细胞融合和体细胞杂交
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• 双亲个体间基因型的不协调或是染色体组非同源性 在生殖生理表型上的一种反映。不亲和性是稳定物 种的重要机理。
• 种间不亲和性：异种、异属生物个体之间的生殖不 亲和现象常由染色体组的不同所造成。一般地说， 越是远缘则不亲和性越高，直到完全不能受精。
第六章 细胞杂交（融合）技术
一、定义
1，细胞融合(cell fusion)
第二节 体细胞杂交步骤：
1 原生质体的制备 2 原生质体的融合 3 杂种细胞选择 4 杂种细胞培养 5 由愈伤组织再生植株 6 杂种植株的鉴定
可编辑版
7
原生质体融合
自发融合： • 自然界中：受精、双受精、花粉母细胞融合等。 • 在原生质体制备和培养过程中：细胞壁被分解
后，原生质体的胞间连丝发生膨大，相邻细胞 的原生质和细胞器通过胞间连丝流到一起，形 成融合。此现象在同种或同品种植物间发生,但 频率极低。
可编辑版
12
PEG(聚乙二醇)处理
PEG的作用机理：由于PEG分子具有轻微的 负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋 白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质 体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发 生粘连进而促使原生质体的融合。
另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原 生质体的核、细胞器发生融合成为可能。
细胞融合=原生质体融合=体细胞杂交
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4
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5
体细胞杂交与有性杂交的异同
比较内容
时间 亲缘关系
结果
体细胞杂交
有性杂交
无季节限制
花期限制，特别是 母本的花期
一定程度上可以克 服有性/嫁接不亲
和性
受亲和性影响
细胞核、细胞质均 可以重组、倍性增
加
可编辑版
双受精，一般无细 胞质重组，倍性不
改变
6
可编辑版
8
诱导融合：通过诱导剂的作用，使两个远缘 的原生质体产生融合的方法，是细胞融合中 常用的手段
可编辑版
9
细胞融合的方法
化学方法
聚乙二醇 PEG） NaNO3处理
高PH-高浓度Ga2+
物理方法 电脉冲
生物方法
仙台病毒 (Sendai
virus)
可编辑版
10
NaNO3处理
1909年，Kuster在一个发生了质壁分离的表皮细胞 中，低渗NaNO3溶液可以引起2个亚原生质体的融 合。
• （1）足够量的病毒颗粒附 着在细胞膜上起搭桥作用， 使细胞聚集在一起。
• （2）通过病毒与原生质体 或细胞膜的作用使两个细 胞膜间互相渗透，胞质互 相融合。粘结部位质膜被 破坏，不同细胞间形成通 道，细胞质流通并融合 （病毒也随之进入细胞 质）。
• （3）有丝分裂，细胞核融 合，形成杂种细胞。
缺点：异核体形成频率不高，对细胞毒害大，融合 率低(0.1%)，重复难 。
可编辑版
11
高PH-高浓度钙离子处理
1973年，Keller和Melchers，用强碱性(pH10.5)的 高浓度钙离子（50mmol.L-1)溶液在37℃下处理约 30min，两个品系的烟草叶肉原生质体很容易融合。
但对于有些原生质体系统，这样高的PH值是有毒的。
1 异核体的核融合和染色体的行为
一般是在两亲本核同步分裂过程中发生的。第一次有 丝分裂；这就要求两个核必须同步分裂，如果两个 核所处时期不同，一个开始合成DNA， 另一个还 处于合成的中途或已完成了复制，它们之间就会相 互影响，导致最终不能进行细胞分裂。
2 亲缘关系对融合体发育的影响
种内和亲和的种间：
• 缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。
可编辑版
17
细胞电融可编合辑版仪
18
可编辑版
19
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21
生物法
• 病毒诱导细胞融合：研究最早的细胞融合诱导方法。 主要是由于病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进 入两个细胞就会打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞 质的交流，进而达到细胞融合的目的。
• 缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为 融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话， 病毒还可能感染亲本细胞。因此，目前已经很少使 用病毒诱导法进行细胞融合。
第五章 细胞融合与体细胞杂交
远源杂交
• 远缘杂交：不同种属之间，或是地理上远缘的种 内亚种之间个体的交配称为远缘杂交。
• 由于种属间存在着种种隔离机制，致使远缘杂交 常表现不亲和或获得的远缘杂种表现不育。
• 不亲和性：在有性生殖过程中，由于个体细胞或组 织水平上的不协调而使受精或接合wenku.baidu.com能正常进行， 或是受精后不能产生后代的现象。
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16
电融 合
电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强 脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促进细胞融 合的技术。
• 原理：在直流电脉冲的刺激下，原生质体质膜 表面的电荷发生改变，使异种细胞或原生质体 粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接，直到闭 合成完整的膜形成融合体。
• 优点：融合率高、重复性与可控制性强。
广义：凡是将两个细胞或原生质体融合成一个细胞 的过程。包括体细胞、性细胞的融合和自发融合。就 植物而言，又称为原生质体融合(protoplast fusion)。
狭义：将不同的体细胞融合在一起，通过对杂种细 胞的筛选，培养，期望得到体细胞杂种的一种手段。 所以又称为体细胞杂交(somatic hybridazation)。
原生质体的融合过程
异种原生质体先经膜融合形成共同的 质膜，然后经胞质融合，产生细胞壁，最 后是核融合。细胞核的融合是异种原生质
体融合的关键。 融合体只有成为单核细胞后才能继续生长，
才能合成DNA、RNA，
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24
四
异核体的核融合
取决于二亲本原生质体发育周期的同步程度和系统发育 关系的远近以及培养基对二亲本原生质体的有利程度
不亲和属间、科间：
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25
• 核融合失败，染色体丢失、重排或形成嵌合体。 即使属间能发育成植株，也是不育的。
海藻+胡萝卜，在第一次分裂后，一亲本核即退 化。 Hela+胡萝卜，胡萝卜核退化。
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26
• 细胞融合是一个随机的物理过程，经融合后 细胞将以多种形式出现，需要通过培养和筛 选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种 细胞，从而解决融合细胞的选择问题。
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PEG融合所需试剂
• 融合液：pH 5.6 CaCl2 8-10mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.5-1.0mol • 诱导液：融合液＋PEG 20～45％
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PEG作为融合剂的优点: 异核体形成的频率高，可重复性强。
缺点： 有一定毒性，容易形成多个细胞的融合体； 分裂频率低。
• 种间不亲和性：异种、异属生物个体之间的生殖不 亲和现象常由染色体组的不同所造成。一般地说， 越是远缘则不亲和性越高，直到完全不能受精。
第六章 细胞杂交（融合）技术
一、定义
1，细胞融合(cell fusion)
第二节 体细胞杂交步骤：
1 原生质体的制备 2 原生质体的融合 3 杂种细胞选择 4 杂种细胞培养 5 由愈伤组织再生植株 6 杂种植株的鉴定
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7
原生质体融合
自发融合： • 自然界中：受精、双受精、花粉母细胞融合等。 • 在原生质体制备和培养过程中：细胞壁被分解
后，原生质体的胞间连丝发生膨大，相邻细胞 的原生质和细胞器通过胞间连丝流到一起，形 成融合。此现象在同种或同品种植物间发生,但 频率极低。
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PEG(聚乙二醇)处理
PEG的作用机理：由于PEG分子具有轻微的 负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋 白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质 体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发 生粘连进而促使原生质体的融合。
另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原 生质体的核、细胞器发生融合成为可能。
细胞融合=原生质体融合=体细胞杂交
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5
体细胞杂交与有性杂交的异同
比较内容
时间 亲缘关系
结果
体细胞杂交
有性杂交
无季节限制
花期限制，特别是 母本的花期
一定程度上可以克 服有性/嫁接不亲
和性
受亲和性影响
细胞核、细胞质均 可以重组、倍性增
加
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双受精，一般无细 胞质重组，倍性不
改变
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诱导融合：通过诱导剂的作用，使两个远缘 的原生质体产生融合的方法，是细胞融合中 常用的手段
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细胞融合的方法
化学方法
聚乙二醇 PEG） NaNO3处理
高PH-高浓度Ga2+
物理方法 电脉冲
生物方法
仙台病毒 (Sendai
virus)
可编辑版
10
NaNO3处理
1909年，Kuster在一个发生了质壁分离的表皮细胞 中，低渗NaNO3溶液可以引起2个亚原生质体的融 合。
• （1）足够量的病毒颗粒附 着在细胞膜上起搭桥作用， 使细胞聚集在一起。
• （2）通过病毒与原生质体 或细胞膜的作用使两个细 胞膜间互相渗透，胞质互 相融合。粘结部位质膜被 破坏，不同细胞间形成通 道，细胞质流通并融合 （病毒也随之进入细胞 质）。
• （3）有丝分裂，细胞核融 合，形成杂种细胞。
缺点：异核体形成频率不高，对细胞毒害大，融合 率低(0.1%)，重复难 。
可编辑版
11
高PH-高浓度钙离子处理
1973年，Keller和Melchers，用强碱性(pH10.5)的 高浓度钙离子（50mmol.L-1)溶液在37℃下处理约 30min，两个品系的烟草叶肉原生质体很容易融合。
但对于有些原生质体系统，这样高的PH值是有毒的。
1 异核体的核融合和染色体的行为
一般是在两亲本核同步分裂过程中发生的。第一次有 丝分裂；这就要求两个核必须同步分裂，如果两个 核所处时期不同，一个开始合成DNA， 另一个还 处于合成的中途或已完成了复制，它们之间就会相 互影响，导致最终不能进行细胞分裂。
2 亲缘关系对融合体发育的影响
种内和亲和的种间：
• 缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。
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细胞电融可编合辑版仪
18
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生物法
• 病毒诱导细胞融合：研究最早的细胞融合诱导方法。 主要是由于病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进 入两个细胞就会打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞 质的交流，进而达到细胞融合的目的。
• 缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为 融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话， 病毒还可能感染亲本细胞。因此，目前已经很少使 用病毒诱导法进行细胞融合。
第五章 细胞融合与体细胞杂交
远源杂交
• 远缘杂交：不同种属之间，或是地理上远缘的种 内亚种之间个体的交配称为远缘杂交。
• 由于种属间存在着种种隔离机制，致使远缘杂交 常表现不亲和或获得的远缘杂种表现不育。
• 不亲和性：在有性生殖过程中，由于个体细胞或组 织水平上的不协调而使受精或接合wenku.baidu.com能正常进行， 或是受精后不能产生后代的现象。
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电融 合
电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强 脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促进细胞融 合的技术。
• 原理：在直流电脉冲的刺激下，原生质体质膜 表面的电荷发生改变，使异种细胞或原生质体 粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接，直到闭 合成完整的膜形成融合体。
• 优点：融合率高、重复性与可控制性强。
广义：凡是将两个细胞或原生质体融合成一个细胞 的过程。包括体细胞、性细胞的融合和自发融合。就 植物而言，又称为原生质体融合(protoplast fusion)。
狭义：将不同的体细胞融合在一起，通过对杂种细 胞的筛选，培养，期望得到体细胞杂种的一种手段。 所以又称为体细胞杂交(somatic hybridazation)。
原生质体的融合过程
异种原生质体先经膜融合形成共同的 质膜，然后经胞质融合，产生细胞壁，最 后是核融合。细胞核的融合是异种原生质
体融合的关键。 融合体只有成为单核细胞后才能继续生长，
才能合成DNA、RNA，
可编辑版
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四
异核体的核融合
取决于二亲本原生质体发育周期的同步程度和系统发育 关系的远近以及培养基对二亲本原生质体的有利程度
不亲和属间、科间：
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• 核融合失败，染色体丢失、重排或形成嵌合体。 即使属间能发育成植株，也是不育的。
海藻+胡萝卜，在第一次分裂后，一亲本核即退 化。 Hela+胡萝卜，胡萝卜核退化。
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• 细胞融合是一个随机的物理过程，经融合后 细胞将以多种形式出现，需要通过培养和筛 选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种 细胞，从而解决融合细胞的选择问题。
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PEG融合所需试剂
• 融合液：pH 5.6 CaCl2 8-10mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.5-1.0mol • 诱导液：融合液＋PEG 20～45％
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PEG作为融合剂的优点: 异核体形成的频率高，可重复性强。
缺点： 有一定毒性，容易形成多个细胞的融合体； 分裂频率低。