山梨醇溶液(1molL,无菌)
[VIP专享]毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
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毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min 培养过夜；2. 取100-500µl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h)，至OD600 达到1.3~1.5；3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6. 按步骤3 离心，用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul；备注：可将其分装为80 µl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。
比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。
对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。
一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。
✓KM71比GS115生长的要慢。
毕赤酵母都应该是白色菌落的✓对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80o C ul/管冻存（一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。
转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。
建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下：1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀2)-20℃ 20分钟沉淀3)13200rpm，20min，离心后弃上清4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。
酵母实验文献_实验全过程1
• （选自 共表达_1_3_1_4_葡聚糖酶_省略_酿酒酵母的构建及其性能的应用研 究_鲁健章 浙江大学 博士学位 论文 P60）
酵母感受态制备
1. 将活化的NY—K菌株从平板上接入5mLYPD 液体培养基中，250rpm 30℃过 夜培养。 2. 以0.5%接种量转接至200mL YPD培养基中（为了保证足够的氧气供应，使 用1L 的三角瓶） 摇瓶过夜至1.0—1.3。 3. 3000rpm 4℃下，离心5min，离心，收集细胞沉淀，重悬于200mL冰冷的无 菌水。 4. 3000rpm 4℃下，离心5min，收集细胞沉淀，重悬于100mL冰冷的无菌水。 5. 3000rpm 4℃下，离心5min，收集细胞沉淀，重悬于8mL冰冷的1mol/L山 梨醇溶液。 6. 3000rpm 4℃下，离心5min，收集细胞沉淀，重悬于1mL冰冷的1mol/L山梨 醇溶液。分装，80μl管，即为感受态细胞。-80℃存。 (选自 多基因转化构建重组工业酿酒酵母及其在木薯酒精发酵中的应用研究_ 阳辛凤 海南大学 博士论文 P44)
（选自酿酒酵母生产白藜芦醇关键酶基因4CLcDNA的克隆与转化_王 永智 西北大学 硕士论文 P29）
• 酿酒酵母感受态的制备和转化
1. 挑取酵母 H1246 的单菌落到 10m L 的 YPD 培养基，30℃、180rpm培养 12h。 2. 使用紫外分光光度计测定上述培养物 OD600，转接到 50m L YPD 液体培 养基培养 3h，重新测定培养物的 OD600至 0.4-0.6（不得小于 0.4，否 则 影响转化效率）。 3. 2500rpm 离心菌液 5min，用 40m L 的 1×TE 重悬细胞。 4. 2500rpm 离心 5min 弃上清，加入 2m L 的 1×Li AC/0.5×TE。 5. 室温培养细胞 10min。 6. 接入 10u L 质粒（PYES2-1、PYES2-2、PYES2-3 载体）、10u L 的 10g/L的 ss DNA，上下震荡离心管 5-6 次。 7. 加入 700u L 的 1×Li AC/40%PEG-3350/1×TE，混合均匀。 8. 在 30℃下 200rpm 培养 30min。 9. 加入 88u L DMSO 混合均匀，42℃热激 7 分钟。
常用试剂培养基 毕赤酵母实验技术
主要培养基：10×YNB（13.4%酵母氮源，含硫酸铵不含氨基酸）：溶解13.4gYNB于100mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。
500×B（0.02%生物素）：溶解20mg生物素于100mL 水中，过滤除菌，放于4℃。
100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃。
10×D（20%葡萄糖）：溶解200g D-葡萄糖于1 000mL水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1年。
500×生物素(0.02%)：溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃，可放1年。
100×H（0.4%组氨酸）：溶解400mg L-组氨酸于100mL水中，低于50 度加热以促溶解，过滤除菌，可放1年。
10×M（5%甲醇）：混合5mL甲醇与95mL水，过滤除菌存于4℃，可放2个月。
10×GY（10%甘油）：混合100mL甘油与900mL 水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年以上。
100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃，可放1年。
1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0：32mL 1mol/L K2HPO4，868mL 1mol/L KH2PO4，调整pH值为6.0±0.1（如果需调pH值，用磷酸或KOH）。
过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上。
100mg/mL遗传霉素：用无菌水制备30mL 100mg/mL 遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20℃。
用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0。
LB培养基：5%酵母提取物，10%胰蛋白陈，10%NaCI，pH7.0；高压灭菌后4℃保存。
1mol 山梨醇溶液 相对密度
1mol 山梨醇溶液相对密度下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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10山梨醇检验标准操作规程
山梨醇检验标准操作规程1范围本标准建立了山梨醇的检验标准操作规程。
本标准适用于山梨醇的质量控制与检验。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，其最新版本适用于本标准。
《中华人民共和国药典》 2010版二部《微生物限度检查检验标准操作规程》编号《山梨醇质量标准》编号3职责检验人员、复核人员对实施本标准负责。
4操作规程4.1试剂与试药甘油、氯仿、乙醚、氢氧化钠试液、碘试液、酚酞指示液、氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）、磷酸溶液（1→10）、5%高锰酸钾溶液、10%焦亚硫酸钠溶液、硫酸溶液（3→4）、1%变色酸溶液、标准甲醇溶液、盐酸、高锰酸钾滴定液（0.02mol/L）、磷酸氢二钠的饱和溶液、高锰酸钾的饱和溶液、1%糠醛溶液、10%氢氧化钠溶液、0.001%丙酮溶液、95%硫酸。
4.2仪器与设备碱式滴定管、50ml具塞量筒、垂熔玻璃漏斗、温度计、水浴锅、比重瓶、蒸发皿、试管、干燥箱、恒温培养箱、比重瓶、干燥器。
4.3检验项目4.3.1性状4.3.1.1操作方法（1）取本品，在明亮光线下，用目测法观察其外观；用鼻闻和口尝其气；并依法观察其特性。
（2）将本品溶于水、乙醇、三氯甲烷或乙醚中，观察溶解情况。
(3) 比旋度取本品约5g，精密称定，置50ml量瓶中，加硼砂6.4g与水适量，振摇使完全溶解，并稀释至刻度（如溶液不澄明，应滤过），依法测定（附录Ⅵ E）。
4.3.1.2记录记录其外观、气味、特性、溶解情况，测比旋度4.3.1.3结果判断（1）本品为白色结晶性粉末；无臭，味甜；有引湿性；（2）在水中易溶，在乙醇中微溶，在三氯甲烷或乙醚中不溶；（3）比旋度为＋4.00至＋7.00。
判为符合规定。
4.3.2鉴别4.3.2.1 取本品约50mg，加水3ml溶解后，加新制的10%儿茶酚溶液3ml，摇匀，加硫酸6ml，摇匀，即显粉红色。
判为符合规定。
4.3.2.2 本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱（光谱集26图）一致。
山梨醇溶液(1molL,无菌)
北京雷根生物技术有限公司
山梨醇溶液(1mol/L,无菌)
简介：
山梨醇(Sorbitol)又称山梨糖醇、己六醇、D －山梨醇等，是一种不挥发多元糖醇。
CAS 号为50-70-4，分子量为182.17。
用于日化行业作为保湿剂、防冻剂等；用于食品行业作为保鲜剂、甜味剂等；用于医药行业作为维生素C 的生产原料等。
Sorbitol solution 用于染色剂的衬染剂、分离细胞核等，经高压灭菌处理。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 根据实验具体要求操作。
1、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期： 6个月有效。
编号 名称 CS0151 Storage Sorbitol solution(1mol/L,无菌) 100ml RT 使用说明书 1份。
酵母电转化
在精编分子生物学实验指南上有一部分讲到了酿酒酵母，电转化具体过程如下：1）将转化用酵母菌株的单菌落接种于5ml YPD培养基中，30度过夜培养至饱和。
2）转化前一天晚上，在装有500ml YPD培养基的2L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30度剧烈振摇，直到细胞密度达1*10的8次方（OD600约为1.3-1.5）。
3）于4度4000g离心收获培养细胞，细胞用80ml无菌水重悬。
为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4。
如果不需要可接步骤64）加入10ml，pH7.5，10*TE缓冲液，摇晃均匀，再加入10ml10*乙酸锂，旋转摇匀，于30度请请摇动45min5）加入2.5ml 1 mol/L DTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min6）将酵母菌悬液稀释在500ml水中，洗涤3次，每次以4000-6000g于4度离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：第一次沉淀：250ml冰冷的水第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇最终的OD600应为约2007）电转化：在无菌冰冷的微量离心管中加入40ul 酵母菌细胞和小于等于100ng 待转化的DNA（体积小于5ul），混匀。
转移至冰冷的电转槽中，接下来按照你的电穿孔仪的说明操作就可以啦。
8）往电击槽中加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀9）直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30度培养3-6天，直到平板上出现菌落。
步骤7-8可能会因电转仪的不同而有所不同。
其实用乙酸锂法也很方便的。
在一本酵母操作的实验手册上还看到了一个lazy-bones的转化实验方法，按照它做下来也得到了菌落。
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［ 1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（ Saccharomyces.Cerevisiae ）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主． 1981 年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。
毕赤酵母常用缓冲液
一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制1．1 各种母液的配制10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4℃保存。
34g 酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。
500*B （0.02%生物素Biotin）4℃保存保存期为1年。
20mg的生物素溶于100ml 水中，过滤除菌。
100*H （0.4%Histidine 组氨酸）4℃保存保存期为1年。
400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。
10*D （20%Dextrose 葡萄糖）保存期为1年。
200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。
10*M （5%Methanol 甲醇）保存期为2个月。
将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。
10*GY （10%Glycerol 甘油）保存期为1年以上。
将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。
100*AA （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）4℃保存保存期为1年。
分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml 水中，过滤除菌。
1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。
1.2 常用溶液及缓冲夜1.2.1 碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：溶液Ⅰ：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L Tris－HCI (pH 8.0)溶液Ⅱ：0.2mol／L NaOH，1％SDS（临用时配制）溶液Ⅲ：29.44g KAc，11.5ml Acetic acid，加ddH2O 至100 ml。
《中国药典》2020版—山梨醇溶液国家药用辅料标准
附件：山梨醇溶液Shanlichun RongyeSorbitol Solution本品为山梨醇、少量的单糖、多糖及其他麦芽糖醇、甘露醇等的混合物，系部分水解淀粉经氢化制得。
本品含D-山梨糖醇（C6H14O6）不少于45.0%（g/g）(非结晶山梨醇溶液)；含D-山梨糖醇（C6H14O6）不少于64.0%（g/g）（结晶山梨醇溶液）。
【性状】本品为澄清、无色、糖浆状液体。
旋光度取本品约7.0g，置50ml 量瓶中，加硼砂6.4g 与水适量。
静置1h，偶尔摇动，用水稀释至刻度。
（如溶液不澄清，应滤过），依法测定（通则0621），比旋度应为+1.5°至+ 3.5°（非结晶山梨醇溶液）；旋光度应为0°至+ 1.5°（结晶山梨醇溶液）。
电导率取本品50.0ml，作为供试品溶液；另取新沸放冷的纯化水100ml 作为空白溶液。
将供试品溶液与空白溶液置25℃±1 ℃的水浴中保温1 小时后，缓缓搅拌，用电导率仪测定，以铂黑电极作为测定电极，先用空白溶液冲洗电极3 次后，测定空白溶液的电导率，其电导率值应不得过5.0µS/cm。
取出电极，再用供试品溶液冲洗电极3 次后，测定供试品溶液的电导率，经空白校正后，不得过10µS/cm。
【鉴别】（1）取本品约1.4g，加水75ml 使溶解，作为供试品溶液；取上述溶液3ml 至15cm 试管，加新制的10%邻苯二酚试液3ml，摇匀，加硫酸6ml，摇匀，加热30s，即显深粉色或酒红色。
（2）在含量测定项下记录的色谱中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
【检查】酸度取本品1.4g，加水至10ml，依法检查（通则0631），pH 值应为5.0~7.5。
溶液的澄清度与颜色取本品7.0g，置50ml 量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，依法检查（通则0901 与通则0902），溶液应澄清无色。
还原糖取本品适量（含无水物3.3g），置锥形瓶中，加3ml 水使溶解，加碱性枸橼酸铜试液20ml，加玻璃珠或沸石数粒，加热使在4~6 分钟内沸腾，保持沸腾3 分钟。
钙盐染色液配方及使用方法
钙盐染色液，钙盐染色产品编码产品名称产品规格保存条件北京华越洋5NF061 钙盐染色液(茜素红S法) 2×50ml 室温,避光,6个月北京华越洋5NF062 钙盐染色液(改良茜素红S法)3×50ml 4℃,避光,6个月北京华越洋5NF063 钙盐染色液(硝酸银法) 2×50ml 4℃,避光,6个月用途：钙盐染色注意事项：钙沉积物成橘红色,染色时间取决于钙的含量,检测少量钙时更有效。
复染液为固绿。
MTT溶液过碘酸-雪夫（AB-PAS）染色试剂盒过碘酸-雪夫（快速）染色试剂盒糖原PAS过碘酸雪夫染色试剂盒Bennhold刚果红染色试剂盒钙盐染色液（FeH）染色试剂盒Gordon-Sweets银氨溶液100ml 结缔染色网状纤维染色,可区分胶原纤维网状纤维染色试剂盒(改良Gomori氨银法) 5×100ml 结缔染色网状纤维染色,可区分胶原纤维网状纤维染色试剂盒(改良Gomori氨银法) 5×50mlGomori氨银溶液500ml 结缔染色网状纤维染色,可区分胶原纤维羟胺溶液(1.5mol/L,pH8.5) 100ml 135 室温,3个月细胞其他青霉素-链霉素混合溶液(100×双抗) 100ml 68 —20℃,12个月抗生素青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液(100×三抗) 100ml 195 —20℃,12个月抗生素秋水仙碱溶液(Colchicine,10mg/ml) 5ml 143 4℃,避光,6个月药物去离子甲酰胺100ml 120 4℃,避光,12个月RNA溶液任氏液500ml 128 4℃,3个月细胞其他溶菌酶(Lysozyme,10mg/ml) 5ml 90 —20℃,12个月核酸提取鞣酸/单宁酸水溶液(5%) 100ml 68 室温,12个月结缔染色乳酸酚棉蓝染色液100ml 180 室温,避光,12个月微生物染色乳酸脱氢酶染色液(H型,四唑盐法) 2×50ml 375 4℃,避光,6个月酶类染色乳酸脱氢酶染色液(M型,四唑盐法) 2×50ml 375 4℃,避光,6个月酶类染色乳酸脱氢酶染色液(四唑盐法) 2×50ml 360 4℃,避光,6个月酶类染色乳酸银显影液100ml 105 室温,避光,6个月免疫组化瑞氏-姬姆萨复合染色液2×100ml 188 室温,12个月微生物染色瑞氏-姬姆萨复合染色液2×500ml 630 室温,12个月微生物染色瑞氏染色液(Wright stain) 2×50ml 75 室温,12个月微生物染色瑞氏染色液(Wright stain,) 2×100ml 113 室温,12个月微生物染色瑞氏染色液(Wright stain,) 2×500ml 390 室温,12个月微生物染色瑞氏染色液(Wright stain,即用型) 100ml 105 室温,12个月微生物染色瑞氏染色液(Wright stain,即用型) 500ml 375 室温,12个月微生物染色弱磷酸盐缓冲液(LoPBS,pH7.0) 100ml 120 4℃,12个月蛋白其他噻嗪红染色液(0.1%) 100ml 90 室温,避光,12个月染色其他噻嗪红染色液(0.2%) 100ml 105 室温,避光,12个月染色其他三磷酸腺苷溶液(ATP,10mmol/L) 10ml 75 —20℃,12个月PCR相关三氯化铁水溶液(10%) 100ml 53 室温,12个月常规其他三羟甲基甘氨酸加样缓冲液(2×) 10ml 75 4℃,6个月蛋白电泳沙黄/藏红T水溶液(2%) 100ml 83 室温,避光,6个月微生物染色山梨醇-磷酸盐溶液(1.2mol/L,pH7.5) 100ml 68 室温,6个月细胞组分分离山梨醇-磷酸盐溶液(1.2mol/L,pH7.5,无菌) 100ml 128 室温,6个月细胞组分分离山梨醇溶液(1.1mol/L,无菌) 100ml 113 室温,6个月细胞组分分离山梨醇溶液(1mol/L) 100ml 60 室温,6个月细胞组分分离山梨醇溶液(1mol/L,无菌) 100ml 105 室温,6个月细胞组分分离神经HRP示踪显色液(DAB法) 50T 165 4℃,避光,6个月神经染色神经HRP示踪显色液(TMB法) 50T 165 4℃,避光,6个月神经染色生理盐水(1×NS,无菌) 500ml 45 室温,12个月常规其他生理盐水(10×NS,无菌) 500ml 53 室温,12个月常规其他石碳酸复红染色液100ml 135 室温,避光,18个月微生物染色双链DNA变性缓冲液100ml 75 室温,12个月核酸杂交双缩脲法蛋白定量试剂盒500T 150 4℃,12个月蛋白检测双缩脲法蛋白定量试剂盒1000T 255 4℃,12个月蛋白检测双缩脲总蛋白试剂100ml 75 4℃,12个月蛋白检测水饱和酚(Phenol Water) 100ml 90 4℃,避光,3个月核酸提取顺丁稀二酸缓冲液(MAB,pH7.5) 500ml 90 室温,36个月核酸电泳苏丹Ⅲ酒精饱和溶液100ml 120 室温,避光,12个月脂类染色苏丹Ⅲ脂肪染色液3×50ml 240 室温,避光,12个月脂类染色苏丹Ⅳ染色液3×50ml 225 4℃,避光,12个月脂类染色苏丹Ⅳ染色液-A液100ml 120 室温,避光,12个月脂类染色酸性磷酸酶染色液(偶氮偶联法) 2×50ml 885 4℃,避光,6个月酶类染色酸性磷酸酶染色液(硝酸铅法) 2×50ml 300 4℃,避光,6个月酶类染色酸性乙醇分化液(0.5%) 500ml 75 室温,12个月染色其他。
山梨醇注射液说明书
山梨醇注射液说明书【药品名称】通用名: 山梨醇注射液曾用名：商品名：英文名: Sorbitol Injection汉语拼音: Shanlichun Zhusheye本品主要成分及其化学名称为:主要成分山梨醇，化学名称为D-山梨糖醇。
其结构式为:分子式: C6H14O6分子量: 182.17【性状】本品为无色的澄明液体。
【药理毒理】山梨醇单糖为甘露醇的异构体，作用与甘露醇相似但较弱，静脉注入本品浓溶液(25％)后，除小部份转化为糖外，大部以原形经肾排出，因形成血液高渗，可使周围组织及脑实质脱水而随药物从尿液排出，从而降低颅内压，消除水肿。
注射后2小时出现高效，明显地使脑水肿逐渐平复，紧张状态消失，脑脊液压下降，在体内不被代谢，经肾小球滤过后在肾小管内甚少被重吸收，起到渗透利尿作用。
(1)组织脱水作用。
提高血浆胶体渗透压，导致组织内(包括眼、脑、脑脊液等)水分进入血管内，从而减轻组织水肿，降低眼内压、颅内压和脑脊液容量及其压力。
（2）利尿作用。
利尿作用机制分两个方面。
①增加血容量，并促进前列腺素I2分泌，从而扩张肾血管，增加肾血流量包括肾髓质血流量。
肾小球入球小动脉扩张，肾小球毛细血管压升高，皮质肾小球滤过率升高。
②本药自肾小球滤过后极少（<10%)由肾小管重吸收，故可提高肾小管内液渗透浓度，减少肾小管对水及Na＋、Cl－、K＋、Ca2＋、Mg2＋和其他溶质的重吸收。
过去认为本药主要作用于近端小管，但经穿刺动物实验发现，应用大剂量山梨醇后，通过近端小管的水和Na＋仅分别增多10~20%和4~5%;而到达远端小管的水和Na＋则分别增加40%和25%。
提示亨氏袢重吸收水和Na+减少在山梨醇利尿作用中占重要地位。
此可能是由于肾髓质血流量增加，髓质内尿素和Na+流失增多，从而破坏了髓质渗透压梯度差。
由于输注山梨醇后肾小管液流量增加，当某些药物和毒物中毒时，这些物质在肾小管内浓度下降，对肾脏毒性减小，而且经肾脏排泄加快。
原生质体制备和转化
将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离 心10min；
经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单 孢子悬浮液
将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝 培养基的三角瓶中，于30℃静止培养23~25h
6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体 用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体
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弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原 生质体浓度调整为5×106 ~ 5×107个细胞 /mL；
将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与 100µL米曲霉原生质体置冰上轻轻混匀；
加入25µL PTC溶液，冰浴20min；
加入1 mL PTC溶液，室温放置15min；
最后加入2mL STC溶液，混匀。
文献汇报
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汇报人姓名
培养基成分 高渗溶液（有机/无机）
缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例）
酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体
双层or单层培养基
高渗缓冲液：
《微生物学实验教程》 周德庆（酵母）
1、接种于液体培养基上培养。
高渗缓冲液：
蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L
2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用TrisHCl(pH 7.4)、0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。
毕氏酵母(Pichia_pastoris)感受态细胞制备及转化 (1)
毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD 值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。
酵母电转化——精选推荐
酵母电转化(2006)1)将划线培养的毕赤醉母GS115单菌落接种于3mLYPD培养基中，280度,250r/min 摇荡培养24-48h,2)取培养物100uL转接种于20mLYPD培养基中，28℃摇荡过夜，OD600=1. 3-1. 5，4'C 1500r/min离心5min收获细胞3)细胞依次用100mL, 50mL冰预冷水和20mL冰预冷的1moI/L山梨醇洗涤，4度,1500g离心5min,最后用0. 8mL冰预冷的lmol/L山梨醇悬浮菌体，置冰浴。
4)取Sa 1 I线性化的重组载体l0ul (l0ug)与80gL毕赤酵母感受态细胞混匀，然后转移到冰预冷的0.2 cm的电转移杯中，冰上放置5mino(2)将电转移杯放在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电击条件:电压1500V电容25uF，电阻200，时间5ms,温度O 'c(3)电击结束，立即加入1mL冰预冷的lmol/L山梨醉，混匀，取250uL转化物涂营养缺陷型MD培养基平皿，置28'C恒温培养2-4d，能在MD培养基上生长的菌落为His，转化子。
另一种方法:①从毕赤氏酵母GS115平板上挑取一单菌落，接种于10 mL YPD培养基中，30℃，250 r/ min,振荡培养过夜;②从上述过夜培养液中吸取1 ML，接种于200 mL YPD培养基中，30℃，250 r/min, 振荡培养至OD600为1.1-1.5;③500Xg离心培养液，沉淀细胞，用去离子水和1 m的山梨糖醇各洗两次;④加入1 ML预冷的1M的山梨糖醇重悬细胞，此即为感受态细胞;⑤把感受态细胞分装，每管100 uL，-70℃保存，备用.①将冻存于一70℃的GS115感受态细胞取出，冰浴融解;②分别将四种各10 uL线性化重组表达载体加入100 uL GS115感受态细胞中，用Tip头轻轻混匀;③将混匀的感受态细胞和重组表达载体混合物加入2 mm的电击杯底部，轻轻振荡，使混合物完全沉落于电击杯底部，冰浴5m in;④将JY2000-1B基因导入仪的电压调到1500 V，电阻调到200 ，电容调到25 uF, 电击10m s;⑤将1 mL 1 M冰浴的山梨糖醇加入电击杯，混匀，各吸出200 pL，分别涂于4个YP D+Zeocin平板上;⑥将平板置于30℃培养箱，培养2d至长出菌落。
酵母转化常用培养基及程序
酵母实验操作方案一．质粒酶切及线性化1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。
2）线性化质粒使用80μl酶切体系9KSF2质粒70μl内切酶（SacI，SalI，BglⅡ）2μl10 x buffer 8μl3）酶切3－16小时，一般3小时即可；二．乙醇回收酶切质粒1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2），混匀，沉淀DNA；2）－200C数个小时（>2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清；3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）；4）37℃烘干水分和残留乙醇；5）用20μl ddH2O重溶；6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量；三．电转化1．准备感受态细胞1）5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，300C，摇菌24 hours；2）100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，300C ，250rpm，7～8hours，直到OD600＝1.3～1.5；3）菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，40C离心5 min，弃上清；4）100ml冰水重悬，同上离心，弃上清；5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清；6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清；7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，40C备用，剩下的感受态细胞可以保存在－700C冰箱大约3周。
2．转化1)100μl GS115感受态细胞加入＋20μl 线性化质粒，用枪打匀；2)冰浴5min，加入0.2cm转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴；3) 电转化，参数设定：电压1500V 电容25μF电阻200欧姆，放电时间4～5ms4)立即加650μl 冰1M sorbitol 入转化杯，打匀；5) 迅速涂板，250μl/块MD板，共3块；6) 涂好的板放在300C培养箱中培养4～5天，至菌落直径1mm即可。
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中,30℃、250-300r/min培养过夜；2. 取100-500µl （≤1：100)的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250—300r/min培养过夜（约20h),至OD600 达到1。
3~1.5；3。
将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min,用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6。
按步骤3 离心，用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬,其终体积约为240 ul；备注:可将其分装为80 µl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。
比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝.对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。
一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。
✓KM71比GS115生长的要慢.毕赤酵母都应该是白色菌落的✓对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到YPD中培养18—24h,然后取菌液以1:1加入30％灭菌甘油, —80o C ul/管冻存(一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍,约20ul ddH2O 重溶。
转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。
建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下:1)酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀2)-20℃20分钟沉淀3)13200rpm，20min,离心后弃上清4）75％乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹).6）20ul ddH2O重溶)电击转化：8。
实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法
实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法(总3页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--电转法设计方案一：感受态制备：1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:；3.于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；4.加入1ml，，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10×LiAc，旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min；5.再加入 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；6.于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；7.冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；8.每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。
电转化：1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；2．擦干电转杯，电击，电击参数：，25uF，200欧姆；3．立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；4．离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h；5．离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。
说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。
设计方案二：感受态制备：1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:；3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc， 10 mM DTT， M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH ），室温静置30min；4.4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离心条件一样；5.每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。
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北京雷根生物技术有限公司
山梨醇溶液(1mol/L,无菌)
简介：
山梨醇(Sorbitol)又称山梨糖醇、己六醇、D －山梨醇等，是一种不挥发多元糖醇。
CAS 号为50-70-4，分子量为182.17。
用于日化行业作为保湿剂、防冻剂等；用于食品行业作为保鲜剂、甜味剂等；用于医药行业作为维生素C 的生产原料等。
Leagene Sorbitol solution 用于染色剂的衬染剂、分离细胞核等，经高压灭菌处理。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 根据实验具体要求操作。
注意事项：
1、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期： 6个月有效。
相：
编号 名称 CS0151 Storage Sorbitol solution(1mol/L,无菌) 100ml 4℃ 使用说明书 1份 编号 名称
CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)
CS0001 ACK 红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)
CZ0063 改良台氏液(Tyrode's solution)
DG0005 糖原PAS 染色液
NA0030 Tris-乙酸电泳缓冲液(50×TAE)
NH0043 SSC 缓冲液(20×,pH7.0)
TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 比色法)。