农杆菌介导的烟草转化
烟草遗传转化实验报告
烟草遗传转化实验报告实验目的烟草是遗传转化的模式植物,已经建立了一套完善的转化再生体系｡本实验以烟草为实验材料,了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤, 掌握遗传转化的基本操作技术｡实验要求:掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法;理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理:了解转基因植物筛选的方法｡实验原理:根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌,根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒,简称为Ti质粒｡野生型农杆菌的Ti质粒,含有两个与致瘤有关的区域: 一个是T-DNA区,含致瘤基因;另一个是毒性区,在T-DNA的切割､转移与整合过程中起作用｡用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建,是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除,并在T-DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点｡p BI121载体是常用的植物表达载体,载体的骨架是pUC18,以CaMV3SS启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素(kan) 抗性选择标记基因,含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因｡β一葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因,转化的获得的转基因细胞､组织或植株,具有抗卡那霉素的特性,经组织化学染色呈蓝色｡实验器材摇床､超净工作台､小型离心机､冰箱､移液抢､镊子､手术刀､酒精灯､棉球､培养皿､三角瓶､滤纸､牛皮纸､牙签｡实验材料植物材料:烟草无菌苗农杆菌与载体:农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基:牛肉膏(5 g/L)､蛋白胨(5 g/L)､酵母提取物(1 g/L)､蔗糖(5 g/L)､MgSO4(0.5g/L)､pH 7.0烟草分化培养基: MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA烟草生根培养基: MS + 0.5mg/L IAA卡那霉素(Kan) 母液: 50mg/ml, 过滤除菌,分装,-20°C保存｡头孢霉素(cef) 母液: 300mg/ml, 过滤除菌,分装,-20"C 保存｡利福平(rif): 50mg/ml,过滤除菌,分装,-20"C保存｡。
农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究
转化技术体系, 为分子生物学和植物基因工程的研 究提供较好的技术基础。
1 材料与方法 1. 1 实验材料 1. 1. 1 植物 材料 四 倍 体烟 草 ( Nicotiana tabacum ) 品系 NT12 的无 菌 试 管 苗, 以 MS 为 基 本 培 养 基[ 3] , 附加 3% 蔗糖, pH 5. 8, 于 24 e 、自然光下培
平均阳性 植株数 ( 株/ 块)
阳性植株 频率 ( %)
1. 5 cm @ 1. 5 cm
23
7
30. 4
1. 0 cm @ 1. 0 cm
20
11
55. 0
0. 5 cm @ 0. 5 cm
4
2
50. 0
2. 2 预培养对转化率的影响 实验结果表明, 无论是经过 3 d 预培养的烟草
叶盘, 还是 未经预培养而直接 侵染的叶盘, 都约在 1421 d 后从表面创伤处及边缘出现芽点, 并逐渐长 大成为有几片幼叶的小芽。二者的分化时间、再生 芽的频率没有明显差异。所以, 为了缩短转化时间, 烟草叶盘转化可省去预培养。 2. 3 侵染时间对转化率的影响
图 2 部分转基因植株 PCR 检测结果 M: DNAmarker,K- EcoT 14I digest( TakaRa) ;
亚细胞定位之烟草转化方法
本氏烟草N. benthamian瞬时表达及相关实验方法：一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步骤：1、根据实验需要,将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中,并转化农杆菌;2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中,28℃,200rpm过夜;估算时间,防止农杆菌液浓度超过1OD,否则会影响转化效率;3、当菌液OD值介于~之间时,1000g,5min离心收集农杆菌;4、用2ml Induction medium without AS轻柔重悬农杆菌,然后再次离心收集菌液;5、重复步骤4;6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬;7、室温放置1~4小时8、测OD值,根据实验需要,配置侵染液组合详见下文;9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中;使用注射器时注意安全,防止针头扎到手,使用完的注射器要把针头套套上再扔,或者将针头放到注射器里面,避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套,防止交叉污染;B、试剂：Induction medium：MES-KOH PH 10mMMgCl210mMAS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;1M MgCl2 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌,分装避免反复冻融,-20℃;用高压灭菌的超纯水稀释;C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间,一般注射24小时之后到一周之内都会有表达;严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段,但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观,不要错过;D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在~之间;过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎;。
农杆菌注射烟草转化.
农杆菌注射烟草实验步骤
农杆菌转化
1. 取1µl质粒加入50µl刚冻解的农杆菌感受态中（提前准备1mlLB培养液，
1.5ml灭菌管，电击杯，移液枪，枪尖等）。
★感受态易失效，准备工作须充分
2. 吸取菌液打入电击杯，（不要产生气泡），放入电击仪（调manal至1.6-
1.7）。
3. 电击完立即加入1mlLB培养基，混匀，并吸至新的离心管中。
4. 28℃，摇2h（过程中可以准备抗性板子，或提前准备）。
5. 涂板，（使用kan+rif双抗板）28℃培养36h。
6. 可做菌落PCR检测是否转化成功，同时做菌种保藏（根据实验需要）。
接菌注射
1. 挑菌转接3ml
双抗培养基，27℃摇菌过夜。
★玻璃试管摇菌效果要好些
2. 取20µl菌液到20 mlLB培养基中，（20mlLB + 100ml/L MES + 20µmol/L AS +500µlkana/L）摇菌过夜至OD值为1.0-1.5。
●不加Rif ★准备两份，最后调OD 值会用到。
3. 3560r/min ,10min 弃上清。
4. 配缓冲液MMA（H2O+MES 10ml +MgCl2 10ml +AS 1ml）,现配现用。
用等量缓冲液重悬菌液。
一份等量，一份少量
5. 调菌液OD值至1.0，室温放置1h。
将需要混合的菌液等体积混合，可注射。
烟草农杆菌转化实验步骤1
烟草农杆菌转化实验实验配方：1LRMOP: 20×大量元素50ml200×微量元素5ml200×有机5ml200×铁盐5ml3%蔗糖30g0.8%琼脂（国产）4g/500ml灭菌后，每500ml培养基加入:0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μLYEB:液体培养基：1L酵母提取物1g牛肉膏5g蛋白胨5g蔗糖5gMgSO4•7H2O 0.5gpH7.0 高压灭菌。
固体培养基：每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。
卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml利福平（Rif）储液：50mg/mlYEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。
一．农杆菌感受态细胞的制备（1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；（2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；（3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；（4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。
二．质粒DNA导入农杆菌①电转法：1.取农杆菌感受态在冰上冻融；2.加2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀；3.然后再将其转入电转杯中（不要产生气泡），在2500V高压下电击；4.取出电转杯，加入500μL预冷的YEB培养基（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h；5.取30-40μL菌液涂在含相应抗生素（50mg/l Kan和50mg/l Rif）的YEB平板上，28℃倒置培养1.5-2天；6.挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。
20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)
1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。
转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。
1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。
◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。
◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。
◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。
1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。
植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。
原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。
多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。
农杆菌侵染烟草原理
农杆菌侵染烟草原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种常见的细菌，它引起了许多植物疾病，并广泛应用于植物基因转化和构建转基因植物。
农杆菌感染的方式分为两个主要步骤：附着和转化。
首先，农杆菌通过其特殊的附着鞭毛附着在植物细胞的表面。
这些附着鞭毛具有与植物表面组织相互作用的能力，帮助菌体在细胞壁上定位。
然后，农杆菌进一步通过组成细菌群体的多聚糖特异性识别植物细胞并贴附在其表面。
这个过程涉及的多聚糖是菌体外表面中的一种多糖物质，称为Beta-1,2-葡聚糖。
该多糖与植物细胞表面的特定受体结合，使细菌固定在植物细胞表面。
接下来，农杆菌通过化学信号释放细菌表面小分子信号物质，称为诱导物质。
这些诱导物质与植物细胞的感受器相互作用，诱导植物细胞启动反响。
在感染过程中，农杆菌释放的Ti质粒在接触植物表面后激活，融入植物细胞胞质。
这个过程主要涉及到Ti质粒上的一些基因区域，称为过渡区，它负责将外源基因转移到植物细胞中。
接下来，T DNA被运送到植物细胞的细胞核中。
T DNA的传输过程主要受T基因（vir基因）的操控，这些基因编码用于T DNA传输的蛋白质。
一旦T DNA被引入细胞核，它会被整合到植物细胞的基因组中，并在细胞分裂过程中通过传代进行稳定遗传。
这个过程涉及到转座酶（T nase）等蛋白质的参与，它们帮助将T DNA插入植物基因组的特定区域。
总之，农杆菌侵染烟草的原理涉及一系列复杂的分子交互作用和基因调控过程。
通过附着、感染、引入TDNA以及其整合到植物基因组中，农杆菌成功地将外源基因引入烟草细胞，并构建转基因烟草。
这为基因工程研究和转基因植物生产提供了重要的工具和方法。
农杆菌介导的rolC基因转化烟草的研究
农杆菌介导rol C 基因转化烟草植株的研究章镇 孙爱君 房经贵 盛炳成(南京农业大学园艺学院,南京210095)摘要:通过根癌农杆菌介导手段,将来自发根农杆菌的rol C 基因转化到烟草(Nicotiana tabacum )植株的基因组,并借助G US 组织化学法,PCR 扩增法和S outhern 杂交进行了鉴定证实。
rol C 基因改变转基因烟草植株某些性状的特点,如植株高度变矮、花冠变小、雄蕊变短等,还发现rol C 基因具有延迟转基因烟草植株花期的作用。
关键词:烟草;农杆菌;rol C 基因;转化中图分类号:S572103513 文献标识码:A 文章编号:1000Ο2030(2001)01Ο0025Ο05Study on Agrobacteriun Οmediated transformationof tobacco plant with rol C geneZhang Zhen ,Sun Aijun ,Fang Jinggui and Sheng Bingcheng(C ollege of H orticulture ,Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China )Abstract :The rol C gene cloned from Agrobacterium rhizogenes was inserted into the genome of tobacco plant using Agrobacterium Οmedi 2ated trans formation method ,and the result was verified by G US analysis ,PCR amplification and S outhern hybridization.C ompared to the control ,the transgenic tobacco plants showed significantly dwarfer plant height ,later bloom period ,smaller flower and shorter androeci 2um.K ey w ords :tobacco ;Agrobacteriun ;rol C gene ;trans formation烟草是植物转基因研究初期获得突破的植物之一。
实验七 农杆菌介导法转化烟草
实验七 农杆菌介导法转化烟草一、实验目的（1）了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤。
（2）掌握遗传转化的基本操作技术。
二、实验原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。
野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。
农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。
我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
三、材料、器材与药品1、材料烟草、LBA4404菌株质粒载体为pBi1212、器材摇床、超净工作台、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、打孔器、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。
3、药品MS培养基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、琼脂、蔗糖、卡那霉素、羧卞青霉素、6-BA、IAA。
四、实验步骤1、根癌农杆菌质粒的保存：构建好的根癌农杆菌质粒接种在 YEP 固体培养基上，YEP 固体培养基的成分为每100ml含NaCl 0.5g、酵母 1g、水解酪蛋白 1g、琼脂 1．5g、pH7．0。
在冰箱中冷藏，一个月换一次培养基，保证菌种正常生长。
2、配制 YEP 液体培养基：成分同上，只是添加卡那霉素而不添加琼脂，分装于试管中，每试管加入5ml左右的液体培养基，包好后高压灭菌，放置于冰箱中待用。
3、摇菌：用灭菌的牙签或者火柴棍等挑出单菌落，一起放入上述YEP液体培养基中，然后置于27℃摇床上摇菌16-17h（180r/min） ，培养至 OD600为 0．6～0．8。
农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系的建立
１ 材 料 与 方 法
１ １ 试 验 材 料 ．
再转入 ＭＳ 培养基 中进行筛选培养。 １２ ５ 农杆菌和外植 体共培养 时问的确定 ．．
以烟草 品种 中烟 １０为试验材料 ， ０ 种子浸
将侵入 后的化培养基中 ， 分别 暗培养 １２ ３ ４ｄ 然后 、 、 、 ，
证 。 由 图 ４可 知 ， 被 检 测 的 Ｐ Ｒ 阳性 苗 中 ， Ｒ 在 Ｃ 经 Ｔ—Ｐ Ｒ Ｃ
３ ０日龄的烟草刚长出 ４～ ５片小叶片 ， 由于叶盘 太幼嫩 ， 在农杆菌溶 液中浸染容易染菌死亡 ；０日龄 、２ ８ １０日龄 的烟草
叶片已经变成深 绿色 ， 叶片 比较大 ， 虽然在后期浸染过程中抗 菌能力较强 ， 但是浸染效果 差 ， 响转化效率 ； 影 对照组 中 ４个
中图分类 号 ： ５ ２０ ２ ￥７ ．３ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ：０ ２—１０ （０ １ ０ ０６ ０ １０ ３ ２ ２ １ ）３— ０ ７— ２
１２ ． 试 验 方 法
由于烟草 的组织培养简单 、 因转化效率较高等优点 ， 基 烟
草成 为 植 物基 因 工程 和 分子 生 物 学研 究 中重 要 的模 式 植 物 。 。自从 Ｈ ｒ ｏｓ ｈ等首次获 得烟草转 基 因植 株 以来 ， 以 烟 草为材料 的转基因技术 为基 因功能分 析提供 了有 效途径 ， 同时使植物遗传转化的研究 和应用得到飞速发展。在植 物基 因工程 中， 目前研究最清楚 、 应用最广泛的外源基因转化 方法
２ 结果 与分 析
作者简介 ： 莉 （９ ５ ） 女， 赵 １ ８一 ， 河南鹤壁 人 ， 士研 究生 ， 要从事 硕 主
细胞 分子生 物学方 面的研究 。Ｅ—ｍ ｉ： ａｚａ３ ６ ６ ．ｏ ａｌｚ ｏｈｏ３ ＠１３ ｃｍ。 ｈ
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究植物遗传转化技术是一项广泛应用于作物改良和生物制药领域的重要技术手段。
其中农杆菌介导的植物遗传转化技术是目前最为常用和成熟的一种转化方法。
本文将对农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进行介绍和探讨。
一、农杆菌介导的植物遗传转化技术原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤杆菌，是一种天然的植物病原菌。
它通过菌体上存在的Ti质粒（tumor-inducing plasmid）和T-DNA（transfer DNA）片段，将外源DNA片段导入植物细胞并整合到植物基因组中，导致细胞核内出现转化的植物细胞。
因此，农杆菌介导的植物遗传转化技术也被称为农杆菌转化。
农杆菌介导的植物遗传转化技术包括以下几个步骤：农杆菌感染植物细胞、T-DNA整合进入植物细胞、T-DNA片段内的外源DNA导入植物细胞基因组、以及转化细胞的筛选和检测等。
其中，农杆菌感染植物细胞是整个转化过程的关键步骤，需要通过构建合适的载体和适当的农杆菌菌株，使其能够有效地感染到目标植物细胞。
二、农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进展农杆菌介导的植物遗传转化技术已经被广泛应用于许多作物品种的改良和基因功能研究中。
例如，利用农杆菌转化技术可将外源基因导入烟草、玉米、水稻、小麦、大豆等许多重要的作物中，实现对它们特性的改良。
在农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究和应用中，也出现了许多问题。
其中，影响转化效率的因素包括转化载体、农杆菌菌株、植物品种、转化条件等。
此外，还存在着难以破解的难题，例如植物细胞壁难以透过、转化后细胞的不稳定性、外源基因的稳定性等。
为了提高转化效率和成功率，许多研究者着眼于改进农杆菌转化系统，包括构建新的载体、筛选适合的农杆菌菌株、研究植物细胞壁和农杆菌感染机制等。
一些新型转化技术，例如粒子轰击法、激光微加工技术和等离子膜处理技术等，也被尝试用于植物遗传转化中，但它们还需要进一步的研究和优化。
农杆菌介导的Thaumatin基因转化烟草的研究
ｆ ｏ ｒ ｍｅ ｄ ｂ ｙ Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ｕ ｍ ｔ ｕ ｍ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ｍ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ ．Ｔ ｈ ｅ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｅ ｆ ｉ ｆ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｙ ｗ ａ ｓ ａ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｓ ｅ ｖ ｅ ｒ ａ ｌ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｓ ，
江西农业学报
２ ０ １ ３ ， ２ ５ （ ７ ） ： ５ ０— ５ ２
Ａｅ ｔ ａ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｈ ｕ ｒ ａ ｅ Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ
农杆菌介导的 Ｔ ｈ ａ ｕ ｍａ ｔ ｉ ｎ基 因转 化 烟 草 的研 究
崔波 ， 蒋素华 ， 田云芳 ， 武振江 ， 袁秀云 ， 马杰
Ｃ Ｕ Ｉ Ｂ ｏ ， Ｊ Ｉ Ａ Ｎ Ｇ Ｓ ｕ—ｈ ｕ ａ ， Ｔ Ｉ Ａ Ｎ ＹБайду номын сангаасｕ ｎ— ｆ ａ ｎ ｇ ， ＷＵ Ｚ ｈ ｅ ｎ— ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ２ ， Ｙ Ｕ Ａ Ｎ Ｘ ｉ ｕ— ｙ ｕ ｎ 。 ， ＭＡ Ｊ ｉ ｅ （ １ ．Ｂ ｉ ｏ ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ， Ｚ ｈ ｅ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｎ ｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｚ ｈ ｅ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ４ ５ ０ ０ ４ ４ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ２ ．Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｈ ｅ ｎ ａ ｎ Ａ ｇ ｉ ｒ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｚ ｈ ｅ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ４ ５ ０ ０ ０ ２ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ） Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｃ ｏ ｌ ｅ ａ ｖ ｅ ｓ ｕ ｎ ｄ ｅ ｒ ｄ ａ ｒ ｋ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｆ ｏ ｒ ３ ｄ ａ ｙ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｕ ｓ ｅ ｄ ａ ｓ ｒ ｅ ｃ ｅ ｐ ｔ ｏ ｒ ，ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ Ｔ ｈ ａ ｕ ｍ ａ ｔ ｉ ｎ ｗ ａ ｓ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ —
亚细胞定位之烟草转化方法
亚细胞定位之烟草转化方法烟草是常见的植物模型，被广泛应用于植物生物学研究中。
研究人员通常通过烟草转化方法，将外源基因导入烟草中，实现对基因的功能研究或产生转基因烟草植株。
烟草转化方法通常包括两个步骤：外源基因构建和烟草转化。
首先，需要构建一个携带外源基因的转化载体。
这个载体通常包含一个启动子、外源基因和终止子。
启动子可以驱动外源基因的转录，终止子可使转录终止。
外源基因可以是一个编码蛋白质的序列，也可以是一个编码RNA或其他功能分子的序列。
构建好转化载体后，接下来可以通过烟草转化方法将其导入烟草中。
烟草转化方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。
其中，农杆菌介导转化是最常用的方法之一、农杆菌介导转化是利用农杆菌的特性，将外源基因导入烟草细胞中。
首先，需要将转化载体与农杆菌进行共转化，形成转化菌。
接着，将转化菌与烟草叶片进行共同培养，利用农杆菌T-DNA的转移机制，将外源基因导入烟草细胞中。
经过一段时间的培养，将转化的烟草细胞分离培养，最终获得转基因烟草植株。
利用亚细胞定位技术，可以进一步研究转基因烟草植株中外源基因的定位。
常用的方法包括荧光蛋白标记技术和抗体标记技术。
荧光蛋白标记技术可以通过将外源基因与荧光蛋白基因进行融合，使转基因植株产生荧光蛋白标记，从而观察外源基因在细胞内的定位。
抗体标记技术则是将外源基因编码的蛋白质与特异性抗体结合，通过免疫荧光染色等方法观察外源基因的定位。
通过亚细胞定位技术，可以了解转基因烟草植株中外源基因在不同亚细胞位置的分布。
这对于研究外源基因的功能以及其与其他生物分子的相互作用方式非常重要。
此外，亚细胞定位研究也可以为转基因烟草的功能性研究提供重要线索。
总结起来，烟草转化方法是利用烟草作为植物模型，将外源基因导入烟草中的方法。
通过亚细胞定位技术，可以了解外源基因在转基因烟草植株中的定位，进一步研究外源基因的功能和相互作用方式。
烟草转化方法为研究转基因植物提供了重要的工具和方法。
农杆菌注射渗透法转化烟草实验研究
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实
验
技
术
与
管
理
第２ ７卷
第１ １期
２１ ０ ０年 １ １月
ＣＮ１ — ０ ４ Ｔ １ —２ ３ ／
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能 检测 、 白作 用机 理研 究 方 面 使用 较 多 的 快 速转 化 蛋 技术 ］ 该技 术 的最 大 优点 是 方 便 快捷 ， ， 感染 组 织 面 积大， 转化 细胞 数 量 多［ 。我 们 在 近年 的实 验教 学 中 ３ ］ 引入 这一 实验技术 ， 不仅 能 避 免 通过 组 织 培 养 的转 化 方法 的耗 时长 、 作 复 杂 、 易 污 染 等 问题 ， 可 以在 操 容 还 较短 时间 内完成从 转化 到报 告基 因表达 检测 的过程 。
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准备菌液LB 300ml(加抗生素Kan,Rif)
1L MS, 分装300ml (SIM,无抗生素20个平板)，500ml(SIM,有抗生素，倒培养瓶)，200ml（液体，做悬浮液）
Kan,Rif / Basta,Rif
1.根癌农杆菌的活化
挑取单菌落，接种于含抗生素的LB 液体培养基（Rif 50μ g/ml和Kan 50-100μg/ml）中，28℃-30℃200rpm 振荡培养过夜。
2.农杆菌介导叶盘法转化植物
①农杆菌菌体处理
挑取农杆菌菌株接种于LB培养基中（含rif 50μg/ml和kan50μg/ml），200rpm，28℃培养24h，菌液OD600至1.0 左右，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。
再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，稀释菌体的OD600值为0.3-0.5。
②叶盘法转化转化植物程序
选取理想状态的外植体，在超净台上剪成小方块或者打成叶圆片（大小不限），在制备好的农杆菌菌液中浸染3-5min，置于无菌吸水纸吸干，平铺于SIM （MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA）培养基（无抗生素）上黑暗共培养2 天，2天后将外植体转移至含筛选因子的芽诱导培养基如SIM（MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+Basta 5mg/L+500μg/ml的carb素或500Cef）上进行筛选。
待有芽生成（3~4周）后，继续培养到苗高2~3厘米时，转入生根培养基RIM（MS+ kan50μg/ml+500μg/ml的羧卞青霉素或500Cef）上，进行根诱导生长。
Cb: 羧卞青霉素; Cef:头孢霉素。