. 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的
绘制。
除上述三个特点外， pUC系列载体还可用于表达外源 基因 (噬菌体载体
1. 噬菌体λ载体
1) λ的结构和特点
i. 一般结构： 48,502bp，线状ds-DNA，两端具有12n.t 5‘
- 突 起 ( 5 ’ - GGGCGGCGACCT- 3 ’ ) 该 末 端 称 为 cos位 点，可被λ编码的末端酶所识别(该酶由λ末端的两个 基因Nul和A编码蛋白gpNul和gpA组成) ii. 基因结构—46个基因，分为以下四类：
供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。 ⅲ.重组转移(conduction) —若质粒无oriT，该质粒只
质粒的构建.正式版PPT文档
载体lacZ’与互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码肽与这个 缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使 它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生 蓝色物质。
N端的11-41aa
C端大部分
pUC lacZ’
受体菌lacZ∆
互补的插入失活
pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位
点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合
pBR322的缺点 保留了转移蛋白（mob）的作用位点。
能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别， 如果再有F质粒的参与，就有可能转移！
PBR322的改进
① 删除mob识别位点
（如质粒pBR327、pAT153等）。
pAT153：
从pBR322上切去HaeII片断，既除 去了mob识别位点，又增加质粒的 拷贝数。
受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的 氨基端有缺失（缺失肽），不能形成 4聚体的活性酶，不能分解Xgal
受体菌株：JM系列、TG1、TG2、 XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、 MV1184、DH5a
② -半乳糖苷酶Xgal显色反应：
-半乳糖苷酶能把无色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的 物质5-溴-4-氯靛蓝。
Ampicillin 抗性和 lacZ的 肽互补（蓝白斑）相结合。
保留了转移蛋白（mob）的作用位点。
（2）长度 约2.7kb （3）克隆位点 10个连续的单一限制酶切位
点，位于lacZ’基因的5’端。
pUC18/19
选择标记
Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互补（蓝白 斑）相结合。
筛选方法 噬菌体(或病毒)载体；
lacZ只有在4聚体的状态下才有功能. 穿梭载体 可以在不同的宿主细胞中复制 如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。 （如质粒pBR327、pAT153等）。 其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）；
第三章载体ppt课件
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的
载体应该有两种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源
DNA片断。且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
3. 质粒的选择标记及其工作原理：
（2）长度: 约2.7kb （3）克隆位点: 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的
5’端。
（4）选择标记：Ampicillin 抗性和 lacZ的肽 互补（蓝白斑）相结合。
蓝白斑选择原理： ① Xgal ② -半乳糖苷酶Xgal显色反应：-半乳糖苷
酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一 个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 ③ lacZ的肽互补
加到1000个以上。
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内 部。如pDF41、pDF42、pBR329。
（5） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的 性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大 肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆 菌的转录—翻译信号控制之下。
六、其它质粒载体
1. pGEM-3Z
由pUC派生而来。与pUC的主要区别是 在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子 T7和SP6。可被T7和SP6的RNA聚合酶识 别转录。
2. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）
（1）穿梭质粒载体的结构
人工构建的具有两种不同复制起点和选 择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存 活和复制的质粒载体。
1）-肽（ lacZ’ ）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨
第四章--噬菌体-PPT幻灯片
溶原状态
l 十分稳定，能经历许多代 l 在某些条件如紫外线、X线、致癌剂、突变剂等作
用下，可中断溶原状态进入溶菌性状态，这称为前 噬菌体的诱导与切离，发生率为10-2-10-5。 l 极少数溶原性细菌中的前噬菌体离开细菌基因组后， 不进入溶菌性周期，这个现象被形象地称之为“治 愈”。
溶原性转换（lysogenic conversion）
l 只要细菌有特异性受体，不论死活噬菌体都能吸附， 但噬菌体不能进入死亡的宿主菌。
穿入
l 有尾噬菌体吸附宿主后，借助尾部末端含有的 一种类似溶菌酶的物质，在细菌细胞壁上溶一 小孔，然后通过尾鞘的收缩，将头部DNA注入 细菌体内，而蛋白衣壳留在菌细胞外。
l 无尾噬菌体与丝形噬菌体可以脱壳的方式进入 细菌细胞内。
溶原周期
l 温和噬菌体（temperate phage）
l 噬菌体感染细菌后不增殖，不裂解细菌，其基因与 宿主菌染色体整合，不产生子代噬菌体，但噬菌体 DNA能随细菌DNA复制，并随细菌的分裂而传代
T4 bacteriophages infecting E.coli.
噬菌体噬菌体的复制来自2.化学组成l 蛋白质
© 构成噬菌体的头部的衣壳及尾部，包括尾髓、尾鞘、尾板、 尾刺和尾丝，起着保护核酸的作用，并决定噬菌体外形和 表面特征。
l 核酸-遗传物质
© 基因组大小2-200Kb © 核酸为DNA或RNA，大多数噬菌体的DNA为双链DNA，但一些
微小DNA噬菌体的DNA为环状单链。多数RNA噬菌体的RNA为 线状单链，少数为线状双链，且分成几个节段。 © 某些噬菌体的基因组含有异常碱基，如大肠埃希菌T2噬菌 体无胞嘧啶，而代以5-羟甲基胞嘧啶与糖基化的5-羟甲基 胞嘧啶；某些枯草芽胞杆菌噬菌体无胸腺嘧啶，而代以尿 嘧啶、 5-羟甲基尿嘧啶。因宿主细胞内没有这些碱基，可 成为噬菌体DNA的天然标记。
噬菌体展示技术PPT课件
噬菌体展示技术
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
2
什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
14
噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
• 洗涤去未结合的或非特异性 结合的噬菌体
• 将特异性结合的噬菌体洗脱 下来，并扩增，用扩增产物 进行下一轮筛选
• 三轮淘选后，克隆测序
直接包被法
丝状噬菌体展示系统一般是在外壳蛋白pIII或pVIII的N端融合表达外源多肽及蛋白。 –噬菌体展示定义、分类
8
pIII展示和pVIII展示的区别
• pVIII 展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组 装。
• pIII只要不影响感染，可以展示更大的多肽及蛋白。
• 丝状噬菌体展示系统一般是在外壳蛋白pIII或pVIII的N端融合 表达外源多肽及蛋白。
噬菌体展示的应用
•抗原表位分析 •发现特异性抗体 •新疫苗、多价疫苗的开发
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
2
什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
14
噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
• 洗涤去未结合的或非特异性 结合的噬菌体
• 将特异性结合的噬菌体洗脱 下来，并扩增，用扩增产物 进行下一轮筛选
• 三轮淘选后，克隆测序
直接包被法
丝状噬菌体展示系统一般是在外壳蛋白pIII或pVIII的N端融合表达外源多肽及蛋白。 –噬菌体展示定义、分类
8
pIII展示和pVIII展示的区别
• pVIII 展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组 装。
• pIII只要不影响感染，可以展示更大的多肽及蛋白。
• 丝状噬菌体展示系统一般是在外壳蛋白pIII或pVIII的N端融合 表达外源多肽及蛋白。
噬菌体展示的应用
•抗原表位分析 •发现特异性抗体 •新疫苗、多价疫苗的开发
课件噬菌体遗传与变异.ppt
第一节 噬菌体的生物学性状
形态与结构
– 蝌蚪形、微球形和丝形
化学组成
– 蛋白质与核酸
抗原性 抵抗力：比细菌强
噬菌体
噬菌体的种类
毒性噬菌体（virulent phage）
温和噬菌体（temperate phage）/ 溶原性噬菌体（lysogenic phage）
第二节 毒性噬菌体
毒性噬菌体（virulent phage） –能在宿主菌细胞内复制增殖，产生许多
–致育质粒（F质粒）：编码细菌性菌毛 –耐药质粒（R质粒）：编码细菌耐药性
毒力质粒（Vi质粒）：编码细菌毒力因子 –细菌素质粒（Col质粒）：编码大肠埃希菌的大
肠菌素 –代谢质粒
质粒是基因工程中最常用的基因载体
转座因子 （transposable element）
是指基因组中能够改变自身位置的一段DNA片段。 转位（transposition）：转位因子能从染色体 或质粒的一个位置转移到在另一个位置。 转位因子的转位行为，能使DNA发生插入突变和 广泛的基因重排。 包括：插入序列、转座子、转座噬菌体
抑制基因转录 ✓ 阻遏蛋白 ✓ 辅阻遏物
促进基因转录
细菌的变异机制
基因的转移和重组 基因的突变
第三节 基因的转移和重组
基因转移（gene transfer）
–外源性的遗传物质由供体菌转入某受体菌细胞的过 程称为基因转移。
重组（rebination）
–转移的基因与受体菌DNA整合在一起称为重组，使 受体菌获得供体菌的某些性状。
IS Resistance Gene(s) IS
Tn
转座子的特征
转座子 Tn1 Tn2 Tn3
Tn4 Tn5 Tn6 Tn7 Tn9 Tn10 Tn551 Tn971 Tn1681
形态与结构
– 蝌蚪形、微球形和丝形
化学组成
– 蛋白质与核酸
抗原性 抵抗力：比细菌强
噬菌体
噬菌体的种类
毒性噬菌体（virulent phage）
温和噬菌体（temperate phage）/ 溶原性噬菌体（lysogenic phage）
第二节 毒性噬菌体
毒性噬菌体（virulent phage） –能在宿主菌细胞内复制增殖，产生许多
–致育质粒（F质粒）：编码细菌性菌毛 –耐药质粒（R质粒）：编码细菌耐药性
毒力质粒（Vi质粒）：编码细菌毒力因子 –细菌素质粒（Col质粒）：编码大肠埃希菌的大
肠菌素 –代谢质粒
质粒是基因工程中最常用的基因载体
转座因子 （transposable element）
是指基因组中能够改变自身位置的一段DNA片段。 转位（transposition）：转位因子能从染色体 或质粒的一个位置转移到在另一个位置。 转位因子的转位行为，能使DNA发生插入突变和 广泛的基因重排。 包括：插入序列、转座子、转座噬菌体
抑制基因转录 ✓ 阻遏蛋白 ✓ 辅阻遏物
促进基因转录
细菌的变异机制
基因的转移和重组 基因的突变
第三节 基因的转移和重组
基因转移（gene transfer）
–外源性的遗传物质由供体菌转入某受体菌细胞的过 程称为基因转移。
重组（rebination）
–转移的基因与受体菌DNA整合在一起称为重组，使 受体菌获得供体菌的某些性状。
IS Resistance Gene(s) IS
Tn
转座子的特征
转座子 Tn1 Tn2 Tn3
Tn4 Tn5 Tn6 Tn7 Tn9 Tn10 Tn551 Tn971 Tn1681
基因工程-2-载体ppt课件
③易操作,id)
1.柯斯载体的组成
由质粒和λ粘性末端“尾巴”两部分组成。
2.柯斯载体的特点
① 带有抗药性标记 ② 带有质粒的复制起始点 ③ 带有多个限制酶的单一切点 ④ 带有λ噬菌体粘性末端片段
3.cosmid载体的优点
insert) form URA3 auxotrophy selectable marker (yeast) yeast centromeric sequence ARS1 yeast origin of replication
第二节 噬菌体载体
一、 λ噬菌体载体
1. λ噬菌体结构特点: ①线性双链DNA分子 ②可在E.coli中大量繁殖 ③具非必需区(约1/3长度） ④两端具12个核苷酸单链互补粘性末端
⑷ 建立λDNA的体外包装。
噬菌体的包装过程
主要外壳蛋白质 是基因E的产物
连环DNA
头部前体
基因A的产物在cos 位点切割噬菌体 DNA
基因W和FII 的产物组装 蛋白质加完 包含在外壳中的 整的尾部 基因D的产物
λDNA的体外包装
头部基因 （琥珀突变型）
转录复制 蛋白质合成
体外包装的重组DNA比裸 露的DNA导入受体细胞的 效率高100-10000倍
2.酵母菌质粒载体的特点
①含有E.coli质粒的复制起始序列。
②含有酵母的筛选标记（如LEU2） ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。
④酵母菌稳定型质粒载体
着丝粒
Type bacterial origin promoter selectable marker
selectable marker
一 基因工程的基本元件 ------载体
质粒载体
1.柯斯载体的组成
由质粒和λ粘性末端“尾巴”两部分组成。
2.柯斯载体的特点
① 带有抗药性标记 ② 带有质粒的复制起始点 ③ 带有多个限制酶的单一切点 ④ 带有λ噬菌体粘性末端片段
3.cosmid载体的优点
insert) form URA3 auxotrophy selectable marker (yeast) yeast centromeric sequence ARS1 yeast origin of replication
第二节 噬菌体载体
一、 λ噬菌体载体
1. λ噬菌体结构特点: ①线性双链DNA分子 ②可在E.coli中大量繁殖 ③具非必需区(约1/3长度） ④两端具12个核苷酸单链互补粘性末端
⑷ 建立λDNA的体外包装。
噬菌体的包装过程
主要外壳蛋白质 是基因E的产物
连环DNA
头部前体
基因A的产物在cos 位点切割噬菌体 DNA
基因W和FII 的产物组装 蛋白质加完 包含在外壳中的 整的尾部 基因D的产物
λDNA的体外包装
头部基因 （琥珀突变型）
转录复制 蛋白质合成
体外包装的重组DNA比裸 露的DNA导入受体细胞的 效率高100-10000倍
2.酵母菌质粒载体的特点
①含有E.coli质粒的复制起始序列。
②含有酵母的筛选标记（如LEU2） ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。
④酵母菌稳定型质粒载体
着丝粒
Type bacterial origin promoter selectable marker
selectable marker
一 基因工程的基本元件 ------载体
质粒载体
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1. 质粒
1.3 质粒的大小
表2-1 代表性质粒的大小
质粒
大小/kb(千碱基对) 来源
pUC8 2.1
E. Coli
Col E1 6.4
E. Coli
RP4
54
Pseudomonas
F
95
E. Coli
TOL 117
Pseudomonas putida
pTiAch5 213
Agrobacterium tumefaciens
Control integration
The λ genetic map showing the positions of the important genes and the functions of the gene clusters.
2. 噬菌体
λ DNA 的线状和环状形式
在噬菌体头部，λ 以双链线状存在， 但在分子的两端各含12个核苷酸的突 起GGGCGGCGACCT, CCCGCCGCTGGA，这两端的单链片
第二章 质粒和噬菌体
内容：
质粒
质粒的基本特征 质粒的分类
噬菌体
噬菌体的基本特征 λ噬菌体 M13噬菌体
1.
标图 记 基抗 因生
素 作 为 质 粒 的 选 择 性
1. 质粒
1.1 概念：
存在于细菌细胞中能独立于染色 体DNA而自主复制的共价、闭合、 环状的双链DNA分子。并不是细菌 生长所必需的，但可以赋予细菌某些 抵御外界环境因素不利影响的能力。
2.3 M13单链噬菌体DNA载体
M13的结构
M13是一个线状噬菌体，其分子仅有 6407kb，分子是单链环状的。
M13含有的基因数目也少，M13的头部装 配仅需要3种不同的蛋白，15个蛋白分子。
M13的侵染周期很短，不需要插入寄主的 基因组。M13通过细菌的纤毛插入大肠杆 菌，单链分子作为模板合成互补链，形成 双链DNA分子。
段是互补的，可以通过碱基互补配对 形成环状分子，完整的双链分子。 λ的
粘端称为cos (Cohensive end site)位点 。
cos位点的两个作用：
使进入细菌的 DNA分子成为环 状 ，这是插入细
菌基因组的先决 条件。
作为识别位点， 由内切酶将原噬 菌体从细菌基因 组切下来 。
2 噬菌体
1. 质粒
1.2 质粒的基本特征 自主复制性 可扩增性
严紧型(Stringent) 松弛型(Relaxed)
可转移性(穿梭载体Shuttle vector） 不相容性
Conjugation: 接合 Compatibility：相容性 Inpatibility: 不相容性
纤毛
1.4 质粒
Fertility /F质粒：含有tra基因，促进接合 转移。
Resistance / R质粒：含有氯霉素、青霉素 或水银抗性基因。如RP4，发现于假单胞 杆菌。
Col 质粒：如存在于E. coli 中的CoE1。
降解质粒（Degradative plasmids）
致瘤质粒（Virulence plasmids）农杆菌Ti 质粒
大部分生物都能被病毒侵染。
动物细胞中病毒广泛作为基因克隆的载 体：
猿猴病毒simian virus 40(SV40) adenoviruses(腺病毒) 昆虫病毒baculovirus(杆状病毒)
植物中可利用的载体较少。
The end! Thanks!
2. 噬菌体
2.2 λ 双链噬菌体DNA载体
λ DNA分子的基因组织 λ DNA全长49kb。 λ遗传图谱的特点: 相同功能基因在基 因组中聚集在一起。这使他们一起启 动或关闭，而不是单独起作用。
2.噬菌体λ DNA分子的基因组织
Control gene expression
Control coat protein
2裂一次，大 约可以释放 1000个新的病 毒颗粒。
2.3 M13单链噬菌体DNA载体
2.3 M13单链噬菌体DNA载体
M13作为克隆载体的理由：
基因组小于10kb 复制的双链形式类似于质粒载体 利用M13作载体可以获得单链的
DNA。
3 病毒作为其它生物的载体
1. 质粒
1.5 细菌之外的质粒 酵母中发现了2μm的环状 质粒。 其他真核生物中尚未发现 质粒存在。
2. 噬菌体
2. 噬菌体
2.1噬菌体的特点
Structure
Infection process
λ
2.噬菌体
噬 菌 体 的 侵 染 循 环
The lysogenic infection cycle of bacteriophage λ