分子标记的实验原理及操作流程

AFLP分子标记实验

扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。

其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。

一、实验材料

采用青稞叶片提取总DNA

实验设备

1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统,

2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，

3. 美国MJ公司PCR仪,

4. 安玛西亚电泳仪等。

三、实验试剂

1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品

DNA提取试剂盒；

EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒；

Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer;

琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? • cm

2. 其他实验需要物品

微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。

四、实验流程

1、总DNA提取

使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说，100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。

2、EcoR1酶消化（20ul体系/样品

EcoR1 1ul

10 buffer 2ul 37 C 65 C 30min 终止反应 sample(总 DNA 5ul ddH 2O 12ul

3、 Mse1 酶消化 (20ul 体系 /样品

Mse1 2ul (1U/ul

10>Buffer 2ul

sample(EcoR1 酶切产物 80C 30min 终止反应 ddH 20 1ul

4、 T4 DNA Ligase(20ul 体系 /样品

T4 DNA Ligase 2ul(1U/ul

10>Buffer 2ul

sample双酶切产物10ul

Mse1 Adaptor 1ul 2265C 10min 终止反应 EcoR1 Adaptor 1ul ddH 20 4ul

5、预扩增 (20ul 体系 /样品

sample 4ul

Primer(Mse1/EcoR1 1ul

AFLP Core Mix 15ul

* AFLP Core Mix 配方：

ddH 20 13.8ul

MgCl 2 1.6ul

dNTPs（2.5mM 1.6ul

Taq 酶（1U/ul 1ul

10>Buffer 2ul

预扩增程序：

94°C 2min

94 C

56 C

72 C 2min

60 C 30mi n

&选择性扩增（20ul体系/样品

sample 4ul（预扩增产物稀释 20 倍 Primer（Mse1-XXX/EcoR1-XXX 1ul AFLP Core Mix 15ul

选择性扩增程序：

94°C 2min

94 C 20s

66C 30s每循环降1C，共10个循环72C 2min

94 C 20s

56 C 30s 20个循环

72 C 2min

60 C 30mi n

7、产物电泳检测

上样液：Loading Buffer 20ul

Size sta ndard-600 0.2ul

Sample 3ul（稀释 10 倍

四、实验结果与分析

本实验使用贝克曼库尔特（BeckmanCoulter公司CEQ8000遗传分析系统,运用

先进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验，扩增产物在高分辨率毛细管中电泳分离,采用激光激发荧光采集数据，灵敏度极高，电泳结果通过软件自动统计分析并转换成“0 T矩阵,便于对结果进一步深入分析研究，整个电泳、数据采集和数据分析过程由软件来控制完成，最大程度避免了人工操作造成的误差，提高了数据的可靠性。产物电泳数据采集在CEQ8000遗传分析系统上进行（图1，得到的数据（图2

用第三方软件再进一步统计分析。

图1 AFLP分子指纹图谱

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图2 AFLP “ 0 1”矩阵图AFLP 操作流程图:

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