ELISA常见问题
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常见的免疫检测方法，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
Elisa的操作方法和常见问题对于熟练进行实验和解决实验中的问题都至关重要。
以下是Elisa的常见类型、实验标准操作方法以及常见问题的详细介绍。
一、常见类型：1. 间接Elisa：该方法利用抗体的特异性结合性质来检测特定抗原。
首先，在官网上涂上反应性抗原的试样，然后添加能与抗原结合的一抗，再加入与一抗结合的二抗和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。
2. 直接Elisa：该方法利用特异性抗体与抗原的结合性质来检测特定抗原。
在官网上涂上反应性抗原的试样，然后加入能与抗原结合的标记抗体和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。
二、实验标准操作方法：1.样品制备：收集要检测的样品，并进行必要的处理和制备，如离心、稀释等。
2.官网涂布：将样品或标准物质涂在官网上，并在适当的温度条件下孵育一段时间，使其抗原完全吸附到官网上。
3.阻断：用适当的阻断缓冲液或血清阻止非特异性结合。
4.添加（初级）抗体：加入特异性的初级抗体，让其与官网上的抗原结合。
5.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的初级抗体。
6.添加（二级）抗体：加入特异性的二级抗体，使其与初级抗体结合，并将标记物引入实验系统。
7.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的二级抗体。
8.底物添加：加入含有底物的溶液，使底物被标记物催化，产生颜色反应。
9.反应终止：加入适当的溶液将反应停止。
10.测定：通过检测底物催化反应产生的颜色变化，使用酶标仪等设备测量并分析光密度。
三、常见问题：1.如何选择合适的抗体和标记物？2.如何优化实验条件？在实验过程中，可以通过优化浓度和孵育时间等条件来提高实验的敏感性和特异性。
可以尝试不同浓度的抗体和试剂，并对孵育时间和温度进行调整。
3.如何处理实验结果？实验结果通常会通过测量光密度来表示。
典型的Elisa实验结果可以使用标准曲线进行定量，或者通过比较样品和对照组的光密度差异来进行定性判断。
免疫检测技术要点与常见问题
通过化学反应获得能量
背景噪音低
eft) to luminescence (right). S0, ground state; S1, excited state after vibrational relax-
能监测到出现假阳性反应常见的原因。
化学发光检测技术要点与常见问题
标记免疫技术的发展
y sensitivity. Such ground state yields yellow-green light with a spectral oundation for most maximum of 560 nm (Fig. 2).
确定CUT-OFF值的方法二
• 首先测定大量（数千）正常人血清样本，然后将所得到的吸光度均值 ＋2或3个SD作为阳性判断值：当正常人血清样本数量足够大时，使 用特定的酶免疫测定方法测得的吸光度值将呈正态分布，在具有95.3 ％(单侧)的可信度的情况下，可以将从正常人血清测得的吸光度均值 ＋2SD作为阳性判断值；如要求99％(单侧)的可信度，则以吸光度均 值＋3SD作为阳性判断值。与第一种方法相比，这种Cut-off值设定 方法更为科学一些，建立在统计学的精确计算的基础上，但由于这种 方法仅考虑阴性人群，故而难以确定“灰区”，有可能会出现较多的 假阴性，因其将整个“灰区”几乎都归为阴性。
确定CUT-OFF值的方法三
• 在测定大量正常人血清样本的同时，测定大量阳性血清样 本，如测定值为正态分布，则根据u检验的特点，以单侧 99.5%的可信限先分别确定阴性和阳性的Cut-off值；如 为非正态分布，则百分位数法单侧 95％或99％来确定 Cut-off 值 。 阴 性 和 阳 性 人 群 的 Cut-off 值 确 定 后 ， 根 据 “灰区”的大小，综合平衡考虑假阳性和假阴性率的情况 下确定Cut-off值。这种Cut-off值确定方法，较之单纯从 阴性人群考虑要较为全面一些，并且对测定的“灰区”有 一个估计，不会出现将“灰区”全部纳入阴性的情况。
ELISA实验中的这些坑你别跳
ELISA实验中的这些坑你别跳1971年瑞典学者Engvail和Perlmann，荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定⽅法，即酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 。
ELISA技术经过40多年的历史演变，⽬前仍然是⽤于定量检测⼤分⼦抗原常⽤的⼀种免疫测定技术。
⽆论你是实验室⼩⽩还是PhD⼤拿，只要是进⾏与免疫学相关的研究，⼀定离不开ELISA这门⼜⽼⼜实⽤的技术。
然⽽，说起ELISA实验，每个⼈都有⾃⼰不同的观点，有⼼酸也有喜悦。
为此，索莱宝列出部分ELISA实验中的⼩诀窍，告诉你：这些坑以后不必再跳了，让你成为师妹眼中的暧昧。
师妹师兄，ELISA实验最近⽼是问题不断，快帮我⽀⽀招吧。
什么问题？师兄师妹太多了，空⽩板；整板阳性或跳孔；标曲好样本值没结果等等。
不要着急，让我看看你的实验步骤和⽅案。
师兄师妹这个试剂盒购⾃国内***⼚家，按照说明书操作的啊。
我前⼏天⽤过索莱宝公司⽜MMP-9 ELISA试剂盒（Bovine MMP-9 ELISA Kit），结果还不错。
针对你实验过程中的问题，需要注意的有以下⼏点：1、样本：⾸先需要确认商品化试剂盒说明书中所述检测样本类型，⾎清、⾎浆和细胞上清还是组织裂解液等，样本禁⽤叠氮钠作防腐剂，避免反复冻融；2、样本稀释倍数：根据预实验的不同稀释梯度来确定正式实验样本的稀释倍数。
⼀般情况下，为了消除复杂基质中⼲扰成分的影响，⾄少进⾏2倍因⼦稀释；3、为了试验结果的准确性，尽量每个样本都做双孔重复；数据分析采⽤4-相参数曲线拟合（4-pI或sigmoidal曲线拟合）；4、如出现空⽩板的结果，请重复试验，确认每个步骤均正确操作，每步加样准确⽆误；5、如出现整板阳或跳孔的结果，请重复试验，避免每个步骤可能引起的污染，确保正确⽆误的操作，特别是洗涤过程；6、如果标曲好但是样本值没结果，说明试剂盒和操作均没有问题，可能原因：⼀是样本中⽬标分析物的含量太低，低于试剂盒的检测限，建议可选⽤更⾼灵敏度的产品或其他的⽅法检测；⼆是实验处理的⽅案需要调整优化；三是实验处理对样本中靶标物的含量⽆影响。
Elisa
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1.4.2 间接法
是检测抗体最常用的方法 原理为利用酶标记的抗原抗体（抗人免疫球蛋白抗体） 以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。
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目 录
1.概念
一
二 三 四
ELISA的基础
ELISA所需条件
2.原理 3.特点
4.分类
ELISA实验步骤 常见问题解答
3
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1.1 ELISA 的概念
指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载 体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定 性和定量检测方法。
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3.1 实验前准备
②
试剂的准备： 20x 洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1:20 稀释，即 1 份的 20x 洗涤
缓冲液加 19 份的蒸馏水。
③
洗板： 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 1min 后甩尽
夹心法（测抗原、抗体） 间接法（测抗体） 竞争法（测抗原） ABS-ELISA 法（测抗原、抗体）
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1.4.1 夹心法
双抗体夹心法测抗原
双抗原夹心法测抗体
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酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项
（2）温育温度的选择。 在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温 度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一 种则为43℃下45分钟。从免疫测定抗原抗体反 应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时 间最为完全，产物最稳定。如2－8℃下反应24 小时。较高的反应温度，由于分子运动的加快， 反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳 性样本测定没有问题，但对分子含量少的弱阳 性样本则有漏检的可能。因此，如须选择反应 条件，建议在临床ELISA测定中尽量使用较低 温度较长反应时间的条件。
而将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着 水面，可使温度迅速平衡。让反应板飘浮在水面 上。就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可 提高测定的重复性。
洗涤在ELISA虽不是一个反应步骤，但也决定着实 验的成败。ELISA就是靠洗涤清除残留在板孔中没 能与固相抗体（抗原）结合的物质，以及在反应过 程中非特异性的吸附于固相载体的干扰物质，以保 证ELISA测定的特异性。 洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯 载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂 既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水 溶液状态，从而脱离固相载体。 在实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式， 即手工和洗板机洗板。为保证微孔板的均一性使结 果准确可靠，最好选用洗板机洗板。若手工洗板， 要注意浸泡时间和孔间洗液最好不要互相流动。流 水冲洗法让水流冲击板孔表面，简便、快速，洗涤 效果较好。
3 加样本及反应试剂
4 温育
温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个 因素。 ELISA属于固相免疫测定，要使液相中的抗原或抗 体与固相上的特异性抗体或抗原完全结合，必须在 一定温度条件下反应一定的时间。一般温育所需时 间与温度成反比，即温度越高，所需时间相对较短。 最为常用的温度有37℃和室温(20－25℃)，其次是 43℃和2－8℃，目前国内ELISA商品试剂盒的反应 温育时间通常为37℃30－60分钟。 关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点：
ELISA实验操作中常见问题分析
ELISA实验操作中常见问题分析严峻溶血，以HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时刻快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中能够形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不完全、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。
2、试剂的阻碍a.分子量大。
合成肽采纳化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。
d.纯化难度大。
基因工程抗原的纯化技术难度较大。
合成多肽抗原是按照蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。
合成肽抗原有以下特点：a.分子量太小；b.一样只含有一个抗原决定簇；c.纯度高；d.稳固性差。
国内乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏锐性分别为89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。
有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳固比较差。
使用质劣的试剂必定导致结果的假阳性或假阴性。
因此。
选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。
•选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳固性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的要紧依据。
•要注意试剂的批号和出厂日期，尽管试剂的有效期多为1年。
最好选择刚出厂的试剂使用。
不同厂家的试剂不能混用。
不同方法学的检测试剂，会使两对半结果显现一些不同。
例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。
ELISA常见问题
ELISA常见问题1.ELISA试剂盒产品有哪几种规格？可检测多少个样本？产品分为48T和96T两种规格。
每次试验的标准曲线一般设5个不同浓度，加上空白孔，标准曲线一共需要6个孔。
因此，一个48T试剂盒可以测定42个样本（不做重复且一次用完），一个96T 试剂盒可以测定90个样本（不做重复且一次用完）。
当然，为保证试验的精准性，假如选择做双标曲，那么，48T试剂盒可以测定37个样本，96T试剂盒可以测定85个样本。
可以依据实际样本数量和试验计划选择合适的产品规格。
2.48T和96T的试剂盒有哪些不同？48T和96T的试剂盒，每个孔的反应体系都是一样的。
不同的是试剂盒中各组分的规格，详见说明书。
3.一次ELISA试验需要多长时间？双抗体夹心ELISA法一次试验需要4—4.5小时，竞争ELISA法一次试验需要2—2.5小时。
4.为什么有的试剂盒是采纳竞争ELISA法？小分子抗原或半抗起因于缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采纳竞争法。
其原理是标本中的抗原和固相载体上的抗原竞争生物素化抗体上的结合位点，标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的生物素化抗体愈少，最后的显色也愈浅，即显色深浅与样本中的抗原浓度成反比。
小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
5.用什么软件处理ELISA检测的数据比较好？ELISA标准曲线拟合可以应用CurveExpert软件进行数据分析。
它使用特别便利，可以生成美丽的曲线应用到论文之中。
软件可以在下载中心进行下载。
6.试剂盒做的结果不理想怎么办？试验结果不理想请适时与客服或技术支持联系，我们可以帮您一起分析试验结果。
假如仅凭试验数据无法判定，您可以将试剂盒发回给我们进行售后检测。
假如是试剂盒本身的质量问题，可以为您退换货；假如是试验操作的问题，技术人员可以给您一些改进的建议。
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（完整版）Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题
（完整版）Elisa常见类型及实验标准操作⽅法与常见问题Elisa常见类型及实验标准操作⽅法与常见问题酶联免疫吸附试验（ELISA）是⼀种实验室常⽤的检测⽅法，⼴泛应⽤于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。
与其他基于抗体的检测⽅法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相⽀持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和⾮特异性相互作⽤的分离，并可通过最终有⾊产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。
ELISA 实验通常以细胞培养上清液、⾎清、⾎浆以及组织裂解物等为样品。
该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作⽤的底物。
根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测⽅法。
该实验可迅速分析⼤量平⾏样品，在基础研究和临床诊断实践中⼴泛使⽤。
⼀、直接ELISA原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进⾏孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要⽤于测定抗原。
优点：操作流程简短，实验步骤少；⽆需使⽤⼆抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。
缺点：实验中的⼀抗需要直接⽤酶标记，成本相对较⾼。
⼆、间接法ELISA原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加⼊特异性⼀抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标⼆抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标⼆抗结合，从⽽间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显⾊。
优点：酶标⼆抗可加强信号，提⾼灵敏度；灵活性更⼤，同⼀酶标⼆抗可应⽤于多种不同的⼀抗；不直标⼀抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使⽤标记抗体更少。
缺点：交叉反应⼏率升⾼。
三、双抗夹⼼法ELISA原理：双抗体夹⼼法适⽤于测定⼆价或⼆价以上的⼤分⼦，但不适⽤于⼩分⼦抗原。
将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。
elisa竞争法注意事项
ELISA 竞争法是一种常用的酶联免疫吸附测定技术，用于检测抗原或抗体。
在进行ELISA 竞争法实验时，有一些注意事项需要考虑，以确保实验的准确性和可靠性。
以下是一些常见的注意事项：1. 试剂和抗体的选择：选择高质量的试剂和抗体是确保实验成功的关键。
确保所使用的试剂和抗体具有高特异性和亲和力，并根据制造商的说明进行储存和使用。
2. 样本处理：正确处理样本对于获得准确的结果至关重要。
确保样本在采集、储存和处理过程中遵循适当的操作步骤，以避免样本的污染、降解或失效。
3. 标准曲线的绘制：绘制准确的标准曲线是定量分析的基础。
确保标准品的浓度范围覆盖待测样本的预期浓度，并使用合适的稀释液进行稀释。
4. 控制样本的设置：设置适当的阳性和阴性对照样本，以确保实验结果的可靠性。
阳性对照应产生预期的阳性结果，阴性对照应显示无反应。
5. 洗涤步骤：洗涤步骤对于去除未结合的试剂和杂质非常重要。
确保洗涤缓冲液的质量和洗涤次数足够，以避免假阳性结果。
6. 孵育时间和温度：严格按照试剂盒的说明控制孵育时间和温度。
过长或过短的孵育时间以及不正确的温度可能会影响实验结果。
7. 数据分析：仔细分析实验数据，确保结果在可接受的范围内。
如果结果异常，应检查实验步骤和试剂是否存在问题。
8. 质量控制：定期进行质量控制检查，包括试剂的批间和批内变异、仪器的校准和维护等，以确保实验的稳定性和准确性。
以上是 ELISA 竞争法实验中的一些注意事项。
在进行实验时，应严格按照试剂盒的说明书和实验方案进行操作，并遵循实验室的标准操作程序，以获得可靠的实验结果。
如果你对实验有任何疑问，建议咨询相关专业人士或参考相关文献。
ELISA操作及常见问题分析
摘
要 ：Ｅ ＩＡ（ 联 免 疫 吸 附 测 定 法 ） 测 结 果 是 否 准 确 可 靠 ， 了 有 优 质 的 试 剂 ， ＬＳ 酶 检 除 良好 的 仪 器 ， 确 的操 作 正
在 Ｅ ＩＡ 检 测 中是 非 常 重 要 的 一 步 ． 本 采 集 和 保 存 、 确 加 样 、 浴 的 温 度 与 时 间 、 涤 液 的 浓 度 ， 可 直 接 影 ＬＳ 标 准 温 洗 均 响 到 Ｅ ＩＡ 检 测 结果 的 准 确性 ． 本 底 及 假 阳性 产 生 原 因 的 正 确 分 析 ， 确 对 临 界 （ Ｕ Ｆ 值 附 近 的 血 清 处 Ｌ聚合 ， 间接 法 的试 剂 本 ｇ 使
底加深 ． ］ 超过 一周 测定 的需 一２ ℃冰 冻保存 ． 结 Ｏ 冻
血清 融解后 ， 白质 局 部浓 缩 ， 布 不均 ， 充 分 混 蛋 分 应 匀并避 免产 生气泡 ． 浊 或 有沉 淀 的血 清标 本 应先 混
白原 的干扰 可造成 假 阳性 ， 议 尽 量不 用 抗 凝 血尤 建
１ Ｅ Ｓ 操 作 要 点 ＬＩＡ
优 质 的试 剂 ， 良好 的 仪器 和 正确 的操 作 是保 证 Ｅ ＩＡ 检测结 果 准确可靠 的必 要条 件． ＬＳ １ １ 标本 的 采集和保 存 ． 大部分 Ｅ Ｓ １ Ａ检 测均 以血清 为标本 ． Ｉ 血清标 本 可按 常规 方法采 集 ， 注意避 免溶 血 ， 细胞溶 解时 应 红 会释 放 出具 有过 氧化 物 酶 活性 的物 质 ， 以辣 根 过 氧 化物 酶 （ Ｐ 为标 记 的酶 联免 疫 吸 附剂 测定 中 ， ＨＲ ） 溶 血标 本可能 会增 加非 特 异性 显 色 ． 清 标本 宜 在 新 血
ELISA常见问题
ELISA常见问题Author:Elabscienceviews:2361. 产品有哪几种规格？可检测多少个样本？产品分为48T和96T两种规格。
每次实验的标准曲线一般设7个不同浓度，加上空白孔，标准曲线一共需要8个孔。
因此，一个48T试剂盒最多可以测定40个样本（不做重复且一次用完），一个96T试剂盒最多可以测定88个样本（不做重复且一次用完）。
可以根据实际样本数量和实验计划选择合适的产品规格。
2.48T和96T的试剂盒有哪些不同？48T和96T的试剂盒，每个孔的反应体系都是完全一样的。
不同的是试剂盒中各组分的规格，详见说明书。
3. 产品的稳定性如何？产品在研发前期已通过严格的稳定测试，发货前亦须通过检测并提供质检报告，在市场上深受广大客户的赞许！4.贵公司有没有酶活性检测的试剂盒？酶活力的测定实际上就是测定酶促反应的速率。
酶活力的大小即酶含量的多少，可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示，单位是U/g或U/ml。
酶活力的测定方法：⑴测定完成一定量反应所需的时间，⑵测定单位时间内酶催化化学反应量。
主要通过产物的增加量或底物的减少量来测定。
常用的方法有：⑴分光光度法，⑵荧光法，⑶同位素测定法，⑷电化学法。
ELISA的方法一般是对可溶性抗原或抗体进行定性和定量的检测，所以酶活性是不能用ELISA来检测的。
5.一次ELISA实验需要多长时间？双抗体夹心ELISA法一次实验需要4-4.5小时，竞争ELISA法一次实验需要2-2.5小时。
6.血清样本如何处理？全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
7. 血浆样本如何处理？应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，于1000×g离心15分钟，仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
8. 尿液样本如何处理？用无菌管收集。
酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法
酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是一种常用的实验技术，用于测定样品中特定蛋白质或抗原的浓度。
然而，在进行ELISA实验时，存在许多可能影响实验结果的因素。
本文将介绍一些常见的影响因素及如何处理这些问题。
1.样品质量：样品质量是影响ELISA实验结果的一个重要因素。
如果样品质量不合格，可能会导致错误的实验结果。
处理方法包括：-选择合适的样品储存条件，避免样品的变性、降解等问题。
-对样品进行适当的纯化和浓缩处理，以提高样品的纯度和浓度。
2.抗体选择：在ELISA实验中，正确选择适合的抗体也是非常重要的。
处理方法包括：-确保抗体的特异性和亲和力，避免与其他非特定蛋白结合。
-对抗体进行亲和纯化，以提高抗体的纯度和活性。
3.反应条件：ELISA实验中的反应条件包括温度、时间、pH等，这些条件的选择直接影响到实验结果的准确性。
处理方法包括：-对反应条件进行优化，确定最佳的温度、时间、pH等参数。
-控制反应时间，避免反应过长或过短而引起实验结果的偏差。
4.检测方法：ELISA实验中常用的检测方法有酶标记物检测、放射性同位素检测、荧光检测等。
不同的检测方法对实验结果的影响也不同。
处理方法包括：-选择合适的检测方法，根据实验的目的和需要进行选择。
-对检测方法进行优化和标准化，以提高检测的准确性和灵敏性。
5.交叉反应：ELISA实验中，样品中的其他成分可能会引起交叉反应，导致实验结果的误差。
处理方法包括：-使用对特定抗原具有高度特异性的抗体，避免与其他非特定抗原结合。
-对样品进行适当的稀释，以减少交叉反应的可能性。
6.数据分析：ELISA实验的数据分析是实验结果的重要环节。
处理方法包括：-使用适当的统计方法对实验数据进行分析，确定浓度或活性的可靠性。
-进行实验重复和平行实验，以确保实验结果的可重复性和准确性。
（2017版）ELISA试剂盒实验常见问题大全
（1）问：小鼠乙酰胆碱Elisa试剂盒后期数据处理中空白的OD值有什么作用？答：可以将标准品和样本的OD值同时减去空白的值进行计算，或者都不减，保持同一水平就行。
（2）问：那我们算出来的ACH含量为什么出现负值？答：说明个别样本的浓度很低,当浓度接近第6个点的时候,直线方程就有可能计算出负值。
（3）问：小鼠乙酰胆碱ELISA试剂盒，组织标本切割标本后能用生理盐水稀释吗？还有稀释的倍数是多少?答：生理盐水也可以，加入量1:3。
（4）问：我想问一下，标准品浓度与标准品吸光度值之间是不是线性回归？检测出来的吸光度值很低一般都存在哪些原因？大部分在0.08左右？（大鼠5羟色胺（5-HT）Elisa试剂盒）答：是线性回归。
检测出来的值比较低，样本、稀释、操作等，原因很多，但只要在可操作范围就行。
（5）问：做出来的结果：标准品的吸光度呈线性回归，但是样品的吸光度都和本体吸光度值接近，正常未予干预的大鼠血浆都基本没有5-HT 表达，这是什么原因？（大鼠5羟色胺（5-HT）Elisa试剂盒）答：样本、稀释、室控和机器操作等，原因都可能造成吸光度都和本体吸光度值接近，好像荧光法里面有种试剂盒可以检测滴度。
（6）问：Elisa试剂盒的使用的方法是什么啊？答：采用双抗夹心法（目前暂行）（7）问：一个孔需要多少量的血清？答：一个孔上样量10-50微升。
（8）问:未处理的样本我需要邮寄多少的量？答：每个孔需要100ul（9）问：样本怎么保存？答：当天要用的样本保存4℃，隔天样本-20℃（近期一个月左右要用的样本），长期保存样本-70℃（一年或者更长时间多久都可以用），避免反复冻融。
（10）问：EP管是什么管？答：离心管。
（11）问：收集血清的时候用什么管？答：普通离心管即可。
（12）问：96t可以检测多少个样本？48t可以检测多少个样本？答：96t标准的可以检测85个样本，其他有10个标准品孔，1个空白对照。
96t单孔可以检测90个样，7个标准品控1个空白对照。
浅谈ELISA检测中的注意事项及常见问题
浅谈ELISA检测中的注意事项及常见问题酶联免疫吸附试验（ELISA）检测的原理是：捌抗原或抗体包被到固相载体表面。
将受检样品和酶标抗原或抗体，按一定程序与已包被的抗原或抗体反应，形成抗原抗体复合物，加入酶反应底物后，底物被酶催化成有色产物，最后通过定性或定量的分析有色产物的量，即可确定样品中被测物质的含量。
ELISA法由于测定灵敏、特异，操作简便，且无放射性污染等优点，已成为目前应有最广的一种免疫测定技术。
在基层医院主要用于乙肝抗原抗体及HIV抗体的检测。
现将ELISA操作中的注意事项及常见问题讨论如下：1 注意事项1.1仪器设备：①实验室设备应定期维护校准，酶标仪、水温箱、加样枪，应每年校准一次。
②每日查看并登记冰箱的温度。
③洗板机的管路用纯净水冲洗，以防堵塞和腐蚀。
1.2试剂准备：①检查试剂的注册证、包装、效期。
②从冷藏环境取出的试剂盒应平衡至室温后方可使用。
微孔③板打开包装后应立即将未使用的板条装入有干燥机的自封袋中密封，置2-8℃避光保存，尽快使用。
④洗涤液若出现絮状沉淀应立即更换。
⑤试剂使用前应摇匀。
⑥不同批号的试剂不可混用。
⑦所用的蒸馏水应有质量保证。
1.3标本的采集及保存①溶血标本因血清中含有过氧化物酶易造成假阳性。
未②完全凝固的血液标本应含有纤维蛋白原易造成假阳性。
③被微生物污染的标本可造成假阳性。
④待测标本不可使用NaN3防腐可造成假阴性。
⑤标本在2-8℃保存，若长期保存应置-20℃保存并避免标本反复冻融1.4加样需①有经验操作人员进行操作。
②加样枪吸样及排放速度要均匀一致，不能过快。
③每加一份样本须更换吸头，一管血检测多个项目时，应先做ELISA测定，避免交叉污染。
④加样后应充分混匀。
1.5孵育：常用的孵育温度是37℃，温育时间和温度严格按说明书操作。
1.6洗板虽不是反应过程，但却是决定实验成败很关键的一步。
洗①板机洗板设置合理的工作程序，板孔加液量不宜过多或过少。
②手工洗板：弃去孔内液体，将洗涤液注满各孔，静置30-40秒，甩干，重复5次排干，拍板纸不能重复使用，应注意个人防护。
ELISA抗体检测中常见问题及解决方法
物 使 用 或 由 于 操 作 上 的失 误 ，造 成 反 应孑 Ｌ 中有 较 多 气 泡 。
１ － ２ ＿ ２ 移液器计 量不准 ． 吸 嘴 内水 分 太 多或 不 清 洁 。 １ ． ２ ． ３ 样 品离 心 不 完 全 ． 反 应孑 Ｌ 内 发 生 凝 血 或 残 留细 胞 成 分 ：加 样 时 交 叉 污染； 样品数量较 多 ， 加样时 间过 长 ，
特 异 性 结 合 紧 附 于 反 应 孔 周 围 。难 以 清洗彻底。 会出现显色弱（ 高） ， 灵 敏 度
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试剂后要 观察液 面高度是 否一 致 ． 以 防 止 漏加 或 多加 的 现象 ：样 品 和 试 剂
中可 能 不 含 强 阳性 标 本 ； 厂 家试 剂 质 量 的变 化 等 。 １ ． １ ． ２ 试 剂 、样 品 用 前 未 平 衡 至 室
染 ：洗 涤 液用 量 不 足 或 稀 释 倍 数 不 符 合要 求 ， 洗 涤 时 冲击 力 太 大 ， 浸 泡 时 间 过 长 或不 够 。 １ ． ４ ． ３ 反 应 板 过 多 造 成 洗 板 等 待 时
假 阳性 、 重 复性 差 等 现象 。
２ 解 决 办 法
保反应板充分洗涤。
２ ． ５ 在 进 行 读 板 前 ．应 校 对 酶 标 仪 ， 设 定 酶 标 仪 的 参 数 ，特 别 是 检 查 滤 光 片 是 否 与 设 定 值 匹 配 ， 以保 证 正 确 读 数。
人 ：终 止 液 误 作 洗 涤 液 稀 释 或 当成 底
注满每孔 ． 但 不要 溢 出 。洗 板 时 ， 要 用
力 甩 出 内容 物 （ 可多甩几 次 ） ， 并 在 干 净、 无 或 少尘 的 吸水 材 料 上 拍 于 ， 检 查 洗板 机的孑 Ｌ 针 是 否 有 堵 塞 的情 况 ， 确
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1、ELISA试验的稳定性问题
做ELISA实验时，结果老是重复性不上，相同的材料和相同的操作方法做出的结果就截然不同，上午做时其OD在1.5，下午做时就是0.9了，所以都没有办法下结论，为什么会差异这么大呀？
（1）多设平行空孔，请别人代劳，以判断究竟是否操作问题
（2）对于活性非常高的包被物和酶标记物，如果第一次选择的范围恰好在其平台位置边缘，那么在重复的时候，每次取样带来的微量误差就很容易导致大的偏差了，特别是线性比较好的原料试剂，这个就很正常了。
建议每次取样的时候只使枪尖一点点位于液面下，以免吸嘴外面沾有少量抗原or抗体or酶而使结果重复不上。
2、酶不稳定，有何高招？
（1）保存浓度尽量高些，
（2）另外可以添加牛血清白蛋白等蛋白保护剂，以避免其被吸附或沉降以及被蛋白酶所降解。
（3）加入50%甘油-20度保存、避免反复冻融。
（4）还可以加入防腐剂防止长菌（注意不能用叠氮钠，其对HRP活性有很大影响）（5）现在一些公司也有商品化的酶标保护剂供应，可以考虑一下
酶类的稳定性与保存方法的很大关系。
干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可。
液态稳定性较差，贮藏时应注意以下几点：1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易降解、变性。
2、一般需加入防腐剂和稳定剂，酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。
此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。
3、贮藏温度要求低，避免反复冻融。
3、ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值，是什么原因呀？
做夹心法ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值，是什么原因呀？
最大的原因是封闭的效果不好，应该调整封闭液；
可以尝试不同的封闭剂（BSA、胶脂奶粉、明胶等）、不同的封闭浓度、时间，试试哪个效果好
阴性的里面的其他蛋白起到了封闭的效果
4、边缘的阴性OD值老是比中间的偏高，什么原因呢？
我做ELISA时，有一段时间在板的最后一条板孔的阴性的OD值经常比在中间的高，有时候高出0.1个OD，导致实验经常重复，但原因也找不到在哪里？
这可能是由于ELISA的边缘效应造成的。
ELISA的边缘效应是指边缘孔与中心孔反应条件不一致，由于边缘效应的影响，同一标本在边缘孔测定的结果明显高于中央孔，且随边缘孔与中央孔的距离的增加而增强。
原因在于试验过程中边缘孔与中央孔的温度、液体蒸发程度不同以及各孔表面存在光洁度等物理性状的差异有关。
为克服其影响，应尽可能使用中
央孔及其周围反应孔。
ELISA边缘效应是由温育形成的。
所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。
另外，酶标板也是一个比较重要的因素，选择质量好一点的板能一定程度减少板内误差，我用costar的板，到目前为止还没有出现边缘孔与中心孔反应不均的情况。
5、做ELISA对梯度怎么要求的啊？
做ELISA的时候老板让我们选择的抗原or抗体都是有明显梯度的，不是很明白他们的观点，有时候稀释不同的倍数但是活性相差不大，就象在一个平台区段自己感觉在这么一个范围里面都可以使用应该更好，这样即使是有很小的取样误差也不会影响实验，应该更好才对！做ELISA对梯度这么要求究竟是什么目的，具体怎么要求的啊？
（1）我们做ELISA试验时是要求梯度比较明显的才是好的抗原，每个抗原都会有一个最适平台期，就是在这个范围之内变化浮动不会很明显，所以我们会选择平
台期的起点不会选择终点。
如果你没有做到他的下限的话就不会知道抗原在哪
个浓度时是平台期的终点，有可能你选择的是终点，这样就不是最佳的抗原浓
度。
等到做稳定性试验时灵敏度应该会下降的很明显。
既然选择的是平台期的起点，那么也就是再往后是一个平台期了，那也不会有什么梯度了，这样看得话有明显梯度的，如果处于下降阶段的反倒没什么用了，这样更难找平台期的起点？
（2）看你走的包被浓度的范围怎么样，如果跨度很大的话，梯度就会很明显。
反之，跨度小的话就不会有很明显的梯度，说明你应该在这一段之间选择最适浓度
6、做elisa试剂盒一定要带上阴阳性对照吗？对试剂盒起到什么作用？
对照最最基本的作用是评价你的实验体系：阴性对照验证你的实验是否存在污染造成假阳性；阳性标本验证你的实验体系是否成立。
可以不做，但出了问题你会抓不找头绪，不知道问题出在什么地方。
此外，如果作为实验数据必须要有对照。
阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。
以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。
阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。
例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。
阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，阳性判定值（cut-off value）一般为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。
质控制血清分定值和未定值两种。
如
只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平，称为临界值。
乙肝标志物临界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。
临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品，它可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。
7、把酶加到显色剂中A和B中，为什么在A中酶活性掉得比较慢，但是在B中就掉得很快，是什么原因呢？
HRP的显色试剂，不管是直接显色的还是曝光的，A液都是显色底物，但不是直接与HRP作用的，而是呈色/曝光的底物（DAB，TMB, Luminol等），它们的直接激活物是O2－；B液一般是过氧化氢，这才是HRP的直接底物。
整个HRP显色的过程是：过氧化氢被HRP催化放出O2－，然后作用于呈色/曝光底物，产生颜色/发光现象。
由于过氧化氢性质不稳定，所以不能将它与显色/发光底物长时间保存一起，所以一般的Kit都是装成A、B 两管
8、夹心ELISA中本底高，该如何控制？
本人在夹心ELISA实验中，先用一种单抗包被ELISA板，使用的酶标抗体是biotin标记的另一单抗，但问题是本底高，该如何控制？
可能出现的原因有：
1。
单抗与后续的生物素标记的抗体发生了非特异性吸附，所以加入HRP标记的链亲和素时，导致OD值相应增加；
2。
加入HRP标记的链亲和素的浓度过高，洗涤不彻底；
3。
封闭不完全
4。
生物素标记的抗体与封闭剂发生非特异性吸附
9、检测脑钠肽时为什么要加入EDTA和抑肽酶啊
加入EDTA的目的是抗凝,获取血浆进行分析.
要加入适量的抑肽酶，用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解
10、。