生理生化实验方法2

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Ray Kuo 2008

菌种的生理生化分析

1.2 放线菌形态观察。

在高氏一号培养基[4]、蔗糖蔡氏琼脂培养基、葡萄糖-天门冬素琼脂培养基及甘油淀粉谷氨酸盐琼胶培养基[11]上,插片培养菌种,观察其基内菌丝体以及气生菌丝体的颜色。

将培养基融化后,以每皿15-18ml的量倾倒平板,待凝固,将放线菌划线接种在皿中,然后取无菌的盖玻片以45度角插入培养基内,盖玻片插入深约1/3(玻片必须于接种线垂直),每皿可以插2-3片。盖上皿盖,置于28℃培养,菌丝将沿玻片向上生长,定期观察。

[12]

菌株生理生化特性测定

明胶液化

将待检菌种接种于柱型明胶培养基[8]表面(不用穿刺)28℃下培养,分别在5,10,20及30天各观察一次液化情况。观察前将菌种管冷藏20-30分钟,如明胶不液化则仍是固体状态,若呈液体即为液化。明胶的水解是由于菌种所产生的蛋白酶的作用。

牛奶凝固与胨化测定 将牛奶10000rpm离心,去上层油脂成脱脂牛奶。将代测定菌株接种于脱脂牛奶中,28℃下培养,分别在3,6,10,20及30天各观察一次。如牛奶出现凝块,则为凝固。这是由于凝乳酶或发酵乳糖时产酸的作用,依据凝固原因的不同,尚有酸凝和酶凝脂粉。牛奶中的酪蛋白在蛋白酶的作用下被水解,使牛奶变得清亮而透明,此为胨化。凝固速度在开始的3-6天最快。

淀粉水解测定 将待检菌接种于淀粉培养基平板上。28℃培养10天至20天后在培养基表面加入碘液。若有淀粉酶产生,则淀粉变成糊精或糖而被吸收利用,菌落遇碘液不显蓝色,可在培养物周围形成无色透明圈。圈的大小表示淀粉酶产生的强弱。如不产生淀粉酶,则菌落周围遇碘成蓝色。

纤维素水解

将菌种接种于滤纸条上,接种材料最好是孢子(不带培养基)置28℃培养30天后观察。滤纸条分解表明产生了纤维素酶,滤纸条无变化者为阴性。

硫化氢产生实验

将待检菌接种于含柠檬酸铁(即Tresner’s)有机培养基斜面上,置28℃培养10天左右(视菌苔生长成丛为宜)观察结果。如产生褐色则说明有H 2S产生,H 2S与柠檬酸铁结合产生黑色硫化铁。

酪氨酸水解

将待检菌接种到斜面培养基上,适温培养3-7天,观察斜面,若有黑色素即为阳性反应,说明菌种具有酪氨酸酶。

碳源利用试验]

细菌能否利用某些含碳化合物作为唯一碳源,反映细菌是否含有代谢这种含碳化合物的酶,因而可以作为鉴定的依据。

菌种收集后应经离心洗涤制成菌悬液,以避免带入它种碳源,干扰实验结果。基础培养

Ray Kuo 2008

基为无碳源培养基。培养基制成斜面。常用的碳源有9种:阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、果糖、蔗糖、棉子糖、甘露糖、肌醇等。每种碳源均按基础培养基的1%加入。每一测定都必须接种于未加碳水化合物的空白基础培养基作对照。

用经灭菌的吸管吸取菌悬液定量滴加至液体培养基中,28℃培养7-14天后观察。分别记载生长利用情况。凡测定菌在有碳水化合物的培养基中的生长情况明显超过空白基础培养基的生长情况者称阳性,否则为阴性。如两种培养基上生长情况差别不明显,可在同一培养基上连续移三次,如差别仍不明显,则为阴性。

全细胞糖分析以及全细胞氨基酸分析

[6]

制板

把20×20cm玻璃板用洗涤剂洗净,取微晶纤维素一定量,每克加蒸馏水3.5ml,用磁力搅拌机搅拌均匀,用5ml吸管吸取适量微晶纤维素悬液倾注于玻璃板上成薄层,轻轻振荡使之均匀。平放实验台上,晾干,无尘,干燥处保存。玻璃板上微晶纤维素厚度控制在每板(20×5cm)约1.2g-1.5g。使用前于100℃烘箱活化40分钟。

[6]收集菌体

在500ml三角瓶中装100ml的培养液,接入斜面菌种(不能带入琼脂),28℃震荡培养至对数生长期。用灭菌离心管称装培养液4000rpm离心30分钟收集菌体。用蒸馏水洗涤两次,无水乙醇洗涤两次。取上述处理过的湿菌体各30mg,分别置于两个安培瓶中,一个用于氨基酸分析。另一个用于糖分析。

[5]菌体水解 吸取0.1ml 6N HCl加入用于氨基酸分析的安培瓶中,在用于糖分析的安培瓶中加入0.5N HCl 0.1ml,火焰封口,放入烘箱。待烘烤温度上升到120℃后,持续15分钟取出。用于氨基酸分析的水解液以黑褐色为宜,用于糖分析的水解液以黄棕色为宜。

[6]点样

在薄板上距长轴底边约1.0cm-1.5cm处用铅笔标点,每点间隔1cm。

用热胀冷缩法将安培瓶打开。用微量进样器点样品糖水解液2ul和1%的标准糖液(鼠李糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖)各1ul,以及上述糖等量混合液1ul。

点氨基酸水解液0.4ul;点DAP标准液0.2-0.4ul;点0.1%其他氨基酸溶液(天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸)各0.4ul。

展层与显色

分别量取DAP展层剂和糖展层剂各30ml,加入层析缸,分别立放斜靠DAP薄板和糖薄板。点样端接触展层剂但点样点不能碰到。上行2次,每次3小时左右。每次取出薄板置通风处干燥,再次放入前更换新鲜展层剂。

最后取出薄板,在通风处充分干燥,必要时可用电吹风吹干。

分别量取一定量氨基酸显色剂和糖显色剂,加入喉头喷雾器中,将显色剂分别喷于薄板上,要求喷的均匀,充分。

将薄板置于100℃烘箱中显色5-7分钟取出薄板观察并计算Rf值。

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