影响细胞ELISA结果的主要因素
酶联免疫吸附法步骤
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酶联免疫吸附法步骤（大纲）一、酶联免疫吸附法（ELISA）概述1.1ELISA的定义及原理1.2ELISA的分类及应用二、实验准备2.1试剂与材料准备2.1.1主要试剂2.1.2主要材料2.2仪器设备准备2.2.1温度与湿度控制设备2.2.2混合与振荡设备2.2.3其他仪器设备三、实验步骤3.1微孔板的包被3.1.1包被抗原/抗体3.1.2包被后处理3.2封闭3.2.1封闭液的选择3.2.2封闭处理3.3样本及标准品的加入3.3.1样本稀释3.3.2加入标准品与样本3.4抗原/抗体结合3.4.1结合时间与条件3.4.2洗涤3.5酶标二抗的加入3.5.1酶标二抗的稀释3.5.2酶标二抗的结合3.6洗涤3.6.1洗涤次数与条件3.6.2洗涤液的选择3.7显色反应3.7.1底物的选择3.7.2显色条件3.8终止反应3.8.1终止液的选择3.8.2终止反应操作四、结果与分析4.1光密度值（OD值）测定4.2标准曲线的制作4.3结果计算与判断五、实验注意事项及质量控制5.1实验操作注意事项5.2质量控制措施5.2.1试剂质量控制5.2.2设备与操作规范5.2.3数据处理与分析六、实验结果的临床应用与意义6.1ELISA在临床检测中的应用6.2ELISA结果的临床意义及局限性6.3检测结果与临床诊断的关联分析一、酶联免疫吸附法（ELISA）概述酶联免疫吸附法（ELISA），是一种常用于检测和分析生物样本中蛋白质、多肽、抗体等生物大分子的分析技术。
ELISA检测
ELISA检测 ----- 固相捕获法测IgM抗体在病原体急性感染的诊断中，通常需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM检测和TORCH项目的系列IgM检测等。
IgM抗体也有使用间接法测定的，如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。
在使用间接法测IgM抗体时，由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。
因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。
这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。
目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。
具体操作步骤如下：1．首先将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
2．加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。
3．加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一定时间后洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。
4．加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。
5．加入酶底物，温育显色测定本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。
RF(1gM类)由于其能与固相抗人u 链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应。
酶联免疫吸附实验
记录结果有下列几种方法： 1、“+”或“-”：所有超过规定的O.D值（如O.D，0.4） 的标本均属阳性，此规定O.D值是根据事先测定大量阴 性标本所取得的，此规定值是阴性标本的上限。或者以 一组阴性标本O.D平均值加2～3个标准差作为阳性阈值。 2、直接以O.D值来表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越 大，阳性反应越强，但此数值是在固定实验条件下得到 的结果，而且每次实验都要有参考标本作对照。 3、以终点滴度表示：将标本作连续稀释，最高稀释度 能出现阳性反应者（即OD值仍大于阳性阈值，即为该 标本的滴度。
（三）试验样品
（四）结合物
(五）洗涤剂与稀释剂
（六）底物
（七）作用时间
（八）结果判断
(九)试验的重复性（精确度）
（十）对使用仪器要求
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（一）固相载体
在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑 料管。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能 是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型 及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺 不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚 至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须 经过实验室鉴定 。
5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，再测定一 个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作ELISA检 测后，以O.D值为纵坐标，单位数为横坐标，画出标准曲线。 以后可根据被检标本的O.D值，从曲线上找出相应的单位数， 再乘于血清的稀释倍数，即可得出被检标本的单位数。
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（十）对使用仪器要求
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（八）结果判断
ELISA的试验结果可用肉眼观察颜色反 应的深浅作出判断，也可用分光光度计作 精确测定。当然,后者更为正确。而肉眼观 察更为简便，而且也有一定正确性。
ELISA法检测HIV抗体影响因素分析
ELISA法检测HIV抗体影响因素分析作者：李志明来源：《中外医疗》 2011年第5期李志明(滨州市中心血站山东滨州 256600)【摘要】目的探讨ELISA法在检测HIV抗体中的影响因素,提高实验结果准确性。
方法从试剂的准备、样品的采集和储存以及仪器和操作等方面分析每一环节的质量控制对检验结果的准确性所起到的影响。
结果做好试剂的选择和准备,规范操作,做好每一环节的质量控制,在ELISA法检测HIV抗体中非常重要。
结论选择灵敏度高、特异性好的试剂,严格按照试剂说明书要求,注意操作中的诸多影响因素,能有效保证检测结果的准确性。
【关键词】 ELISA法 HIV抗体影响因素【中图分类号】 R187 【文献标识码】 A 【文章编号】 1674-0742(2011)02(b)-0191-02随着艾滋病流行形势的日趋严峻,新发现的感染者数量不断增加,艾滋病检测也显得越来越重要。
目前国内艾滋病初筛试验室检测HIV抗体的方法主要是酶联免疫法(ELISA)。
ELISA法是敏感性高、特异性强、重复性好的试验诊断方法,其试剂具有稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素,既适用于大规模筛查试验,又可以使用于少量标本的检测等优点。
但ELISA法的实验过程中有很多影响因素,如何消除诸多影响因素,保证检测结果的准确性,笔者在实际工作中经长期观察总结,对ELISA法检测HIV抗体影响因素分析如下。
1 试剂的准备《全国艾滋病检测技术规范》(2009版)规定,HIV抗体检测试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准,在有效期内的试剂,其中酶联免疫试剂应批批检合格,推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。
ELISA多为单纯HIV抗体检测试剂,HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。
HIV抗原或抗体被包于固相载体,加入待检样品和酶标记的HIV抗原或抗体,加底物显色,用酶标仪测定结果。
Elisa
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1.4.2 间接法
是检测抗体最常用的方法 原理为利用酶标记的抗原抗体（抗人免疫球蛋白抗体） 以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。
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目 录
1.概念
一
二 三 四
ELISA的基础
ELISA所需条件
2.原理 3.特点
4.分类
ELISA实验步骤 常见问题解答
3
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1.1 ELISA 的概念
指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载 体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定 性和定量检测方法。
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3.1 实验前准备
②
试剂的准备： 20x 洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1:20 稀释，即 1 份的 20x 洗涤
缓冲液加 19 份的蒸馏水。
③
洗板： 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 1min 后甩尽
夹心法（测抗原、抗体） 间接法（测抗体） 竞争法（测抗原） ABS-ELISA 法（测抗原、抗体）
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1.4.1 夹心法
双抗体夹心法测抗原
双抗原夹心法测抗体
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ELISA实验中的假阳与假阴分析
ELISA实验中的假阳与假阴分析医学实验中，ELISA是一种常用的特异性强、灵敏度高、操作简便的检测方法。
然而在实际应用中，ELISA操作的各方面均会对结果产生影响，优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件，另外一些非主观因素会对结果造成较大偏差。
ELISA假阳性与假阴性的原因与解决办法：1.假阳性：假阳性的出现通常是样本中掺杂有同源或同工物质，例如类风湿因子、补体、交叉反应物质和其它物质等。
A.原因：溶血会使样本中具有弱过氧化物酶活性的亚铁血红素催化底物四甲基联苯胺（TMB）显色，产生假阳性结果。
解决办法：在处理ELISA最常检查的血清样本时，注意凝集过程、离心过程等细节，避免出现溶血和掺杂血细胞；B.原因：类风湿因子（一种能结合多种动物IgG Fc的自身IgM抗体）可与酶标二抗Fc结合造成假阳性。
解决办法：在检测抗原时可加入2-巯基乙醇使其降解，或用热变性IgG（63℃，10 min）进行封闭处理，另外，使用F(ab)2替代完整的IgG也可达到目的。
一些其他的嗜靶抗原自身抗体，如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素球蛋白等在检测时，可能与靶抗原结合形成复合物，干扰测定结果，所以在测定前需用理化方法将其解离后再测定；C.原因：补体一方面会使一抗和酶标二抗分子发生变构暴露出Fc段C1q分子结合位点，从而将二者连接起来造成假阳性。
另一方面也可能会结合固相抗体从而封闭其与抗原的结合表位而造成假阴性。
解决办法：对细胞培养用血清、动物血清样本进行56 ℃，30 min的补体灭活，另外，通过用EDTA稀释样本也可降低这种作用；D.原因：类地高辛、类AFP等物质能与抗原产生交叉反应。
尤其在使用单抗测定抗原时，如果正好交叉反应的抗原决定簇是单抗结合位点时，会出现假阳性结果；E.原因：样本中因实验处理或污染含有某些细菌，如表皮球菌，菌体释放的内源性HRP可能会对检测结果造成假阳性；F.原因：血液标本未完全抗凝即开始离心，析出的纤维蛋白易在孔板中形成白色薄膜或者絮状物，若清洗不干净，残余在孔板中极易使吸光度值偏高，造成假阳性；G：原因：血液标本保存过久易滋生细菌，影响检测结果，时间过长的标本，血清标本IgG聚集成多聚体，AFP形成二聚体，造成假阳性；H.原因：试验温度过高或过低都有可能引起血清蛋白异常，造成假阳性。
影响细胞ELISA结果的主要因素
影响细胞ELISA 结果的主要因素The major factors influencing the result of cell ELISA李蓉芬, 陈 敏, 康运生, 钟小林, 何凤田(第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室,重庆400038)细胞ELISA(酶联免疫吸附试验) 是用细胞代替可溶性抗原包被于96 孔酶联板(或细胞培养板) 进行免疫学检测的一种有效方法,该方法特别适用于抗原位于细胞膜上而相应抗原的特性又不十分清楚或抗原难于纯化等情况[1～3] 。
我们在实际操作过程中体会到细胞ELISA 的结果理想与否与多种因素有关, 概括起来包括以下几方面。
1 细胞状态应使用对数生长期的细胞。
此期细胞的活力最好,抗原表达水平最高。
对贴壁细胞来讲,此期细胞贴壁最牢。
2 细胞固定2.1 悬浮生长细胞的固定将细胞用PBS 洗涤后,重悬于PBS 计数。
按(4～5) ×105/ 孔加于96 孔酶标板中,1 200 r/ min 离心12～15 min, 弃上清,充分干燥后,每孔加入50μl PBS 配制的0.25 % 戊二醛作用10～12 min, 弃固定液,PBS 洗3 次。
此处应注意的问题有: ①细胞洗涤:目的是去除培养基中的血清,利于后续固定。
②最初每孔悬浮细胞用的液体量:至少应在200μl/ 孔左右,否则会因液体量少而在后续离心中使细胞不均匀分布,进而影响酶联检测结果。
③离心:速度不能过高(为1 200～1 800 r/ min) ,离心时间不能过长(为10～18 min) ,否则可能破坏细胞。
④镜检:离心后的细胞置显微镜下观察,对细胞分布明显不均的孔进行标记, 在后续实验中弃用。
⑤固定前细胞应充分干燥:否则残液可使细胞固定不牢。
⑥固定液的选择:通过比较,在相同时间内(室温) ,0. 25 % 的戊二醛较4% 的多聚甲醛的固定效果好。
2.2 贴壁细胞的固定将细胞接种于96 孔新细胞培养板中,培养36 h 左右,使细胞达80 %～90 % 满孔密度,弃培养基,温PBS 洗2 次,充分干燥后,同上固定8 min ,PBS 洗3 次。
《ELISA检测技术》课件
总结词
通过间接利用酶标记的抗抗体与待测 样本中的抗原反应。
详细描述
间接ELISA是在固相载体上包被已知 抗原，然后加入酶标记的抗抗体与待 测样本中的抗原反应，再加入底物显 色，达到检测抗原的目的。
夹心ELISA
总结词
通过酶标记的二抗将待测样本中的抗原夹在固相载体和酶标记的抗体之间。
详细描述
夹心ELISA是在固相载体上包被特异性抗体，然后加入待测样本与酶标记的二抗 反应，形成固相抗体-抗原-酶标记抗体的复合物，再加入底物显色，达到检测 抗原的目的。
《elisa检测技术》ppt 课件
目录
• ELISA检测技术概述 • ELISA检测技术的分类 • ELISA检测技术实验步骤 • ELISA检测技术的影响因素 • ELISA检测技术的优缺点 • ELISA检测技术的应用实例
01
ELISA检测技术概述
ELISA检测技术的定义
要点一
酶联免疫吸附分析（EnzymeLinked Immu…
一种基于抗原-抗体反应的检测技术，通过酶标记的方法将 免疫反应与化学信号放大，实现对目标分子的定量或定性 分析。
要点二
特点
灵敏度高、特异性强、操作简便、适用于大量样本检测。
ELISA检测技术的原理
抗原或抗体与固相载体表 面的抗原或抗体结合，形 成固相复合物；
加入酶标记的抗原或抗体 ，与固相复合物结合；
基因表达研究
通过ELISA检测技术可以检测基因表达产物的含量和活性，了解基因表达的规律和调控机制。
THANKS
感谢观看
显色
01
02
03
显色
加入显色底物，使抗原抗 体复合物呈现颜色反应。
显色底物
Elisa 实验原理及实验开发
酶
体结合的共价结合 的基团。
用酶标记的抗体（或抗原）建立的免疫测定法，可以使结果 得以放大，保证了测定方法的灵敏度。
5
特异性强：ELISA的特异性来自抗体或抗原的选择性
抗原与抗体结合反应具有专一性， 其实质是抗原分子表面的抗原决 定簇与抗体的抗原结合位点的在 化学结构和空间构象呈互补关系， 所以抗原抗体反应具有高度特异 性。
直接法
操作手续简短，节省时间； 因无须使用二抗可避免交互反应
标记一抗，灵活性差，费用高；主要用于测定样品中的抗体量，
无信号放大，灵敏度低
例如感染后的血清抗体水平
间接法 夹心法 竞争法
信号放大，灵敏度提高：多个二抗
会与一抗结合；
与直接法相比，用时较长；
灵活性高：相同的二抗可以用于多 二抗可能导致交叉反应
比例，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
3
ELISA特点： ➢ 灵敏度高 ➢ 特异性强 ➢ 可定性和定量 ➢ 用途广泛、易于操作、通量高
4
灵敏度高：ELISA测定法的灵敏度来自于与抗体（或抗原）结合的酶。
高活性
具有可与抗原、抗
一个酶蛋白分子每分钟可 以催化103-104个底物分子 转化为有色产物。
注意： （1）有些厂商生产的BSA里含有较高浓度的牛抗体，在实验中可能与二抗进行 结合从而造成假阳性的情况。 （2）有研究表明，封闭剂的封闭效果与分子量大小成反比，如果传统的封闭 剂起不到很好的封闭效果时，可以选用分子量更小的封闭剂（如酪蛋白）。 （3）如果检测体系是生物素-链霉亲和素体系，不能使用脱脂奶粉作为封闭剂， 因为脱脂奶粉中含有生物素，会对检测系统产生干扰。
Elisa 实验原理及实验开发
2020.12.31
《elisa检测技术》ppt课件(2024)
拓展ELISA检测技术在生物医学、环境监测 、食品安全等领域的应用，推动相关产业的 发展。
2024/1/28
22
06 ELISA实验操作技巧与注 意事项
2024/1/28
23
实验前准备工作建议
01
仔细阅读试剂盒说明书 ，了解实验原理、操作 步骤和注意事项。
2024/1/28
02
准备好所需的试剂、耗 材和仪器，确保它们的 质量和性能符合要求。
去除异常值、缺失值等， 保证数据质量。
2024/1/28
数据转换
对数据进行对数转换、归 一化等处理，以满足后续 分析需求。
统计分析
采用t检验、方差分析等统 计方法，对实验组和对照 组数据进行比较，评估差 异显著性。
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结果解读与报告撰写
结果解读
根据统计分析结果，结合专业知 识对实验数据进行解读，如判断 样品中目标物质的含量是否超标
《elisa检测技术》ppt课件
2024/1/28
1
目 录
2024/1/28
• ELISA检测技术概述 • ELISA实验方法与步骤 • ELISA实验数据分析与解读 • ELISA技术在生物医学领域应用 • ELISA技术挑战与发展趋势 • ELISA实验操作技巧与注意事项
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01 ELISA检测技术概述
发展多重ELISA检测技术，实现对多个目标物的同时检测，提高检 测效率。
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新型ELISA技术发展趋势
数字化ELISA
利用微流控、微阵列等技术，实现ELISA检测的数字化、自 动化和智能化。
免疫荧光ELISA
结合免疫荧光技术，提高ELISA检测的灵敏度和特异性。
化学发光ELISA
酶联免疫吸附试验的影响因素
酶联免疫吸附试验的影响因素酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
它的原理是通过特异性抗体与抗原结合，再利用酶标记的二抗介导的颜色反应，来定量分析和检测目标物质。
在进行ELISA实验时，有多个因素会对实验结果产生影响，下面将详细介绍其中的几个主要影响因素。
1.试剂的质量ELISA实验的试剂质量对实验结果至关重要。
这包括酶标记抗体和底物酶的纯度、活性，抗原或抗体的纯度和浓度，以及稀释缓冲液的组成和pH值等。
选择高质量的试剂可以提高实验结果的准确性和重复性。
2.样本处理和储存条件样本的处理和储存条件也会对ELISA结果产生影响。
样本的收集、保存和处理方法需要标准化，以确保稳定性和一致性。
如血液或组织样本的离心速度、温度和时间等要控制一致。
另外，样本的冻结和解冻过程也需要避免反复，以防止损坏细胞结构和影响实验结果。
3.特异性抗体的选择ELISA实验需要选择特异性抗体与目标抗原结合。
抗体的选择要考虑其亲和力、特异性和纯度等特性。
如果抗体不够特异性，可能会导致非特异性结合和假阳性结果。
因此，在实验中选择合适的抗体对实验结果至关重要。
4.孵育条件和时间孵育条件和时间对ELISA实验结果也起着重要影响。
这包括孵育温度、时间和摇床的震荡速度等。
不同的试剂和实验需要不同的孵育条件。
孵育温度过高或过低，孵育时间太长或太短，都可能导致结果的偏差。
5.光度计的精度和校准ELISA测量实验结果时需要使用光度计，光度计的精度和校准对结果的准确性和可重复性至关重要。
定期检查和校准光度计以确保其准确性，并遵循使用指南来保持恒定的测量条件。
6.数据分析和计算ELISA实验得到的数据需要进行合理的分析和计算。
如对标准曲线进行拟合和计算待测样品的浓度等。
合理的统计分析和数据处理能够提高实验结果的可靠性。
ELISA测定注意事项
【摘要】分析基层中心血站实验室手工操作ELISA时，影响检测结果的相关因素。
分别对用于临床ELISA测定标本收集、试剂准备，加样、温育时间与温度控制，洗板，以OPD 和TMB为底物的显色，比色测定及报告结果和准确解释行问题进行探讨。
对受血者和献血者采用ELISA定性和定量测定操作简便可行。
【关键词】酶联免疫吸附试验献血质量控制在血站质量管理工作中，检测试剂质量优劣直接影响到临床用血安全和血液检测的准确率。
基层中心血站实验室ELISA测定现通常采用手工操作,以微孔板条为固相的测定模式。
任何一个步骤处理不当都会影响测定结果，因此最大限度地保证检测结果的可靠及输血的安全就显得十分重要。
1 临床标本的收集和保存用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆）其次为唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。
血清标本测定的标志物为传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、特种蛋白时，在处理和保存方面要考虑以下几个方面：1）要注意避免出现严重溶血。
血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，故在以HRP为标记酶的ELISA 测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色［1］。
2）样本的采集及血清分离中要注意避免细菌污染。
细菌生长分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；此外一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。
3）血清标本如是以无菌操作分离，则可在2～8℃下保存1周。
如为有菌操作，则建议冰冻保存。
样本的长时间保存应在- 70℃以下。
4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。
标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。
此外冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。
5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。
elisa 标准品
elisa 标准品
Elisa 标准品。
Elisa 标准品是一种用于生物化学实验的常用试剂，它可以帮助科研人员进行蛋白质、抗体、细胞因子等生物分子的定量检测。
Elisa 标准品的质量对实验结果具有重要影响，因此选择合适的标准品对于实验的准确性和可靠性至关重要。
首先，选择合适的 Elisa 标准品需要考虑其纯度和稳定性。
纯度高的标准品可以减少实验中的非特异性反应，保证实验结果的准确性；而稳定性则可以确保标准品在长期存储和使用过程中不发生降解，从而保持其浓度和活性不变。
其次，Elisa 标准品的来源也是需要重点考虑的因素。
优质的标准品通常来自于正规的生物试剂公司或者有良好口碑的生物化学实验室，这些来源可以保证标准品的可追溯性和可靠性，降低了使用过程中的风险。
在实际使用 Elisa 标准品的过程中，科研人员需要严格按照操作手册中的说明进行操作，避免操作失误导致实验结果的偏差。
同时，定期检查标准品的保存条件和有效期，确保标准品的质量不受影响。
除了以上提到的因素，科研人员在选择 Elisa 标准品时还需要考虑实验的具体要求和样品特性，以及实验室的设备和条件等因素。
综合考虑这些因素，选择合适的 Elisa 标准品才能保证实验结果的准确性和可靠性。
总之，Elisa 标准品在生物化学实验中扮演着至关重要的角色，选择合适的标准品对于实验结果的准确性和可靠性具有重要影响。
科研人员在选择和使用 Elisa 标准品时需要充分考虑标准品的质量、来源、操作规范等因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文对于 Elisa 标准品的选择和使用能够给科研人员提供一些参考和帮助。
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种实验室常用的检测方法，广泛应用于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。
与其他基于抗体的检测方法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和非特异性相互作用的分离，并可通过最终有色产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。
ELISA 实验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以及组织裂解物等为样品。
该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。
根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测方法。
该实验可迅速分析大量平行样品，在基础研究和临床诊断实践中广泛使用。
一、直接ELISA原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。
缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高。
二、间接法ELISA原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗；不直标一抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使用标记抗体更少。
缺点：交叉反应几率升高。
三、双抗夹心法ELISA原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。
医学免疫学检验-讨论问题参考答案
TRUST试验讨论问题参考答案1.TRUST试验中VDRL抗原包含哪些成分？各起什么作用？心磷脂：与反应素结合；卵磷脂：加强心磷脂的抗原性；胆固醇：增强抗原的敏感性。
三者按适当比例配制的乙醇溶液。
EDTA防止抗原变性（半年内），氯化胆碱灭活待检血清中补体。
2.什么是反应素，反应素是如何产生的？其有什么免疫学特性？反应素为抗类脂质（心磷脂）抗原的抗体。
由螺旋体本身释放的脂蛋白样物质和心磷脂或病损细胞释放的类脂诱导产生。
非特异性抗体，具有广泛的交叉反应性，可与200多种抗原反应。
3.TRUST试验阳性，即患者血清中检出反应素就能诊断为梅毒吗？为什么？TRUST试验阳性不能确诊为梅毒。
TRUST试验检测的反应素为梅毒螺旋体非特异性抗体，除梅毒外，自身免疫病（SLE、RA、SS等）、恶性肿瘤、动静脉血栓、心血管病、妊娠、反复流产、疟疾、结核、麻风、HIV感染、其它性传播疾病、其它螺旋体感染、多种皮肤病、发热疾病、多次输血、新近免疫接种、静脉注射毒品者等有一定的阳性率（生物学假阳性），但反应素效价通常＜1:8，生物学假阳性反应中约2/3在6个月或更短时间内消失。
反应素阳性需结合临床综合考虑才能作出诊断。
一期梅毒初发时反应素阳性率70%～90%（很多患者初次测定反应素可能为阴性，间隔2周后再测定）；二期梅毒患者阳性率可达100%；晚期梅毒患者阳性率显著下降，为40%～95%。
4.TRUST试验阳性，为什么还要进一步做TPPA试验？TRUST试验检测的反应素为梅毒螺旋体的非特异性抗体，在低危人群筛查时假阳性率较高，故阳性结果需用密螺旋体抗体实验（如TPPA等）确认。
ELISA检测HBsAg讨论问题参考答案1.请从测定操作方面讨论ELISA试验结果的影响因素。
①标本采集与保存：溶血、长菌、贮存时间过长、血凝固不全、反复冻融等；②试剂准备：用前将试剂盒平衡至室温；③仪器设备：加样枪、酶标仪、洗板机、保温箱和温度计等性能、质量、校准和准确性；④加血清标本及试剂：加到孔底，不可太快、溅出和产生气泡；⑤温育：温度和时间要准确、足够；⑥洗板：用试剂盒内配的洗涤液，洗涤液加满，洗涤次数和每次洗涤的浸泡时间要够，拍干；⑦显色：温度和时间要准确、足够；⑧终止反应：酶标仪比色，必须加终止剂，终止酶促反应和转换吸收峰；⑨结果判断：以试剂盒说明书为准；⑩酶标仪比色：最好用双波长法，并在仪器设定时不设空白。
Elisa影响因素及措施整理
一、①一般检测试剂盒或检测试剂从冷藏或冷冻状态拿到室温使用需先在室温下平衡30 ~60 min，各试剂在使用前充分混匀。
②酶标仪测定结果，准确性决定于ELISA板底的平整与透明度、酶标仪的质量和软件的算法。
二、操作不当导致1、加样多、操作持续时间长，尤其是环境温度高时会导致个板孔间反应进程差异；2、除包被外，都宜采取45°加样，且要避免加到侧壁上；3、加样器不稳定、枪头不均一、试剂溅出、操作习惯不好等造成空间加样量不均一会对结果造成较大影响。
4、孵育时间过长，会导致非特异性反应增强；5、显色和终止加液时应避免气泡产生，以免影响检测读数；6、酶标板不宜叠放以减少受热不均，可采取水浴；7、贴密封膜，防止污物浸入和液体蒸发。
8、Elisa 实验用的各试剂都要妥善配置和保存、避免污染，不合格的蒸馏水都可导致空白值或背景值升高。
三、检测样品处理不当引起溶血或污染1、血清或血浆标本分离不好或发生溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色；2、待检标本污染，菌体中可能含有内源性HRP也会产生假阳性反应；3、在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA 测定中会导致本底过深、造成假阳性；4、标本凝固不完全：血液通常在采集后半小时后开始凝固，18〜24h完全凝固。
如果在血液未凝固时即离心分离血清，则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。
为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。
5、标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，30使抗体效价跌落从而引起假阴性结果，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冻存。
此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩，分布不均，因此重新融解的标本必须混匀，但不要进行剧烈振荡，反复颠倒即可，产生泡沫或样品的过度混合将引起血清蛋白的变性。
ELISA检测的注意事项
温浴影响，在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原 抗体 反应一般 在 37℃经 1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸 或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度 和时间应按规定力求准确。由于公司的 试剂 盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值 偏高或花板。另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质 控放在非边缘位置。96 孔酶标板结构特别;易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温 度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异;干浴与 水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜， 防止污物浸入。
基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或 酵 母 菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：
a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个 氨基酸;而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。
b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使 试剂 盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原 的 试剂 盒效期只有 3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。
国内乙肝两对半试剂厂家较多;不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料 显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为 89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。有的 厂家酶标板孔间 A 值差大于 15%;标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必 然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。
elisa结果影响因素
ELISA实验原理
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性
抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后， 仍然能保持其免疫学活性并能相互特异性结合。
抗原抗体复合物与酶标二抗结合， 加入合适的底物，在酶的作用下显色， 颜色深浅与特异性抗体成比例关系， 可进行定性和定量分析。
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ELISA检测方法
结果影响因素——试剂因素
试剂的选择
试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。不同厂家的试剂在 使用效果上存在差异。要选购知名度相对高、信誉可靠的试剂。
重视试剂质量同时有效地进行室内质控以及参加室间质量评价。 特别是室间质评可以发现实验本身不易发现的不准确性，了解各实验 室之间结果的差异， 帮助校正使结果具有可比性。
间接法和夹心法ELSIA
竞争法ELISA
（阳性孔呈色深于阴性孔 ) （阳性孔呈色浅于阴性孔）
1.定性结果可以用肉眼判定 1.阳性判定值法
2.阳性判定值
2. 抑制率法
3.标本/阴性对照比值
3.不可用肉眼判断
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结果影响因素
ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体 测定。但测定中影响因素较多，而且其操作中 有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应 外，有时会出现一些错误结果。引起错误结果 的原因主要有：1、标本因素 2、试剂因素 3、 操作因素 4、环境因素。
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结果影响因素——标本因素
标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物 质所致，分为内源性物质和外源性物质两种。
内源性物质
类风湿因子 补体
嗜异性抗体 自身抗体
医源性诱导的抗体
交叉反应物
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外源性物质
ELISA检测技术
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ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。
本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。
4.1 标本的采取和保存可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。
有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。
大部分ELISA检测均以血清为标本。
血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。
制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。
除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。
在ELISA中血浆和血清可同等应用。
血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。
如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。
一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。
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经验交流
影响细胞 !"#$% 结果的主要因素 &’( )*+,- .*/0,-1 23.45(3/236 0’( -(1540 ,. /(44 !"#$%
李蓉芬， 陈 敏， 康运生， 钟小林， 何凤田
（第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室， 重庆 <111;3） 温） ， 1 2 964 的戊二醛较 <4 的多聚甲醛的固定效果好。
:
细胞内源性过氧化物酶的检测和去除
对固定过的细胞， 直接加入邻苯二胺 （/C[） 底物显色， 观察 内源性过氧化物酶的情况。对内源性过氧化物酶水平很低的 细胞无需进行内源性过氧化物酶的处理， 而对内源性过氧化物 酶水平较高的细胞则需用甲醇配制的 1 2 ;4 双氧水于室温下作 用 ;1 .$- 予以去除。
作者简介： 李蓉芬 （8?7; @ ） ， 女， 安徽省宿州市人， 硕士， 实验师， 主要从事蛋 白酶体的结构与功能方面的研究， 发表论文 3 篇。电 话： （ 19; ） 73:69978 万方数据 收稿日期： 修回日期： 9111L89L16； 9118L19L83
我们使用 C=0 配制的 814 小牛血清、 94 牛血清白蛋白、 结 64 绵羊血清、 64 市售脱脂奶粉等几种不同试剂进行封闭， 果以 64 脱脂奶粉的封闭效果最好。
参考文献：
［!］ -2345 . 6，7489: 7 1，;2<=> ? @， !" #$ " .:A4B9C4=> A9 :=DE9B32>A9F2 ［ L］ G=33> 4: E5=DF2A94C 2EA5E4A4>： 2 H9A=:A423 F2EI=E J9E :=DE9H2A5K " M34: *8H （!） ： (###， !N (O ’ O# " /5=DF2A93， ［(］ +4D P，QDE39 @，R9:SQE2J=:>A=4: T" M=33S*+,-. D>4:U B=A2SU232GA9>4C2>= ［ L］ （! ’ (） ： G9:VDU2A=C 2:A4B9C4=> " L ,FFD:93 6=A59C>， (###， (O) !&O ’ !0W " ［O］ +== L M，M=R2339> . 6，72==F .，!" #$ " ;=A=GA49: 9J 2:A4SG939: 2:A4B9C4=> ［ L］ 4: 4:J32FF2A9EK B9<=3 C4>=2>= D>4:U 5DF2: GD3ADE=C G939:4G G=33> " QDA， （(） ： !XXX， )) !X0 ’ (#( "
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应设多孔重复
尽管采取了上述措施， 但有时无法确保每孔的细胞数完全 一致， 也不能保证细胞 !##$ 均匀铺于孔底， 故无论是对照孔， 还是实验孔， 都应设 ) % & 个复孔， 取其结果平均值， 从而最大 限度消除系统误差。 影响因素较多， 综上所述， 细胞 *+,-. 与常规 *+,-. 相比， 操作过程中应多加注意。 关键词：细胞； 酶联免疫吸附试验； 影响因素 万方数据 文献标识码：1 中图法分类号：/))0 " 0!
3.学位论文 荆结线 卵巢癌患者CD4+CD25+调节性T细胞的测定以及与细胞因子关系的研究 2007
目的：探讨卵巢癌患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞在CD4+T细胞的分布，分析CD4+CD25+调节性T细胞、CD44与卵巢癌患者临床病理学特征的关系；研究 CD4+CD25+调节性T细胞与Th1、Th2类细胞因子、CD44、CA199、CA125的相关性。 方法：流式细胞仪测定53例卵巢癌患者、44例卵巢良性疾患、45例健康人外周血CD4+CD25+调节性T细胞、CD44的比例；Th1类细胞因子白介素-2(IL-2)、 γ-干扰素(INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；Th2类细胞因子白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)的水平；采用酶联免疫吸附试验 (ELISA)法检测卵巢癌患者血清中的CA199、CA125的水平。 结果：(一)：卵巢癌患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(21.95±6.80)％、CD44的比例(128.45±34.72)％明显高于卵巢良性疾患(12.57±5.12)％、 (83.75±19.49)％和健康对照组(10.77±3.02)％、(79.92±21.83)％，(均P<0.001)良性疾患与健康对照组无差异；手术前的卵巢癌患者CD4+CD25+调节性T细 胞(21.95±6.80)％、CD44比例(128.45±34.72)％明显高于手术后的患者(16.41±5.84)％、(103.41±37.25)％，(均P<0.001)。 (二)：CD4+CD25+调节性T细胞、CD44与患者的年龄、职业没有关系；卵巢浆液性腺癌CD4+CD25+调节性T细胞为(23.58±7.08)％，明显高于混合性 (18.30±5.46)％，有统计学意义(P<0.05)；与黏液性腺癌(22.06±6.08)％无差异；Ⅳ期卵巢癌患者CD4+CD25+调节性T细胞比值(28.79±4.26)％、CD44比值 (157.24±33.57)％明显高于Ⅲ期(20.01±6.27)％、(124.31±29.46)％和Ⅰ-Ⅱ期患者(17.97±4.50)％、(116.08±30.93)％，(均P<0.001)；Ⅲ期与Ⅰ-Ⅱ期 之间无差异；CD4+CD25+调节性T细胞、CD44与肿瘤的浸润(23.61±6.52)％、(143.38+35.11)％；淋巴结转移(24.05±6.74)％、(146.32±35.87)％；腹水的形 成(24.06±6.73)％、(146.52±35.86)％有关，(P<0.05～P<0.001)；低分化的卵巢癌患者CD4+CD25+调节性T细胞(25.05±5.96)％、CD44(152.50±32.49)％与 高分化患者(16.03±0.80)％、(105.95±15.43)％比较，有统计学意义，(P<0.05)，而与中分化(21.82±6.53)％、(126.26±36.00)％比较无差异。 (三)：卵巢癌患者Th1类细胞因子IL-2、TNF-a、IFN-r的水平(0.87±0.25)pg/ml、(1.09±0.34)pg/ml、(7.56±2.25)pg/ml明显低于健康对照 (2.38±1.09)pg/ml、(3.28±1.36)pg/ml、(19.04±4.59)pg/ml，(均P>0.001)。而Th2类细胞因子IL-6的水平(86.28±55.92)pg/ml与对照组 (5.04±2.69)pg/ml比较显著升高，(P<0.001)，IL-4(4.86±2.94)pg/ml、IL-10(1.07±2.30)pg/ml与健康人(5.62±3.59)pg/ml、(4.46±2.31)pg/ml之间无差 异。通过nonparametric相关分析，卵巢癌患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞与IL-2、TNF-a、IFN-r存在负相关，相关系数分别为r=-0.658，P<0.05：r=0.591，P<0.05;r=-0.695，P<0.05。与Th2类细胞因子IL-6存在正相关，相关系数r=0.784，P<0.001。 (四)：卵巢癌患者CD4+CD25+调节性T细胞与CD44、CA125之间存在着正相关，分别r=0.406，P<0.05； r=0.563，P<0.001；而与CA199之间没有相关性 ，r=0.036，P>0.05。 结论：(一)：卵巢癌患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞、Th2类细胞因子增高、Th1类细胞因子降低，这可能是卵巢癌患者免疫功能下降的一个重要原因。 (二)：CD4+CD25+调节性T细胞、CD44比例与肿瘤的分期、组织学类型、分化程度、浸润、淋巴结转移、腹水的形成有关。 (三)：卵巢癌患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞与Th1类细胞因子之间存在着负相关，而与Th2类细胞因子之间存在正相关。CD4+CD25+调节性T细胞可能通 过Th1、Th2类细胞因子的调节发挥对效应性T细胞的抑制作用。 (四)：同步检测卵巢癌患者血清CA125及细胞黏附因子CD44以及与卵巢癌和细胞免疫功能有关的细胞因子水平，这不仅从肿瘤细胞产生癌蛋白水平上可以判 断肿瘤的恶性程度及发展特征，还可以从机体的免疫状态上了解肿瘤的发展状况。对疾病的控制，治疗方案的制定有重要的意义。
相似文献(10条) 1.期刊论文 朱晴晖 细胞-酶联免疫吸附试验及其应用 -检验医学2006,21(z1)
酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)问世数十年来,广泛应用于检测各种体液中的可溶性抗原或抗体.在传统的ELISA中,微孔板 上包被的是可溶性的抗体或抗原,然而在免疫学研究和临床检测时,需要了解免疫活性细胞表面表达的特定分子以对细胞特性进行认定和分类,亦需测定抗某种细 胞的抗体或评价某种细胞的功能,因而传统的ELISA中的包被物或受检物就要被替代,检测模式有所改变.1971年,Avrameas等[1]首次用酶标记抗体定量测定细胞 表面的免疫球蛋白,又经数年的发展,形成了以细胞包被酶标板测定细胞表面特定分子的细胞-ELISA.近年来细胞-ELISA衍生出多种模式(方法),并筛选出适合细 胞-ELISA的标记酶.目前已有多种成熟的细胞-ELISA的模式,并在检验医学中得到应用.