农杆菌介导的烟草转化

准备菌液LB 300ml(加抗生素Kan,Rif)

1L MS, 分装300ml (SIM,无抗生素20个平板)，500ml(SIM,有抗生素，倒培养瓶)，200ml（液体，做悬浮液）

Kan,Rif / Basta,Rif

1.根癌农杆菌的活化

挑取单菌落，接种于含抗生素的LB 液体培养基（Rif 50μ g/ml和Kan 50-100μg/ml）中，28℃-30℃200rpm 振荡培养过夜。

2.农杆菌介导叶盘法转化植物

①农杆菌菌体处理

挑取农杆菌菌株接种于LB培养基中（含rif 50μg/ml和kan50μg/ml），200rpm，28℃培养24h，菌液OD600至1.0 左右，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，稀释菌体的OD600值为0.3-0.5。

②叶盘法转化转化植物程序

选取理想状态的外植体，在超净台上剪成小方块或者打成叶圆片（大小不限），在制备好的农杆菌菌液中浸染3-5min，置于无菌吸水纸吸干，平铺于SIM （MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA）培养基（无抗生素）上黑暗共培养2 天，2天后将外植体转移至含筛选因子的芽诱导培养基如SIM（MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+Basta 5mg/L+500μg/ml的carb素或500Cef）上进行筛选。待有芽生成（3~4周）后，继续培养到苗高2~3厘米时，转入生根培养基RIM（MS+ kan50μg/ml+500μg/ml的羧卞青霉素或500Cef）上，进行根诱导生长。

Cb: 羧卞青霉素; Cef:头孢霉素