项目抗体生产技术(任务杂交瘤细胞生

一、杂交瘤技术
流 程
（一）小鼠骨髓瘤细胞
不产生Ig的重链和轻链 HGPRT-;TK与提供淋巴细胞的动物品系相同
（二）免疫脾细胞
动 物：
BALB/c小鼠 7～12周龄 20g～25g体重
免疫小鼠
细胞性抗原： （1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次
可溶性抗原： 首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫
抗体种类：
第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody)
B淋巴细胞:寿命短,分 泌特异系性抗体 骨髓瘤细胞：寿命长 杂交瘤细胞：寿命长， 单克隆抗体
Fc结合巨噬细胞Fc受体。
二 抗体分子的功能
（1）IgG 主要免疫球蛋白，具有免疫凝集 与免疫沉淀、免疫调理、抗体依赖的细胞介 导的细胞毒作用、激活补体系统、固定细菌 和病毒等作用。
（2）IgA 分布在鼻、咽、支气管、胃肠道、 生殖器官等黏膜及分泌液中，有杀菌、抗病 毒作用。
（3）IgM 分布于血液中，具有补体激活功 能，防止发生菌血症、败血症。
株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb在其中 的比例可为10%～50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差， BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人 抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)，因此不适用于临床。
基因工程BsAb
多采用抗体分子片段,如Fab， Fv或ScFv,经基因操作修饰后,或体 外组装为BsAb,或直接表达分泌型 的BsAb。
(一)、单克隆抗体的产生
动物体内诱生方法： 每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只
体外培养法： 中空纤维培养系统 单抗含量不高，牛血清Ab难以去除
腹腔注射法
高滴度腹水
前5天进行,预先腹腔注射pristane （1～5）×106细胞 1～3w形成腹水
(二)、 单克隆抗体的纯化
(五)、噬菌体抗体库技术
定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体， 转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得 特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到 完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断 与治疗方面有其独特的优越性
1、基本原理和程序
用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因 克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面
（4）IgE 其Fc片段与肥大细胞和嗜碱性粒 细胞表面Fc受体有亲和性，因此能激活这些 细胞。
（5）IgD 防止免疫耐受方面有一定作用。
第二节 单克隆抗体
多克隆抗体：
由同一抗原产生的不同的抗体统称为多 克隆抗体。
单克隆抗体：
由单个淋巴细胞针对某一抗原决定簇产 生的单个抗体称为单克隆抗体。
饲养细胞
。
融合方法 骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)
50% PEG 1min内加完; 2min内加10ml培养液
细胞融合
SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～5 1ml 50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置90秒, 时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用 根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔 细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7天，换用HT培养液
细胞冷冻的意义
防止污染 避免染色体丢失 防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡
二、 单克隆抗体的制备
经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤 细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞 外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而 使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还 应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制 备单克隆抗体。
可溶性抗原：ELISA抗体捕获法 细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法 （用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）
ELISA
ELISA
多头加样枪
免疫荧光法
。
McAb的纯化
盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析
(三)、单克隆抗体的性质鉴定
Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞 争抑制 法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体 40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot
(四)、单克隆抗体的特性
1、单克隆抗体的特性
高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性
2、单克隆抗体的优点与局限性
优点 ： 在体外“永久”地存活并传代 用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗 体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗
化学交联BsAb
分别分离纯化两种不同的McAb，使各抗体 解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的 单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出 目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性， 产物均一性不佳。
细胞工程BsAb
将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次
融合，产生四源杂交瘤 (quadroma)。但二次杂交瘤细胞
(二)、小分子抗体
Fab：抗原结合片断 Fv：可变区片段 ScFv：单链可变区片段 SdAb：单区抗体
小分子抗体
(三)、抗体融合蛋白 其它生物活性蛋白融合
(四)、双特异性抗体
许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原 分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿 瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗 体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别， 取得杀伤肿瘤细胞的作用。
培养骨髓瘤细胞： 选择对数生长期的细胞进行传代培养 细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞 注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存 于-80℃或液氮及干冰中
免疫脾细胞的制备： 1×108的淋巴细胞
无菌手术
饲养细胞： 细胞密度过低不利于细胞生长繁殖 常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞 其中MQ还有清除死亡细胞的作用 饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞 的纯化
HAT选择作用：
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的 主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺 乏，DNA合成的替代途径受阻
骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞
SP2/O: HGPRT- ，TK-; 长命 脾细胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命(7天) 杂交瘤细胞:HGPRT+ ，TK+; 长命
基因工程抗体(Genetic engineering antibody) 根据研究者的意图，采用基因工程方法，在
基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或 修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。 主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双 价抗体和双特异性抗体。
(一)、人源化抗体
将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在 小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生 大量完全人源化抗体
品控部：制定抗体的质量标准，生产取 样分析操作规程，质量检测标准和操作规程。
总经理：协调监督各部工作，最后拿出 完整的计划书。
3. 计划书实施。 计划书要先经过老师的审核，然后
实施。
实施过程中考核操作技能。
实施后及时进行实训报告的撰写也 总结。
抗体：是由抗原刺激机体后，由淋巴B细 胞经分化增殖的浆细胞合成、分泌的， 能与相应抗原特异结合并具有多方面免 疫功能的球蛋白。
用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。 使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。 抗体库： 组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合 人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人
第一节 抗体分子的结构与功能 一 抗体分子的结构

轻链 约210aa； 重链 约450aa。 可变区 V区，不同抗体不同； 恒定区 C区，所有抗体相同。 互补决定区 CDR区。 铰链区 重链中间含脯氨酸段。
木瓜蛋白酶处理 两个Fab片断和一个Fc片 断。
Fc片断功能： （1）激活补偿功能系统； （2）产生细胞依赖性毒素； （3）Fab区域结合一个可溶性抗原后，抗体
有限稀释法
特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法
方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞
效率最高 价格昂贵
FACS
杂交瘤细胞的冻存与复苏
配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液 (30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、 复苏
淋巴细胞
。
淋巴细胞发育
。
浆细胞
。
抗原接种
。
（三）细胞融合
培养液： RPM1640培养液 DMEM培养液
细胞融合剂：
PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞 膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的 PEG，其纯度与毒性有所不同
局限性 ： 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围 反应强度不如多克隆抗体 制备技术复杂、费时费工、价格较高
抗原要求 得量 特异性 稳定 沉淀反应 成本
McAb与PcAb的比较
McAb 可以不纯
高 高 低 无 高
PcAb 纯度高
低 低 高 有 低
McAb and PcAb
三、 基因工程抗体制备
杂交瘤细胞：
长期生长繁殖 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤 碱并最终与T一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力
二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存
有限稀释法(limiting dilution) 显微操作法(micromanipulation) FACS法（fluorescence activated cell sorter） 软琼脂平板法(soft agar method)
单克隆抗体 的生产过程：
一、 杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术Baidu Nhomakorabea理：
聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾 细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化 增殖的杂交瘤 细胞系 单克隆抗体生成：接种杂交瘤 细胞于小鼠腹腔，腹水 中即可得到高效价的单克隆抗体
任务1：杂交瘤细 胞生产抗体技术
教学安排：
1. 员工培训
由老师讲解抗体生产的理论基础及应用范 围。
分配实操任务：杂交瘤细胞培养生产抗体。
2. 学生模拟组建运营一个单抗生产企业，撰写 计划书(在理论教学期间完成)。 市场部：抗体的结构、功能、用途，抗 体市场状况与销售预测，竞争对手状况与分 析。
技术部：确定抗体生产的工艺流程及工 艺参数，编制生产操作规程，确定生产车间 的布局。
1、嵌合抗体
方法： 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定
区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人 -鼠嵌合抗体 特点：
减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力
嵌合抗体
2、改型抗体
定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补 决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具 有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。 RAb亦叫“重构型抗体”，因其主要涉及CDR的“移植”， 又可称为“CDR移植抗体 意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗
融合细胞的早期培养
10～20天出现克隆 HAT筛选 挑克隆
（四）杂交瘤细胞的选择性培养
HGPRT酶与TK酶： 次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 胸腺嘧啶核苷激酶
应用液： 8-杂氮鸟嘌呤 聚乙二醇
HAT培养基：
H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物， 阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前 体”，供细胞通过替代途径合成DNA