ELISA测定中影响因素简析
影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法
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问题4：质控品灵敏度偏高 。
处理意见：卫生部临检中心的质控品存在 批间批内差异。 实验室相关条件改变导致质控变化，
看阳性对照品是否有明显变化。
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问题5：多次实验灵敏度一直偏低。 处理意见：A保存环境不规范。
B孵箱温度不足。 C温育时间不足。
(3)孵育过程中出现的问题
1.温箱孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释 液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底； 2.孵育时间人为延长，导致非特异性结合，难 以清洗彻底。 3.孵育时温度不符合说明书的规定范围。
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(4)洗板过程中易出现的几点情况
1.采用手工洗板,孔与孔之间液体容易交叉，切 不可随意洗板。
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处理意见：D假阳性标本表现在临界值附近较 多，通常与当时实验的水平有关， 注意检查实验条件的波动 。 E避免加样时间过长 。 F由于试剂盒灵敏度过高而造成
临 床假阳性偏高的结果。
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问题8：多次实验重复性差。 处理意见：A加样后充分混均。
B尽可能使用同一加样器，装紧 枪头。
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问题6：单次实验中出现假阳性 处理意见：注意实验过程中的影响因素，特
别是实验中的洗板应设置浸泡 30---60秒时间。
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问题7：临床实验中出现假阳性偏高。
处理意见：A注意检查洗涤液中结晶部份是否 完全溶解。
B注意检查实验中所使用的仪器设 备是否定期校准 。
C注意检查实验中所用的板、酶标 试剂的批号是否相同，不同批号 试剂不得混用。
ELISA试剂盒试验的影响因素
ELISA试剂盒试验的影响因素
ELISA试剂盒，即酶联免疫法。
ELISA法具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点，并具有操作简便、无放射性危害的优点，因而多年来广泛应用于各高校、医院、血站和科研机构的实验室中。
影响ELISA实验的因素：
我们技术人员通过几年的实验观察，认为影响ELISA实验的因素有如下三方面：
一、试剂盒
1、抗原、抗体活性对效价的影响：主要是试剂中抗体（或抗原）的效价降低或失活，结果不易判断。
再有ELISA试剂盒灵敏度高，对杂质的反应灵敏度也高，实验中空白对照OD值偏高或假阳性；
2、酶结合物浓度过高，也会导致OD值假性增高。
二、试验仪器
1、加样器是否经过校正，酶免测定血清用血量很少，如手工加样器的性能不好，吸取样品不，会使结果忽高忽低；
2、每次洗板前，应检查洗板机针孔有无堵塞。
三、操作
1、检测前先将试剂盒从冰箱取出置室温平衡20min后使用，试剂用完及时放回冰箱冷藏，以免造成试验结果假性降低；
2、加样时注意勿触及包被板底部，以免擦伤包被物使抗体（抗原）脱落而影响实验结果的准确性；
3、洗涤不充分，会使结果假性增高，过分洗涤呈假阴性；
4、比色时应保持包被孔底部无异物、无水汽，特别是冬季板从37℃水浴箱取出时，底部留有水汽，应将板底擦干后进行比色，水汽或孔内气泡也会使OD值升高；
5、抗原与抗体反应达到平衡，依赖于温度与时间。
温度高于45℃易引起失活及标记物脱落，温度低于4℃，影响反应速度。
总之，由于ELISA试剂盒实验的影响因素较多，在实际工作中操作规范、仔细，避免和排除各种因素的影响，使之得到准确可靠的检验结果。
临床ELISA检验影响因素解读
六、显色
在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA 试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底 物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物， 则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配 制。一般商品试剂盒显色反应条件为37℃ 或室温反应15～30分钟。从理论上说， 37℃30分钟才可以使HRP的底物催化反应 完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份 催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样 本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应 25～30分钟后，终止反应比色测定。
（3）“边缘效应”的排除。以前在使用96孔板的 ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显 色较中心孔深，产生这种“边缘效应”的原因可能 为96孔板周孔与中心孔表面或热力学特征的不同。 但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原 因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的 常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右） 置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之 间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反 应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育 温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效 应”，并且可提高测定的重复性。
（1）比色测定时，一定要注意酶 标仪的波长是否已调至合适或所用 滤光片是否正确。由于有的临床实 验室在进行ELISA测定时，以TMB 为底物和以OPD为底物的试剂盒均 有使用，而前者比色波长为450nm， 后者为492nm，滤光片需根据要求 随时更换。因此，容易或双波长比色选择的问题。中档以上的酶标仪基本上都同时具 有单波长和双波长比色功能。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最 大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏 感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度 测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏 物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测 定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。 最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值 的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特 异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点，一般不 必设空白孔。如在使用双波长比色时，仍设空白孔，就可能会造成前面提到 的测定孔吸光度为负数的现象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收 上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同 均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双 波长比色。
影响ELISA实验因素阐述
影响ELISA试验因素叙述酶联免疫吸附试验（Enzyme—Linked ImmunosorbentAssays,ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到快速的发展和广泛应用。
尽管早期的ELISA由于特异性不足高而阻碍了其在实际中应用的步调，但随着方法的不绝改进、料子的不绝更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便应用和标准化，从而使其成为广泛应用的检测方法之一、基本原理：ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会转变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，显现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
一、试剂的影响因素：应选用有国家批准文号，质量靠得住的产品，不能图便宜，忽视质量保证。
试剂应妥当保管于4℃冰箱内，在使用时先平衡至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。
试剂开启后要在一周内用完，剩余的试剂下次用时应先检查是否变质，显色剂如被污染变色将造成全部显色，导致错误结果。
过期的试剂不宜再用，若别无选择，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。
二、影响因素：酶联免疫（ELISA）是目前检验科常用的免疫学检测方法之一，其操作简单，无须特殊设备，使其在各级医院都有应用。
但是，假如忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性，因此，了解影响试验的因素，减少过错事故的发生是极其必需的。
ELISA检测的影响因素的分析
ELISA检测的影响因素的分析【关键词】 ELISA检测；影响因素；分析ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。
Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为“enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)”。
由于ELISA方法灵敏，特异性强不需要特殊设备，所以被广泛应用于各种抗原和抗体测定［1］。
如乙肝、丙肝抗体等等。
但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。
本文就ELISA检测的影响因素做如下讨论。
1 标本的影响1.1 溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性可能是溶血血清中含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使H2O2释放出原生态氧(O)，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，即显蓝色，产生假阳性［2］。
所以严重溶血标本禁用。
1.2 标本受细菌污染因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。
1.3 标本保存不当在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5 d内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。
1.4 塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性最好使用真空采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。
1.5 标本凝固不全在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。
Elisa影响因素及措施整理
一、①一般检测试剂盒或检测试剂从冷藏或冷冻状态拿到室温使用需先在室温下平衡30~60 min，各试剂在使用前充分混匀。
②酶标仪测定结果，准确性决定于ELISA板底的平整与透明度、酶标仪的质量和软件的算法。
二、操作不当导致1、加样多、操作持续时间长，尤其是环境温度高时会导致个板孔间反应进程差异；2、除包被外，都宜采取45°加样，且要避免加到侧壁上；3、加样器不稳定、枪头不均一、试剂溅出、操作习惯不好等造成空间加样量不均一会对结果造成较大影响。
4、孵育时间过长，会导致非特异性反应增强；5、显色和终止加液时应避免气泡产生，以免影响检测读数；6、酶标板不宜叠放以减少受热不均，可采取水浴；7、贴密封膜，防止污物浸入和液体蒸发。
8、Elisa实验用的各试剂都要妥善配置和保存、避免污染，不合格的蒸馏水都可导致空白值或背景值升高。
三、检测样品处理不当引起溶血或污染1、血清或血浆标本分离不好或发生溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色；2、待检标本污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；3、在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；4、标本凝固不完全：血液通常在采集后半小时后开始凝固，18～24h完全凝固。
如果在血液未凝固时即离心分离血清，则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。
为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。
5、标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，使抗体效价跌落从而引起假阴性结果，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冻存。
此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩，分布不均，因此重新融解的标本必须混匀，但不要进行剧烈振荡，反复颠倒即可，产生泡沫或样品的过度混合将引起血清蛋白的变性。
浅谈ELISA的影响因素
浅谈ELISA的影响因素ELISA即酶联免疫吸附试验,ELISA是一种敏感性高、重复性好的固相酶联免疫测定广泛用于各种抗原抗体的检测,但影响因素较多,有时易出现假阳性或假阴性,本文重点针对内源性、外源性因素对ELISA测定结果的影响进行探讨。
标签：酶联免疫吸附试验(ELISA);测定结果;影响因素如今病毒性疾病的诊断主要依赖对其抗原、抗体的检测。
而检测方法大多采用酶联免疫吸附试验(ELISA),如何保证实验结果的准确性,现结合自己的实际工作经验,总结了下列影响因素,希望对检验工作者有所帮助。
1内源性干扰因素1.1类风湿因子(RF)在类风湿患者、其他自身免疫性疾病及正常人的血清中,常含有较高或不同浓度的RF,RF一般为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。
用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可以充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。
1.2补体补体易激活C1q起到铰链作用,结果易出现假阳性。
1.3嗜异性抗体人类血清中含有天然的嗜异性抗体,将ELISA系统中一抗和二抗连接起来,造成假阳性。
1.4自身抗体由于B细胞的超反应性,患者血清中常出现一些自身抗体,能与靶抗原结合形成复合物。
1.5溶菌酶可致假阳性。
2外源性干扰因素2.1标本溶血,分离不完全、加有血球。
2.2标本被细菌污染。
2.3标本储存时间过长。
2.4标本凝固不全。
2.5冰冻保存标本反复冻融。
2.6试剂在室温下平衡<30分钟,配洗液的水不符合要求。
2.7加样速度过快,加样时加在孔壁上或产生气泡。
2.8温育时关键因素之一,尽量选择温度低的,温育时间长的试剂盒。
2.9洗涤要彻底。
2.10双波长比色可减少容器上的划痕和指印等造成的光干扰。
2.11试剂质量的影响。
选用高质量的试剂是保证结果准确的关键因素之一。
3高值鉤状效应(HOOK效应)在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时出现钩状效应。
过量抗原分别和固相抗体和酶标抗体结合,而不再形成“夹心复合物”类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常规法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应,因为标准曲线到达高峰后钩状弯落。
影响ELISA试验结果操作的因素总结
影响ELISA试验结果操作的因素总结操作的影响因素酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是一种特别的试剂分析方法，在免疫酶技术的基础上进展起来的一种新型的免疫测定技术，其试剂易于保存、结果推断较为客观，是目前试验室检测抗原抗体*经济、*普遍的试验诊断方法。
影响ELISA试验结果操作的因素总结如下：1 、试剂的预备试剂的质量如抗原抗体的纯度及亲和力、标记物的比活性、滴度及特异性等直接影响检测结果，为保证检测质量，全部试剂必需经国家食品药品监督管理总局注册批准、批检测合格，临床评估特异性、敏感性、稳定性较高且在有效期内才有使用价值。
不同厂家试剂敏感性、特异性不尽相同，有报道不同厂家酶标板孔间 A 值差大小可达 15%，标记酶的活性及显色液的稳定性也相差较大，所以合理有效的试剂选择尤为重要，对 ELISA 试剂盒应正确选择，定期评价并建立科学的接收标准，结合常规血液筛查状况，对实际的均一性、适用性、稳定性，选出灵敏度、特异度及精密性合适的试剂保证检测结果的精确。
有报道不同厂家-IgG 配制成的抗 HCV-cAg 酶结合物溶液对检测结果有区分，配制抗 HCV-cAg 酶结合物溶液前应检测小鼠-IgG 与产品的适配性。
其次试剂盒的储存方式、运输条件及有效期均为影响检测结果的重要因素，试剂盒一般2~8℃冰箱保存，留意不要紧贴冰箱储存室后壁以防止试剂冻结失效，可避开使用时试剂受温差影响导致酶标板上凝集小水珠及反应消失温差而影响抗原抗体的反应。
使用前需将试剂盒放置37℃恒温箱温育30min，且不同厂家、不同批号的试剂不能混合使用。
剩余试剂应准时放入干燥剂密封保存在2~8℃冰箱，试剂打开后一周内有效，同时留意做好室内质检，确保试验结果的牢靠性。
不同方法学的检验试剂会使乙肝两对半结果消失不同，如临床操作中电化学检测 HBsAg 呈阳性，而采纳 ELISA 检测则呈阴性，此外，使用单抗或多抗试剂对检测结果同样造成肯定的影响。
酶联免疫吸附试验影响因素探讨
酶联免疫吸附试验影响因素探讨【摘要】ELISA法具有灵敏高、特异性强、重复性好的特点。
被广泛用于临床上多种疾病的检查、诊断，但在标本的采集、试剂的质量、操作的程序、结果的判断等方面受人为的因素影响较多，为了确保ELISA的准确度和精密度，保证临床安全用血，笔者就实际工作中常见的试验影响因素进行了总结探讨。
1 标本的采集1.1 防止污染血液标本的采集做到一人一针一管，吸样时，必需使用一次性移液嘴，以防污染。
1.2 及时测定血样采集后应及时检测，久置后细胞代谢，细菌繁殖，增加了许多异性物质，易产生溶血。
如不能及时测定，应将标本血清分离后放置在4℃冰箱中保存，但不超过3 d。
1.3 避免稀释标本在留取时，不能采用被保养液(抗凝剂)稀释后的抗凝血进行测定，否则被检测物的浓度降低，结果出现假阴性。
2 试剂的影响2.1 目前卫生部国家药品生物制品研究所对国内应用甚广的ELISA试剂，按照国家标准实行“批批检”，凡合格者，贴上国家防伪标签才能使用。
如HBsAg、抗,HCV、抗,HIV抗体等。
2.2 不同批号、不同厂家的试剂，由于酶标记物中酶的浓度不尽相同，与固相载体上的相应抗原或抗体发生特异性反应的程度不同，故不能混合使用。
对于超过有效期的试剂则严禁使用。
2.3 试剂的运输、贮存要在低温(2～8℃)条件下进行。
因酶类物质是一种特殊的蛋白质，久置、反复冻融或受热后，酶易失去活性，合格试纸条如果一次用不完时，应进行密封保存防止受潮。
3 操作的要求3.1 不同厂家生产的试剂其样品加入量、水浴时间、阴阳对照等各不相同，应严格按照说明书中要求进行，吸样要准确，试剂加入的顺序不能颠倒，每一步加样后均需在振荡器上充分混匀。
3.2 洗涤的效果直接影响实验结果的准确性。
每次洗板之前要配制新鲜的洗涤液，室温较低时，洗涤液要在水浴箱中先预温30 min。
用洗板机进行洗板时，每次都要吸净孔内洗液且不能留有气泡，倾去洗液时，必需用吸水纸吸尽洗液。
10-ELISA结果影响因素汇总
结果影响因素——操作因素
钩状效应：即HOOK效应,是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性
的现象，其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。
曲线的高峰部分是抗原 抗体分子比例合适的范围， 称为抗原抗体反应的等价 带(zone of equivalence)。 在此范围内，抗原抗体充 分结合，形成的沉淀物最 多，表明抗原与抗体浓度 的比例最为合适，称为最 适比(optimalratio)。
（5）标本管中添加物质的影响
抗凝剂（如肝素，EDTA）、酶抑制剂（如NaN3可抑制ELISA系统中辣根 过氧化物酶活性）及分离胶等均对ELISA测定有一定干扰作用。
结果影响因素——标本因素
表 1 内外源物质的干扰
[1].许斌等.ELISA检测HBsAg影响因素的探讨. 临床检验杂志.2000.VoI.18.No.4
结果影响因素——操作因素
特点：不易发现
正常情况下的双抗体夹心法ELISA反应
对结果的影响： 强阳性 → 假阴性
解决方法：标本稀释
一步法抗原过量时出现钩状效应
结果影响因素——操作因素
表2 不同血清稀释度下的S/OD值（OD值为0.105）
项目
标本1 标本2
原倍
0.92 0.63
1:2
3.77 2.59
（2）标本受细菌污染
菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，同溶血标本一样，可产生非特 异性显色而干扰测定结果。
（3）标本保存不当
标本放置时间过长（一天以上），会使抗原或抗体免疫活性减弱，亦可 出现假阴性。 冰箱中久存的标本，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成 二聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至 假阳性；为克服上述 干扰，ELISA测定的血清 标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5天内测定的 血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标 本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔， 不可强烈振荡。
酶联免疫吸附试验的影响因素
酶联免疫吸附试验的影响因素酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
它的原理是通过特异性抗体与抗原结合，再利用酶标记的二抗介导的颜色反应，来定量分析和检测目标物质。
在进行ELISA实验时，有多个因素会对实验结果产生影响，下面将详细介绍其中的几个主要影响因素。
1.试剂的质量ELISA实验的试剂质量对实验结果至关重要。
这包括酶标记抗体和底物酶的纯度、活性，抗原或抗体的纯度和浓度，以及稀释缓冲液的组成和pH值等。
选择高质量的试剂可以提高实验结果的准确性和重复性。
2.样本处理和储存条件样本的处理和储存条件也会对ELISA结果产生影响。
样本的收集、保存和处理方法需要标准化，以确保稳定性和一致性。
如血液或组织样本的离心速度、温度和时间等要控制一致。
另外，样本的冻结和解冻过程也需要避免反复，以防止损坏细胞结构和影响实验结果。
3.特异性抗体的选择ELISA实验需要选择特异性抗体与目标抗原结合。
抗体的选择要考虑其亲和力、特异性和纯度等特性。
如果抗体不够特异性，可能会导致非特异性结合和假阳性结果。
因此，在实验中选择合适的抗体对实验结果至关重要。
4.孵育条件和时间孵育条件和时间对ELISA实验结果也起着重要影响。
这包括孵育温度、时间和摇床的震荡速度等。
不同的试剂和实验需要不同的孵育条件。
孵育温度过高或过低，孵育时间太长或太短，都可能导致结果的偏差。
5.光度计的精度和校准ELISA测量实验结果时需要使用光度计，光度计的精度和校准对结果的准确性和可重复性至关重要。
定期检查和校准光度计以确保其准确性，并遵循使用指南来保持恒定的测量条件。
6.数据分析和计算ELISA实验得到的数据需要进行合理的分析和计算。
如对标准曲线进行拟合和计算待测样品的浓度等。
合理的统计分析和数据处理能够提高实验结果的可靠性。
影响ELISA方法的因素与分析
影响ＥＬＩＳＡ方法的因素与分析摘要】酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）是２０世纪７０年代发展起来的一种检测技术，其特异性强，灵敏度高，操作简单，在医学检验有广泛的应用，为辅助临床诊断起到了积极的作用［１］。
但影响ＥＬＩＳＡ测定的因素较多，操作过程中每个环节都会对实验结果产生影响。
现对影响实验结果的常见因素进行探讨分析：【关键词】酶联免疫作用影响１标本的保存与采取ＥＬＩＳＡ检测大部分以血清为主。
常规方法采集，避免溶血，溶血标本会增加非特异性显色。
标本如有细菌污染，会产生假阳性反应，标本保存时间过长，使间接法的试剂本底加深。
不完全抗凝的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性。
２试剂的准备试剂在ＥＬＩＳＡ过程中决定着实验的成败。
洗剂是来分离游离的和结合的酶标记物的，清除残留在板孔没能与固定相抗原或抗体结合物质及非特异性吸附的干扰物质洗剂下来。
应严格按要求洗剂，洗板时各种试剂盒的洗液不要混用，洗液结晶应待其溶解后配制。
板浸泡时间为４０ｓ左右，孔内液体吸收干净，防止洗液在孔内形成气泡。
３检测过程中各环节应注意事项加样时，样本应加在板孔的底部，不要加在孔壁上部或溅出。
３．１样品少加或多加，都会引起本底增高。
结缔组织病等病症时也会引起本底升高或假阳性［２］。
另外，当溶血时，血红蛋白具有过氧化物酶的性质，可催化Ａ，Ｂ液显色而造成假阳性［３］。
３．２酶结合物的不正确加入。
加在较高的孔壁上或孔口，也会引起本底升高或假阳性。
３．３保温ＥＬＩＳＡ方法作反应时，两次抗原抗体反应一般在３７°Ｃ经１－２ｈ，产物的生成可达顶峰。
避免蒸发，板上应加盖或用塑料贴封纸盖板孔，板不宜叠放。
温育的温度和时间应力求准确。
采用水浴会造成值偏高或花板。
另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，应注意。
３．４显色和比色四基联苯胺［ＴＭＢ］，经辣根过氧化酶［ＨＲＰ］作用后，约４０ｍｉｎ显色达高峰，终止后要在３分钟之内读数，否则强阳性会变低，酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温在１５－３０°Ｃ。
浅析影响ELISA实验结果因素
保 证 反应 温 度
５ 试 剂
Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ是实 验 室检 测 抗 体最 常 用
的检测方 法 ，具有 灵敏性 高 、特 异性 强 等特点 ，不 需要 特殊仪 器设 备就 可
Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 成 品 试 剂 盒 为 检 测 工 作 提
供 了方便 ，按 照说 明书进行 操作 就 可 以完 成实验 ，但 人为操 作 时候很 多 细 节也会导致实 验误差 。
３ ． １ 包被
冬 季由于室外温度较低 ．冻土层较厚 ，采 用焚烧法对动
物尸体进行无害化处理 。每次处理要进行严格 消毒 。
可 以是 血清 、全血 、唾 液 、尿 液 等 ， 但 大部 分还 是 以血清为 样 品。作 为血
检 测 的 品很多 ，根据 检测 项 目不 同
人 工洗 板 时 ，弃 去洗 涤 液时 方法
一 辽宁省 葫芦岛 市动 物疫病 预防控 制中 心
清 样 品 ，应 避 免 溶 血 ，溶 血 可 能 会 增
春 、夏 、秋 季采 用深埋 法 。根据 Ｇ Ｂ １ ６ ５ ４ ８ — ２ ０ ０ ６《 病 害
动物和病害动物产 品生物 安全处理规程》要求 ，深埋法无 害
化动物尸体应满 足以下条 件 ：远离学校 、公共 场所 、居 民住
点 ，按照每 次处理动物尸体 的多少确 定掩埋坑的大小 ，并严 格按照要求进行规范操作 ，确保处理效果达到疫病防控要求 。
头等。
酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法
酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是一种常用的实验技术，用于测定样品中特定蛋白质或抗原的浓度。
然而，在进行ELISA实验时，存在许多可能影响实验结果的因素。
本文将介绍一些常见的影响因素及如何处理这些问题。
1.样品质量：样品质量是影响ELISA实验结果的一个重要因素。
如果样品质量不合格，可能会导致错误的实验结果。
处理方法包括：-选择合适的样品储存条件，避免样品的变性、降解等问题。
-对样品进行适当的纯化和浓缩处理，以提高样品的纯度和浓度。
2.抗体选择：在ELISA实验中，正确选择适合的抗体也是非常重要的。
处理方法包括：-确保抗体的特异性和亲和力，避免与其他非特定蛋白结合。
-对抗体进行亲和纯化，以提高抗体的纯度和活性。
3.反应条件：ELISA实验中的反应条件包括温度、时间、pH等，这些条件的选择直接影响到实验结果的准确性。
处理方法包括：-对反应条件进行优化，确定最佳的温度、时间、pH等参数。
-控制反应时间，避免反应过长或过短而引起实验结果的偏差。
4.检测方法：ELISA实验中常用的检测方法有酶标记物检测、放射性同位素检测、荧光检测等。
不同的检测方法对实验结果的影响也不同。
处理方法包括：-选择合适的检测方法，根据实验的目的和需要进行选择。
-对检测方法进行优化和标准化，以提高检测的准确性和灵敏性。
5.交叉反应：ELISA实验中，样品中的其他成分可能会引起交叉反应，导致实验结果的误差。
处理方法包括：-使用对特定抗原具有高度特异性的抗体，避免与其他非特定抗原结合。
-对样品进行适当的稀释，以减少交叉反应的可能性。
6.数据分析：ELISA实验的数据分析是实验结果的重要环节。
处理方法包括：-使用适当的统计方法对实验数据进行分析，确定浓度或活性的可靠性。
-进行实验重复和平行实验，以确保实验结果的可重复性和准确性。
浅谈影响ELISA结果因素分析
浅谈影响ELISA结果因素分析ELISA法即酶联免疫吸附测定法，该方法的检测原理主要是通过待测物和酶连接，使得抗原与抗体发生特异反应，通过观察底物和酶颜色的变化得出检测结果，ELISA法根据种类和变化能够分成双抗体夹心法、间接法、竞争法以及捕获法，其中双抗体夹心法主要用于抗原的检测，间接法主要用于抗体的检测，竞争法可用于抗原与抗体的检测，捕获法则用于测定血清中某种抗体亚型的成分[1]。
酶联免疫吸附测定法具有灵敏性高以及特异性高的特点，在临床上应用十分广泛，发挥出十分积极的临床价值，然而存在诸多因素诸如试剂、标本、操作方法以及环境等方面会影响检测结果的准确性，本文主要对影响ELISA结果因素进行分析，并给出针对性的解决措施，具体信息如下。
1 试剂方面的因素ELISA法的检测结果直接受到试剂质量优劣的影响，试剂盒的生产厂家和质量、标记物的免疫活性、抗原抗体的纯度、试剂是否有效与试剂的储存方式等方面均会对ELISA法的检测结果有程度不一的影响[2]。
为避免上述情况影响检测结果的准确性，①在检测过程中需要确保ELISA 试剂盒中阴性对照的质量，从而避免假阴性与假阳性的出现；②抗原的中和必须准确滴定，防止由于抗原浓度过低或者过高影响试剂盒的敏感性而导致假阴现象的发生；③重视试剂的质量，给予完善的室内质控与定期开展室间质量评估；④根据试剂盒的开封时间与保存的状况来实施全点定标，进而保障检测结果的准确性；⑤有研究显示ELISA法的检测结果不准确很大程度上是受到试剂质量的影响，因此生产厂家必须重视试剂的质量，有必要时可通过人新鲜标本方法学来评估试剂的质量。
2 标本方面的因素实验标本对ELISA法的检测结果也具有很大的影响[3]，主要包括内源性与外源性物质干扰。
内源性物质干扰主要包括药物、嗜异性抗体、人抗动物抗体、代谢产物、类风湿因子以及补体等，然而在ELISA法的检测过程中可通过下述方法处理标本来降低内源性物质干扰：①通过将抗原结合片段取代免疫球蛋白（IgG），将结晶片段（即Fc片段）消除，这样能够很大程度降低类风湿因子、嗜异性抗体以及人抗动物抗体对检测结果的干扰；②通过热处理的手段（56℃处理30min，63℃处理10min）与应用乙二胺四乙酸（EDTA）对标本进行稀释与2一巯基乙醇对标本进行稀释，以降低补体与类风湿因子对检测结果的干扰；③在标本中添加阻断剂如10％正常人血清和1％正常动物血清；④若检查发现标本中存在血红蛋白、胆红素以及血脂等成分时，必须重新采血检查[4]。
ELISA实验的影响因素及问题分析
ELISA实验的影响因素及问题分析摘要：ELISA 实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样，温育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA 的高灵敏，强特异的优点。
因此，应建立实验项目的标准操作程序（SOP）。
关键词：ELISA；实验；影响因素；问题分析1971 年Engvall 等人把免疫组化的EIA 技术应用于临床检验发展为ELISA 技术。
其特点为灵敏度和特异性相对较高，现广泛应用于乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等的检测，现就我多年的实验经验，浅谈整个ELISA实验过程中的影响因素及问题分析。
实验前检验人员需知首先检验人员需经过培训，熟练掌握本专业如下几方面的技术知识：1、检验项目的基本原理（ELISA 原理）及临床意义2、熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点；3、熟悉检测试剂性能（包括试剂的灵敏度，特异性，精密度，稳定性，安全性等）；4、熟悉检测仪器的原理及性能；为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪），水浴箱（温箱），洗板机和酶标仪。
酶标仪应经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。
5、某些特殊项目的检测如抗HIV 等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。
标本的采集和保存1、可用作ELISA 的标本十分广泛，体液（如血清，血浆，各种积液），分泌物（如唾液）和排泻物（如粪便，尿液）均可作为标本以测定其中的抗原或抗体成份，一般使用血清。
2、标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果，可造成假阳性；长菌的标本同样的道理易产生假阳性。
3、抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂的抗凝血。
4、标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。
一般血清置4℃冰箱应5天内完成测试。
ELISA结果影响因素
样本保存不当
01
保存温度
样本保存的温度过高或过低，可能会影响ELISA结果。一些蛋白质成分
可能会因为温度变化而发生变性，导致其与抗原或抗体的结合能力改变。
02
保存时间
样本保存时间过长，可能会导致某些成分降解或发生变化，从而影响
ELISA结果。
03
保存介质
用于保存样本的介质，如某些化学物质或防腐剂，可能会与待检测成分
01
仪器设备故障可能导致ELISA实验 结果不准确，如加样器、洗板机 、酶标仪等出现故障，影响实验 的重复性和准确性。
02
故障可能导致加样不准确、洗板 不彻底或酶标仪读数不稳定等问 题，进而影响实验结果。
仪器设备未校准
仪器设备在使用前需要进行校准，以确保实验结果的准确性 。
未校准的仪器可能导致加样量不准确、吸光度读数偏差等问 题，进而影响ELISA结果的判定。
详细描述
实验室湿度应控制在40%-60%之间，以避免实验材料受潮或过度干燥。如果实验室湿度不稳定，可 能会导致抗体和抗原的变性，从而影响实验结果。因此，实验室应安装湿度计，并定期检查以确保湿 度的稳定性。
实验室清洁度
总结词
实验室清洁度对ELISA结果的影响不容忽视。灰尘、污渍和微生物污染可能影响实验结果，导致假阳性或假阴性。
详细描述
实验室应保持清洁，每天清洁台面、地面和仪器表面，每周进行一次全面清洁。实验操作过程中，应避免交叉污 染，使用一次性手套和实验服。此外，实验室应定期进行微生物检测，以确保环境卫生符合标准。
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加样量不准确
温育时间不足或过长
温育时间对ELISA实验结果影响较大， 温育时间不足或过长均可能导致抗原 抗体反应不充分，降低实验敏感性。
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１８６ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｊｕｎ．２００８，Ｖ０１．１５，Ｎｏ．３
・检测技巧・
ＥＬＩＳＡ测定中影响因素简析
李卫杨
（株洲市第一医院，湖南株洲４１２０００）
ＥＬＩＳＡ方法被广泛用于各种抗原和抗体测定。
但ＥＬＩＳＡ测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中如果处理不当，会出现一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。
引起ＥＬＩＳＡ测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②操作因素；③试剂因素。
本文主要就标本因素和操作因素对ＥＬＩＳＡ测定的影响做如下讨论。
１标本因素
血清是最常用的ＥＬＩＳＡ标本，血浆一般可视为与血清同等的标本。
标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性干扰物质和外源性干扰物质两种。
１．１内源性干扰物质
有人认为大约４０％的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。
常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ｉｇ（ｓ）抗体、交叉反应物质和其它物质等。
１．１．１类风湿因子人血清中ＩｇＭ、ＩｇＧ型类风湿因子（ＲＦ）可以与ＥＬＩＳＡ系统中的捕获抗体及酶标记二抗的ＦＣ段直接结合，从而导致假阳性。
解决该情况的办法是：①用Ｆ（ａｂ）２替代完整的ＩｇＧ；②标本用偶联有热变性（６３℃，１０ｍｉｎ）ＩｇＧ的固相吸附剂处理（将热变性ＩｇＧ加入到标本稀释液中同样有效）；③检测抗原时，可用２一巯基乙醇等加入到标本稀释液中，使ＲＦ降解。
１．１．２补体它能够与固相一抗，标记二抗Ｆｅ结合或影响它们的结合而造成假阳性。
解决的办法是：①用ＥＤＴＡ稀释标本；②用５６℃，３０ｍｉｎ加
收稿日期：２００７—１１—１５；修回日期：２００７－１２－２０热血清使Ｃｌｑ灭活［１］。
１．１．３嗜异性抗体人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ｉｇ（ｓ）结合的天然嗜异性抗体，可将ＥＬＩＳＡ系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。
解决的办法是：可在标本稀释液中加入过量的动物Ｉｇ（ｓ），但加入量不足或亚类不同时无效。
１．１．４嗜靶抗原的自身抗体抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，在ＥＬＩＳＡ方法中均可干扰抗原抗体测定结果。
为避免以上情况出现，测定前需用理化方法将其解离后再测定。
１．１．５医源性诱导的抗鼠Ｉｇ（ｓ）抗体临床采用鼠源性ＣＤ３等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体；另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ｉｇ（ｓ）抗体，ＥＬＩＳＡ测定时均可产生假阳性。
解决的办法是：测定抗原时，在标本中加入足量的正常鼠Ｉｇ（ｓ），从而克服由于上述原因造成的假阳性。
１．１．６交叉反应物质类地高辛、类ＡＦＰ样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。
在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。
１．１．７标本中其它成分的影响血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等，均对ＥＬＩＳＡ测定结果有干扰作用。
１．２外源性干扰物质
外源性物质常常是由于用于ＥＬＩＳＡ测定的血标本的采集、贮存等不当所致。
如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集不全和采血管中添加物等影响口］。
万方数据
１．２．１标本溶血溶血的原因有许多，主要有体外溶血和体内溶血两种。
体外溶血可由物理因素（如机械性破坏、冰冻）、化学因素（如血样接触表面活性剂）和代谢性因素（如遗传病引起的血细胞脆性增加）引起。
体内溶血可由物理因素（人工心脏瓣膜或大血管手术后）、生物因素（如恶性疟疾）和药物毒性反应等因素引起。
由于各种标本溶血，均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白，在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使Ｈ。
０。
释放出原生态氧［ｏ］，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，在以辣根过氧化物酶为标记的ＥＬＩＳＡ测定中，会导致非特异性显色，干扰测定结果。
为克服上述干扰作用，标本采集时必须注意避免溶血。
１．２．２标本受细菌污染因菌体中可能含有内源性过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。
１．２．３标本保存不当在冰箱中保存过久的标本，血清中ＩｇＧ可聚合成多聚体，ＡＦＰ可形成二聚体，在间接法ＥＬＩＳＡ测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。
标本放置时间过长（如一天以上），有时抗原或抗体免疫活性减弱，可出现假阴性。
为克服上述干扰，ＥＬＩＳＡ测定的血清标本宜为新鲜采集。
如不能立即测定，５天内测定的血清标本可存放于４℃，１周后测定的血清标本应低温冻存。
冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。
１．２．４标本凝集不全在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下，正常血液采集后１／２～２ｈ开始凝固，１８～２４ｈ完全凝固。
临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ＥＩ。
ＩＳＡ测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果。
这类情况于次日复查时因血凝已完全，血清中不再有纤维蛋白存在，故复查结果变为阴性。
为避免上述干扰作用，解决的办法最好是血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。
１．２．５标本管中添加物质的影响抗凝剂（如肝素）、酶抑制剂（如ＮａＮ。
可抑制ＥＬＩＳＡ系统中辣根过氧化物酶活性）及快速分离血清的分离胶等均对ＥＬＩＳＡ测定有一定干扰作用。
综上所述，对
１８７
临床检验ＥＬＩＳＡ测定中出现的假阳性或假阴性结果，在考虑试剂因素和操作因素之外，更多的应从标本因素方面进行分析，并应采取相应措施排除干扰作用，从而为临床提供正确可靠的检测结果。
２操作因素
２．１温育的影响
温育是影响ＥＩ。
ＩＳＡ测定结果的关键因素。
温育时间不够，弱阳性标本检测不出；温育温度不够，弱阳性标本也难以检出。
２．２洗板的影响
洗板对ＥＬＩＳＡ测定来说也是关键步骤。
洗板分手工洗板和机器洗板，一般认为机器洗板较手工洗板效果要好，关键是洗板次数的选择。
洗板次数较少，造成残留，可引起假阳性结果；洗板次数过多，可造成抗原抗体结合物洗脱，造成假阴性结果。
２．３显色的影响
影响显色的关键是显色温度和显色时间，有些实验室操作人员不严格按说明书操作，因为担心“花板”，往往是显色时间不到就匆忙终止显色，结果造成弱阳性标本不能显色而导致假阴性发生。
２．４加样的影响
加入样品、试剂及混匀时间的差异称为操作时差。
操作时差在每个试验中都存在，尤为手工操作更著，对结果都会产生或大或小的影响。
ＥＬＩＳＡ常用项目，例如：乙肝两对半，多是成批检测。
从加第一个样本到最后一个样本，包括中间换吸管尖的工作，在这一过程中有一个时间差，加试剂及混匀也同样存在时间差，这种操作时间差会致使抗原抗体反应和酶促反应时间的不一致，而这种不一致可以直接导致误差的产生，尤其是在夏天，若不合理安排时间、尽量减少时差，将会导致假阳性或假阴性的结果出现。
ＥＩ。
ＩＳＡ检测法影响因素众多，上述只是一些常见因素分析。
要想提高ＥＬＩＳＡ检测的检测质量，关键还要加强实验室科学管理，强化标准化流程操作，加强质量控制，提高人员素质，以减少检测假阳性、假阴性结果的发生。
参考文献：
［１３曹文飞．酶联免疫测定的干扰因素与对策［Ｊ］．中国实验临床免疫学杂志，１９９８，１０（３）：６０—６３．
［２］许斌．ＥＳＬＩＡ检测ＨＢｓＡｇ影响因素的探讨［Ｊ］．临床检验杂志，２０００，１８（４）：２３２．
（张增武编辑）
万方数据。