Mega的使用以及进化树的绘制

1.MEGA构建系统进化树的步骤

2.CLUSTALX进行序列比对

1.MEGA构建系统进化树的步骤

1. 将要用于构建系统进化树的所有序列合并到同一个fasta格式文件，注意：所有序列的方向都要保持一致( 5’-3’)。如图：

2. 打开MEGA软件，选择"Alignment" - "Alignment Explorer/CLUSTAL"，在对话框中选择Retrieve sequences from a file, 然后点OK，找到准备好的序列文件并打开，如图：

。

3. 在打开的窗口中选择”Alignment”-“Align by ClustalX” 进行对齐，对齐过程需要一段时间，对齐完成后，最好将序列两端切齐，选择两端不齐的部分，

单击右键，选择delete即可，如图：

。

4. 关闭当前窗口，关闭的时候会提示两次否保存，第一次无所谓，保存不保存都可以，第二次一定要保存，保存的文件格式是.meg。根据提示输入Title，然后会出现一个对话框询问是否是Protein-coding nucleotide sequence data, 根据情况选择Yes或No。最后出现一个对话框询问是否打开，选择Yes，如图：

。

5. 回到MEGA主窗口，在菜单栏中选择”Phylogeny”-“Bootstrap Test of Phylogeny” -“Neighbor-joining”，打开一个窗口，里面有很多参数可以设

置，如何设置这些参数请参考详细的MEGA说明书，不会设置就暂且使用默认值，不要修改，点击下面的Compute按钮，系统进化树就画出来了，如图：

在菜单栏中选择”Phylogeny”-“Bootstrap Test of Phylogeny” –“Minimun-evolution”,如图：

在菜单栏中选择”Phylogeny”-“Bootstrap Test of Phylogeny” –“Maximun-parsimony”,如图：

在菜单栏中选择”Phylogeny”-“Bootstrap Test of Phylogeny” –“UPGMA”，

如图：

6. 最后，使用TreeExplorer窗口中提供的一些功能可以对生成的系统进化树进行调整和美化。

CLUSTALX进行序列比对

1.将下载的序列放入一个Text文本文档中，序列按一定的格式，

>pig AGAGACGGCCGCATCTTCTTGTGCAGTGCCAGCCTCGTCCCGTA GACAAAATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTG GGCGCCTGGTCACCAGGGCTGCCATTTGCAGTGGCAAAGTGGA GATTGTTGCCATCAA的格式复制过来，放在一个文本文档里。

新建文本文档.txt

注意：CLustal 1.83分析出了全序列比对，彩色比对区上门的*越多，表示这段序列越保守

2.在File--load sequence载入序列,如图所示

4.点击align

5.

在桌面上即可生成aln格式的文本文档（用于下面Mega5.02进行进化树构建）

Mega5.02序列比对及建进化树

序列比对

1.用文本格式的序列数据进行比对

2.Align---edit alignment即新建一个数据---0k---DNA

3.

Edit--insert sequence from file ---选择文本文档

4.Alignent---Align by ciust W--ok---关闭序列比对--并保存在桌面上---Phylogeny--MAX

5.两种不同的方法最大释然和邻近法

邻近法更准确

建进化树1.File--convert file format to mega

2.

3.点击文件夹从桌面载入aln格式的文本文档

4.

5.点击OK，再命名

6.

7.

8.关闭窗口

9.点击OK

10.phylogen--text neighbor -joining tree -或者Maximum的方式进行构建--从桌面上选择刚命名的文件

11.

点击打开

12.

13.

14.点击Yes

15.

16.

17.将Test phylogery中的None改成如图

18.

19.

20.进化树就构建成功--点击横线进行细节修改

21.

22.点击左边第五个蓝色的图标

进行细节修改

23.可以双击分类后的名称，进行名称修改，如

Primer 5设计引物

1.File---New--DNA sequence

2.将序列复制过来（序列的格式必须是文本格式）--as is --OK

3.点击Primer

4.点击S--File-perferences

Length设置为20

点击OK

6.Search

7.type--both-PCR size 100-1000--primer length 25-5--OK

、

点击OK

8.选择打分高的，且退火温度在55℃左右的温度。

9.可通过手动调节上面的序列，使得二者的打分最高，如退火温度较高，则可以把序列长度降低一点，如19，点击Edit Primer --可以把引物序列复制下来

引物的基本原则

1.引物的长度18-28，不能太长。引物越长特征性高，要求的退火温度越高，但是扩张效率较低，容易形成引物二聚体。

2.G、C的含量在45-55%左右，但有时也可能比较高或者比较低，不是很重要，45-55%的范围只是最好的。G、C含量高，退火温度高。

3.3’端是最重要的，是起始阶段。最好是A、T、C、G随机均一分布，不能集中的分布；特别3‘端前段最好不要连续3个以上的G、C出现，不能很好的促发反应，只要3’端的前10个碱基结合得好就行。5‘不是很重要，可以很多不配对。实际上3‘端连续出现G/C 但是效果也比较好。

GCCTCGTCCCGTAGACAAAAT