实时定量PCR.ppt
合集下载
实时荧光定量PCR介绍
BLAST检索确认Probe特异性
实时荧光定量PCR介绍
4/14/2021 • 18
反应性能确认
实时荧光定量PCR介绍
线性关系、扩增效率确认
相关系数（r2）：大于0.98 PCR扩增效率（E）：0.8-1.2
检测灵敏度确认
35Cycles内可得到好的定量结果。 如果采用SYBR检测方法， 30Cycles内无非特异性产物扩增。
105 104103102101100
105 104 103 102 101 100
• 标准品梯度的选择：5～6个梯度 • 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10
实时荧光定量PCR介绍
4/14/2021 • 21
标准品的种类
DNA样品定量标准品 RNA样品定量标准品
基因组DNA 质粒
Total RNA & cDNA 体外转录RNA
No Template Control确认
30Cycles内无引物二聚体产生。
4/14/2021 • 19
主要内容
1. 标准曲线分析
2. 融解曲线分析
3
Real Time PCR解析方法
3. 绝对定量和相对定量解析方法
实时荧光定量PCR介绍
4/14/2021 • 20
标准曲线制作
扩增曲线
标准曲线
（Perfect Real Time）（DRR064）
仪 器 Smart Cycler Ⅱ
实时荧光定量PCR介绍
4/14/2021 • 36
绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量
SARS Control RNA构建
SYN247 F01
SYN247 F02
实时荧光定量PCR介绍
4/14/2021 • 18
反应性能确认
实时荧光定量PCR介绍
线性关系、扩增效率确认
相关系数（r2）：大于0.98 PCR扩增效率（E）：0.8-1.2
检测灵敏度确认
35Cycles内可得到好的定量结果。 如果采用SYBR检测方法， 30Cycles内无非特异性产物扩增。
105 104103102101100
105 104 103 102 101 100
• 标准品梯度的选择：5～6个梯度 • 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10
实时荧光定量PCR介绍
4/14/2021 • 21
标准品的种类
DNA样品定量标准品 RNA样品定量标准品
基因组DNA 质粒
Total RNA & cDNA 体外转录RNA
No Template Control确认
30Cycles内无引物二聚体产生。
4/14/2021 • 19
主要内容
1. 标准曲线分析
2. 融解曲线分析
3
Real Time PCR解析方法
3. 绝对定量和相对定量解析方法
实时荧光定量PCR介绍
4/14/2021 • 20
标准曲线制作
扩增曲线
标准曲线
（Perfect Real Time）（DRR064）
仪 器 Smart Cycler Ⅱ
实时荧光定量PCR介绍
4/14/2021 • 36
绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量
SARS Control RNA构建
SYN247 F01
SYN247 F02
实时荧光定量PCR在临床医学中的应用ppt课件
主要内容
➢罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案 ➢基因诊断
• 病原体测定 • 肿瘤诊断
• 突变检测——个性化用药 • 甲基化 • 基因差异表达
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
高分辨率熔解曲线 定义
罗氏应用科学部整合细胞组学和基因组学的研究流程
5
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
LightCycler® Real-Time PCR Platform
超过十年的实时荧光 PCR 的技术革新
纯合子
杂合子
VS
不饱和双链DNA荧光染料
SYBR Green I • 纯合子和杂合子的熔解曲线基本相同
饱和双链DNA荧光染料
vs
ResoLight、LCGreen、EvaGreen
• 都为绿色荧光染料，最佳激发波长范围440470nm，发射荧光波长470-520nm。
• 序列的变化会导致熔解曲线的显著变化
LightCycler 480 HRM 应用介绍
基因扫描– 显著降低测序成本
• 甘露糖结合凝集素MBL2基因序列变异分析 (384 个样本, 扩增子长度219 bp): 4种 最常见的基因型在图像上被分为4组; 少量样本呈现另外的3种遗传变异
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
HBsAg和HBeAg均阳性而HBV DNA阴性？
• 干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。
➢罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案 ➢基因诊断
• 病原体测定 • 肿瘤诊断
• 突变检测——个性化用药 • 甲基化 • 基因差异表达
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
高分辨率熔解曲线 定义
罗氏应用科学部整合细胞组学和基因组学的研究流程
5
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
LightCycler® Real-Time PCR Platform
超过十年的实时荧光 PCR 的技术革新
纯合子
杂合子
VS
不饱和双链DNA荧光染料
SYBR Green I • 纯合子和杂合子的熔解曲线基本相同
饱和双链DNA荧光染料
vs
ResoLight、LCGreen、EvaGreen
• 都为绿色荧光染料，最佳激发波长范围440470nm，发射荧光波长470-520nm。
• 序列的变化会导致熔解曲线的显著变化
LightCycler 480 HRM 应用介绍
基因扫描– 显著降低测序成本
• 甘露糖结合凝集素MBL2基因序列变异分析 (384 个样本, 扩增子长度219 bp): 4种 最常见的基因型在图像上被分为4组; 少量样本呈现另外的3种遗传变异
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
HBsAg和HBeAg均阳性而HBV DNA阴性？
• 干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。
实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告PPT课件
基本概念
标准品（Standard） 用来构建标准曲线的已 知浓度的样本。 参比（Reference） 用于对检测结果进行标准 化的被动（Passive）或主动（Active）信号。 如内标和外标即为主动性参比的例子。主动性 参比意味着信号由PCR扩增所致，主动性参比 有其自己的引物和探针。被动性参比则为非 PCR所致，如ROX染料，可以校正荧光信号的 非PCR波动。
基本概念
绝对定量（Absolute quantitation） 绝对定量是使用一系列稀释 的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定，根据系列浓度标 准品的Ct值与起始模板（RNA或cDNA）量之间的线性比例关系， 绘制标准曲线。待测标本的浓度则可根据其测定的Ct值，从标准 曲线或回归方程计算得到原始模板的数量。这种方法是假定所有 的标准品和临床标本有相近的扩增效率。系列稀释标准品的浓度 应包含临床标本的浓度范围，并且在实时PCR仪及检测试剂方法 的准确度和线性范围内。 系列稀释的标准品最好是RNA，也可以是双链DNA片段、单链 DNA或载有靶序列的质粒。标准品必须是纯的，与RNA标准品相 比，DNA有相对较好的稳定性、重复性和敏感性，但其与逆转录 没有关系，不能反映逆转录效率。
基本概念
Ct值（threshold cycle）或CP值（crossing point） Ct或CP值指的是实时监测扩增过程的 荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。主要 的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧 光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值 时的循环数则为阈值循环数（Ct）。有实验证 明Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。Ct 值是当前实时荧光PCR的主要定量参数。
纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型
实时荧光定量PCR技术全面分析ppt课件
定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终 精确的对起始模板的定量分析
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
PPT荧光定量PCR(共31张PPT)
➢ 3’端标记有荧光淬灭集团（Quencher，Q） ➢ 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发
荧光
➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光标记物的选择
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本 的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的 拷贝数或浓度
以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作 标准曲线
25
y = -3.2461x + 26.443
20
R2 = 0.9976
15
E=103.2647%
10
5
0
0
2
4
6
8
以lg（CT）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线 扩增效率（E）= （10-1/斜率-1） × 100% 相关系数（R2）应大于0.99，越接近1越好 E应介于95%与105%，越接近100%越好
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。
✓ 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，
CT值越小
✓ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可 从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
非特异性荧光标记 ➢ SYBR Green I
❖ 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡 结构
❖ 跨越内含子设计引物
❖ Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出 1000 bp以下的非目的产物
方法
优点
缺点
适用范围
绝对定量
定量准确
工作量较大， 需额外绘制目 标基因的标准 曲线
所有
相对定量
荧光
➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光标记物的选择
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本 的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的 拷贝数或浓度
以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作 标准曲线
25
y = -3.2461x + 26.443
20
R2 = 0.9976
15
E=103.2647%
10
5
0
0
2
4
6
8
以lg（CT）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线 扩增效率（E）= （10-1/斜率-1） × 100% 相关系数（R2）应大于0.99，越接近1越好 E应介于95%与105%，越接近100%越好
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。
✓ 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，
CT值越小
✓ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可 从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
非特异性荧光标记 ➢ SYBR Green I
❖ 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡 结构
❖ 跨越内含子设计引物
❖ Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出 1000 bp以下的非目的产物
方法
优点
缺点
适用范围
绝对定量
定量准确
工作量较大， 需额外绘制目 标基因的标准 曲线
所有
相对定量
罗氏实时荧光定量PCR仪课件
02
罗氏实时荧光定量PCR仪 介绍
仪器的基本结构
仪器外观
操作界面
罗氏实时荧光定量PCR仪外观为长方 体，尺寸适中，便于实验室放置。
仪器配备彩色触摸屏，操作界面友好 ，方便用户进行参数设置和实验操作 。
内部结构
仪器内部包括加热模块、光学检测系 统、电脑控制系统等部分，各部分协 同工作完成PCR扩增和荧光检测。
制定仪器的维护保养计划，按照 计划进行保养，保证仪器的正常
运行和使用寿命。
THANKS
感谢观看
通过比较不同样本之间的基因表达数据，可以筛选出差异表达的基 因，进一步研究其在生物学过程中的作用。
基因表达调控机制研究
通过实时监测基因转录水平的变化，有助于深入了解基因表达的调 控机制，为相关疾病的研究和治疗提供线索。
在病毒检测中的应用
1 2 3
病毒载量测定
利用罗氏实时荧光定量PCR仪，可以快速、准确 地测定病毒载量，为临床诊断和治疗提供依据。
02
根据错误提示查找相关资料或联系技术支持解决。
仪器运行结果不准确
03
检查样品是否符合要求，运行程序是否正确，仪器是否经过校
正等。
仪器的保养与校正
定期清洗仪器内部
根据仪器使用情况定期清洗仪器 内部，包括清洗反应管、更换滤
芯等。
校正仪器
定期邀请专业技术人员对仪器进 行校正，确保仪器准确性。
建立维护保养计划
详细记录实验数据，包括荧光信号的 变化、扩增曲线等，并对数据进行整 理和分析。
实验后处理
仪器清洁与保养
数据审核与报告撰写
实验结束据进行审核，撰写详细的实验报 告，包括实验目的、方法、结果和结论等 。
样品处理
实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告课件
基本概念
标准品（Standard） 用来构建标准曲线的已 知浓度的样本。
参比（Reference） 用于对检测结果进行标 准化的被动（Passive）或主动（Active）信 号。如内标和外标即为主动性参比的例子。主 动性参比意味着信号由PCR扩增所致，主动性 参比有其自己的引物和探针。被Байду номын сангаас性参比则为 非PCR所致，如ROX染料，可以校正荧光信号的 非PCR波动。
基本概念
扩增效率E（amplification efficiency） 扩增效率指的是一个循环后的产物增加量与这 个循环的模板量的比值，其值位于0到1之间。 在PCR的前20或30个循环中，E值比较恒定，为 指数扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时 PCR达到平台期，不再扩增。扩增效率的计算 可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值 与所得Ct值做图，在一定范围内应该是得到一 条直线，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K为该 直线斜率）即可计算出E值。
在扩增达到阈值线时，此时，n = Ct，于是，扩增产物的量
为：
YCt = X ( 1+E )Ct (2) YCt 为荧光信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设 定以后，它就是一个常数。（2）式两边同时取对数，得：
Log YCt = LogX ( 1+E )Ct (3) 亦即：Log YCt = LogX +Ct×Log ( 1+E )
基本概念
绝对定量（Absolute quantitation） 绝对定量是使用一系列 稀释的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定，根据系列浓 度标准品的Ct值与起始模板（RNA或cDNA）量之间的线性比例关系， 绘制标准曲线。待测标本的浓度则可根据其测定的Ct值，从标准 曲线或回归方程计算得到原始模板的数量。这种方法是假定所有 的标准品和临床标本有相近的扩增效率。系列稀释标准品的浓度 应包含临床标本的浓度范围，并且在实时PCR仪及检测试剂方法的 准确度和线性范围内。
最新实时荧光定量PCR介绍PPT课件
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
实时荧光定量PCR介绍
常用于SNP解析，病毒、病源菌检测
3/12/2024 • 11
主要内容
2
Real Time PCR实验方法
反转录反应
Real Time PCR反应
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 12
RT Primer的选择
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
RT
目的基因
Total RNA cDNA
T7 Promoter
PCR
目的基因
TTTT•••T
PCR产物
T7 RNA polymerase
AAAA•••A
体外转录RNA
AAAA•••A
RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
• Random Primer • Oligo dT Primer • Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 13
进行相对表达量分析。
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 32
相对定量解析方法
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、β-actin等。
筛选方法
• 根据文献提供 • 通过具体实验筛选
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 33
主要内容
《RTPCR技术原理》课件
缺点
对操作人员要求较高
RTPCR技术的操作较为复杂，需要经过专 业培训的操作人员才能保证结果的准确性
。
成本较高
RTPCR技术需要昂贵的仪器和试剂 ，导致检测成本较高，可能限制其
在资源有限地区的普及。
A
B
C
D
可能出现交叉污染
在操作过程中，如果样品或试剂受到污染 ，可能会导致交叉污染，影响检测结果的 准确性。
《rtpcr技术原理》ppt课 件
目录 CONTENT
• RTPCR技术概述 • RTPCR技术原理 • RTPCR实验操作流程 • RTPCR技术的优缺点 • RTPCR技术的应用实例
01
RTPCR技术概述
RTPCR技术定义
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号 检测DNA片段的扩增情况，并实时监测其变化的技术。
2000年
ABI公司推出高分辨率熔解曲线分析 技术，提高了SNP分型和突变检测的 准确性。
2004年
基于焦磷酸测序原理的实时荧光定量 PCR技术问世，提高了检测通量和灵 敏度。
RTPCR技术的应用领域
基因表达分析
突变检测
通过比较不同组织或不同处理条件下基因 的表达水平，研究基因的表达调控机制。
用于检测DNA序列中的点突变、插入和缺 失等变异，用于遗传病、肿瘤等疾病的诊 断和监测。
基因突变检测
总结词
RTPCR技术能够高效地检测基因突变，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。
详细描述
基因突变是许多遗传性疾病的诱因，RTPCR技术通过对特定基因的扩增和荧光 检测，能够快速、准确地检测出基因突变位点及类型。这有助于遗传性疾病的 早期诊断和针对性治疗，为患者提供更好的医疗方案。
实时荧光定量PCR
绝对定量 相对定量
突变检测
等位基因检测
＊
荧光定量PCR的方法
定量可分为绝对定量（即测定X的分子数量） 和相对定量（即测定不同样本中X的比率）
X指原始模板
绝对定量 构建标准曲线： A、按照扩增片段的序列，人工合成一段寡聚核苷酸。 B、克隆有扩增产物的质粒 C、利用纯化的扩增产物制备
对照组 实验组
靶基因A 25.2
22.1
GAPDH 19.5
20.8
ΔCt 5.7
1.3
1．计算ΔCt：ΔCt=Ct
靶基因－Ct GAPDH，分别计算实验组
和对照组的ΔCt。 2．计算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组，本例中 ΔΔCt= －4.4。 3．计算相对表达量的差值。2
－ΔΔCt
的量，从而排除了因管间扩增效率的不同所致的差异。
非竞争性内标准
（1）与靶核酸无关的基因序列； （2）既可是内源的也可是外源的； （3）与靶核酸无相同的引物结合位点和扩增序列； （4）最常用的是β-actin、GAPDH、rRNA基因等管家
基因；
竞争性内标准
“竞争性”内标：人为构建的可与原始靶核酸竞争酶、核苷酸
实时荧光定量PCR（FQ－PCR)
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物 进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软 件对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。
荧光定量 PCR仪
荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系 统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。
荧光定量PCR仪的几个关键部分
硬件部分： PCR热循环系统 光学检测系统 包括：光源、滤光片、放大器、检测器 软件部分： 校正：荧光干扰/加样误差 结果分析：基因表达分析等
实时荧光定量PCR技术
模板含有抑制物；···
火/延伸时间；提高引物浓
度；添加K+；改用三步法扩
增；添加增强剂；换酶；重
新设计引物；···
特异性差 探针，引物设计不合理，二级 提高退火/延伸温度；适当降
结构过多；探针，引物浓度 低探针，引物浓度；调整
过高；退火/延伸温度偏低； Mg2+的量；重新设计探针，
···
引物；换酶···
体系稳定性差 原料储存不当；体系配制时间 探针应避光；体系在冰上配制
过长；模板浓度低；模板不 ；使用合格的试剂盒制备模
纯，降解；
板，避免反复冻融；
···
谢谢
–反应体系监控：蒸发、操作
荧光定量PCR过程
一 体系配制
组分名称
作用
10×buffer（Tri-Hcl、 ( NH4)2SO4、K+、Mg2+等）
引物mix 探针mix Taq酶（10U/ul） UNG酶（1U/ul）
缓冲液-提供反应环境
PCR反应的出发点 发出信号，指示扩增 聚合酶-催化合成反应
• 二，Ct值为扩增曲线与阈值线的交点所对应的循环次数，即Ct值与荧光 阈值有关。
实时荧光定量PCR技术的数学原理
• 理想的PCR反应： Xn=X0×2n
n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量
• 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n
X0：初始模板量 Ex：扩增效率
方程式两边同时取对数得: log Xn=log (X0 (1+Ex)n) 整理方程式得:log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
• 此外，还其它非荧光类淬灭基团如BHQ1，BHQ2等。
rtqPCR实验操作 ppt课件
rtqPCR实验操作
荧光实时定量PCR rt-qPCR
定义
实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： • 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以 此实现对初始模板的定量分析。
Rt-qPCR的应用
• mRNA表达的研究 • 微小残留病变的检测 • 肿瘤耐药基因表达的研究 • 病毒感染的定量监测
4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每 孔18.4微升，加完后rt按qPCR实排验操作板顺序加相应的前
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
rtqPCR实验操作
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
rtqPCR实验操作
1、校准生物学误差内参(管家基因)
rtqPCR实验操作
• 在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增 一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里 目标基因片段的含量，记录每个反应管内 的荧光信号达到设定的域值时所经历的循 环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就 说明目标基因在原本的样品里越少，即初 始模板的量越少。
rtqPCR实验操作
logX= n (1+E)+logX0
rtqPCR实验操作
PCR基本原理
•试管中进行的DNA复制反应，依据
1.DNA半保留复制的机理
2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性 质
•通过人为控制体外合成系统的温度，使
1.双链DNA变成单链
2.单链DNA与人工合成的引物退火
3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链
DNA。
rtqPCR实验操作
• 生物学重复：样品三次重复 • 技术重复：每个样品做3-4个复
荧光实时定量PCR rt-qPCR
定义
实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： • 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以 此实现对初始模板的定量分析。
Rt-qPCR的应用
• mRNA表达的研究 • 微小残留病变的检测 • 肿瘤耐药基因表达的研究 • 病毒感染的定量监测
4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每 孔18.4微升，加完后rt按qPCR实排验操作板顺序加相应的前
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
rtqPCR实验操作
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
rtqPCR实验操作
1、校准生物学误差内参(管家基因)
rtqPCR实验操作
• 在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增 一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里 目标基因片段的含量，记录每个反应管内 的荧光信号达到设定的域值时所经历的循 环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就 说明目标基因在原本的样品里越少，即初 始模板的量越少。
rtqPCR实验操作
logX= n (1+E)+logX0
rtqPCR实验操作
PCR基本原理
•试管中进行的DNA复制反应，依据
1.DNA半保留复制的机理
2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性 质
•通过人为控制体外合成系统的温度，使
1.双链DNA变成单链
2.单链DNA与人工合成的引物退火
3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链
DNA。
rtqPCR实验操作
• 生物学重复：样品三次重复 • 技术重复：每个样品做3-4个复
实时荧光定量PCR技术原理ppt课件
样本处理与RNA提取
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
4μL
dNTPs
1μL
RNAse inhibitor
1μL
M-MLV
1μL
1、混匀，42℃，90min
D2E、PC7-0Tr℃eat，ed 1H02Omin，终止反应
xμL
3、A3检测
反向PCR (reverse） PCR)
❖ 反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外 的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列 进行扩增。
❖ Tm ❖ 72℃ ❖ 72℃ ❖ 12℃
常用PCR反应条件
2-5min 30-40s 30-45s 1min/1kb 10min +∞
25-35个循环
几种常用PCR技术
❖ RT-PCR (Reverse Transcription PCR) ❖ 反向PCR (Reverse PCR) ❖ RACE (Rapid-Amplification of cDNA Ends) ❖ qRT-PCR (Quantitative Real Time PCR)
1、单、双链DNA，cDNA均可 2、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合 酶抑制剂DNA结合蛋白类 3、一般100ng DNA模板/100L,模板浓度 过高会导致反应的非特异性增加
（2）引物
1、引物浓度一般为0.1-0.5 mol/L，浓度过高易 导致模板与引物错配,反应特异性下降
2、引物的设计
（3）Taq DNA聚合酶
3、Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
（5）dNTP
1、dNTP浓度取决于扩增片段的长度 2、四种dNTP浓度应相等 3、浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则 降低反应产量 4、dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降， 影响DNA聚合酶的活性。
(1)变性 使双链DNA解链为单链,94℃ 30-40s (2)退火 ❖ 温度由引物长度和GC含量决定。 ❖ 增加温度能减少引物与模板的非特异性结
合;降低温度可增加反应的灵敏性。
循环参数
（3）延伸 ❖ 68-75℃,一般为72℃ ❖ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 ❖ 主要取决于模板DNA的浓度,一般为25-35次 ❖ 次数过多,扩增效率降低,错误掺入率增加
实时定量PCR
（qRT-PCR） 实时定量PCR （qRT-PCR）
Polymerase Chain Reaction（PCR） 聚合酶链式反应
伟大的天才发现！
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理 ❖ Taq❖
PPCCRR反过应程条567052件-℃℃
❖ PCR的特点
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
❖ PCR反应条件 ❖ PCR过程 ❖ PCR的特点
第2轮结束
PCR基本原理
PCR反应基本要素
模板
Mg2+
DNA 聚合酶
PCR
dNTP
引物
（1）模板
❖ cDNA 末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)是一种基于PCR技术从 低丰度的转录本中快速扩增cDNA 的5'和3’ 末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优 势而受到越来越多的重视。
RT-PCR (反转录PCR)
DNA水平
基因
RNA水平 蛋白水平
mRNA 蛋白质多肽链
RT-PCR基本原理
mRNA
mRNA
cDNA
AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT Reverse Transcription
AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT
RT-PCR一般步骤
1、酶的用量一般为0.5-2.5 U/50 l， 2、酶量增加使反应特异性下降;酶量过少 影响反应产量。
（4）Mg2+
1、Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，一般用量为 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。
2、Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。
❖ 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的克隆,扩增基因的插入DNA；建立基 因组步移。
未知序列
已知序列
未知序列
反向PCR原理
未知序列 限制酶
已知序列 连接酶
未知序列 限制酶
RACE (rapid-amplification of cDNA ends)
常用PCR反应体系 (以HiFi Taq为例)
❖ 模板
1.0 μL
❖ 上游引物
0.5 μL
❖ 下游引物
0.5 μL
❖ 10X HiFi Buffer（+Mg2+） 2.5 μL
❖ dNTPs
2.0 μL
❖ HiFi Taq酶
0.2-0.3 μL
❖ ddH2O ❖共
补足25 μL 25 μL
❖ 94℃ ❖ 94℃
❖ 1、RNA提取
RNA质量的检测 一般RT-PCR要求提取的RNA要有较高的完整性和纯度
2
完整性检测（1%琼脂糖胶电泳）
8
S
纯度检测（OD260/280）
1
OD260/280一般介于1.9-2.1之间，小于1.9
8
时蛋白污染；大于2.1时RNA发生降解
S
5 S
❖ 2、反转R录T-PCR一般步骤
在冰盒上加入以下试剂：
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
94℃
模板DNA
引物2
5702-℃65℃
DNA引物
引物1
PCR的基本原理
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
72℃
PCR的基本原理
❖ PCR反应条9件4℃
❖ PCR过程 ❖ PCR的特点
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十 余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆 炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
PCR的基本原理
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）5522Fra bibliotekDNA 2
形 成
条变 单性 链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
组成
体积
随机引物或Oligo dT）
1μL
1-5μg Total RNA
xμL
DEPC-Treated H2O
yμL
体系配制完成后瞬时离心，70℃反应 5min,然后迅速转移至冰盒，冰浴2-5min, 此步骤的作用是去除mRNA的二级结构。
RT-PCR一般步骤
在冰盒上加入以下试剂：
组成
体积
5X Buffer