植物组织培养第三章 植物器官和组织培养
3第三章 植物组织培养简介
的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力， 的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力， 回复到分生组织状态的过程。 回复到分生组织状态的过程。
3.再分化 redifferentiation〕 3.再分化〔redifferentiation〕:
Folke Skoog(1908- )
1955年，Miller从DNA降解物中分离出6－呋喃 1955年 Miller从DNA降解物中分离出6 降解物中分离出 氨基嘌呤（激动素）， ），发现它诱导芽分化的效率比 氨基嘌呤（激动素），发现它诱导芽分化的效率比 腺嘌呤高3万倍。控制器官分化的激素模式变为激动 腺嘌呤高3万倍。控制器官分化的激素模式变为激动 生长素的比例关系 促进组培的发展。 的比例关系。 素／生长素的比例关系。促进组培的发展。
Gottlieb Haberlandt(1854-1946). He was the first to formulate clearly the principles of plant cell culture.
细胞全能性学说： 细胞全能性学说： 植物体中任何生活细胞都具有该 物种的全部遗传信息， 物种的全部遗传信息，具有相同的形态结构和一定的生理 功能。只要条件合适， 功能。只要条件合适，由一个单细胞就可以发育成为一个 新的个体。 新的个体。 该文还报道了几种植物的细胞和组织的培养实验，由 该文还报道了几种植物的细胞和组织的培养实验， 于当时的条件所限，都没有成功. 于当时的条件所限，都没有成功
第三章 植物组织培养 (tissue culture) 概述
第一节
植物组织培养的意义
植物组织培养概念(重点 重点) 一、植物组织培养概念 重点 植物组织培养理论基础(难点 难点) 二、植物组织培养理论基础 难点 植物组织培养类型(难点 难点) 三、植物组织培养类型 难点 植物组织培养特点(重点 重点) 四、植物组织培养特点 重点
植物组织培养 期末复习
绪论植物组织培养（Tissue culture）：是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养或试管培养。
器官：根、茎、叶、花、果实、种子；组织：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等。
或指将植物的离体器官、组织、细胞以及去除细胞壁的原生质体，放在离体无菌人工控制的环境条件下培养，对其进行克隆，使其生长、分化并成长为完整植株的过程。
组织（tissue)、器官（organ)或细胞培养：指利用生物体各部分组织、器官或细胞进行离体培养，使之形成愈伤组织或完整有机体的技术。
愈伤组织（callus）：在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。
原生质体培养指将微生物或植物细胞游离成原生质体，在适宜培养条件下，依据细胞全能性使其再生细胞壁，并进行细胞分裂分化，形成完整个体的技术。
植物组织培养特点：①培养条件可以人为控制；②生长周期短，繁殖率高；③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制()。
1、植物组织培养的理论基础—细胞全能性：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。
2、植物细胞全能性的表达：①脱分化（dedifferentiation)：将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。
一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。
②再分化（redifferentiation)：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。
离体的植物器官、组织、细胞→脱分化形成愈伤组织→再分化形成根、芽→再生植株。
4、组织培养植株再生的途径：1）、体细胞胚胎发生途径(胚状体发生途径)：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程(经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期)，形成具有双极性的胚状结构，而发育成再生植株的途径。
组织培养第三章 愈伤组织培养资料
2、操作程序
获取外植体材料－消毒处理－修整除去 坏死组织－切成5mm的圆柱形或方形小块－ 直放或倒放到培养基上－每9cm培养基接种5 －6块外植体－培养。 选用较大组织做材料时，可用打孔器 从块茎和块根中钻取一批圆柱型组织，切 成相同厚度的小圆片进行培养。
采用圆形的原因：
能得到外形简单结构相同的材料
第一节 愈伤组织的培养
愈伤组织培养是指将母体植株上的各个 部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养 基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一 门技术。 一般情况下，植物组织均能诱发形成愈 伤组织，由外植体形成愈伤组织，标志着植 物离体培养的开始。
一、愈伤组织的诱导 （一）诱导原理 1、细胞全能性 植物每一细胞具有全套遗传信息，在 特定环境下能进行表达，而产生一个独立 完整的个体。
（二）在园艺植物育种中的应用： 1、加快园艺植物新品种和良种繁育速度， 迅速高效低成本 2、培养无病毒苗木 3、获得倍性不同植株，易染色体核内加 倍育种有利用价值 4、克服远缘杂交困难 5、利于种质资源长期保存 6、提供育种中间材料 7、诱发和离体筛选突变体 8、制造人工种子
植物离体培养中的器官发生类型： 不定芽型—诱导顶端分生组织产生不定 芽，再生成植株的方式。顶芽、腋芽培养。 多数植物培养采用。
圆形的表面积大
圆柱形的外植体有利于组织块与外界进 行物质和气体交换；也使外植体表面促进愈 伤组织形成的分泌物较多，诱导率增高。
培养基
MS培养基 激素 IAA、NAA、2,4-D、BA 椰子汁、番茄汁、酵母提取物。
二、愈伤组织细胞的分化
单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤 组织，大致经历三个时期，这三个时期中细 胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别。
细胞分化——持续细胞分裂增殖——原胚期— —球形胚——心形胚——鱼雷形胚——子叶期
植物组织培养技术第三章第四章植物器官的培养
营养器官的培养——茎尖的培养 营养器官的培养——茎尖的培养
1、 取材 、
取1-2㎝顶梢 ①直接取材：在生长旺盛、枝 直接取材：在生长旺盛、 条健壮、 条健壮、无病的母株上选生 长不久、杂菌污染少的顶梢 长不久、 （1－2cm）（取前可喷杀菌 cm）（取前可喷杀菌 ）（ 药，可顶芽或侧芽）。 可顶芽或侧芽）。 ②从试管苗获取。 从试管苗获取。
第一节 一、离体根的培养 意义： （一） 意义： ①生理代谢研究的优良实验体系 ②研究器官分化形态建成的良好体系 ③建立快速生长的根无性系 ④进行诱变育种 营养器官的培养
营养器官的培养——根的培养 营养器官的培养——根的培养
（二） 培养方法 1. 培养基选择 White培养基；2/3或1/2 MS 和 B5培养基 培养基； 或 培养基 培养基 注：离体根生长要求 提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好， 提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好，加入 B1、B6最重要 生长素对离体根影响不一致。 最重要， B1、B6最重要，生长素对离体根影响不一致。培养 温度25 27℃，暗光培养。 25－ 温度25－27℃，暗光培养。
离 体 根
脱分化培养基
愈 伤 组 织
再分化培养基
分 化 芽
再 生 植 株
植物器官的培养
二、茎尖的培养
•1.茎尖培养概念及类型 1.茎尖培养概念及类型 1. •2.茎尖培养方法及步骤 2.茎尖培养方法及步骤 2.
营养器官的培养——茎尖的培养 营养器官的培养——茎尖的培养
（一）茎尖培养概念及类型
茎尖培养： 茎尖培养：切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行 无菌培养。 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为： 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为： 微茎尖培养: 微茎尖培养 带有1-2个叶原基的生长锥, 其长度不超过0.5mm 普通茎尖培养： 普通茎尖培养：较大的茎尖(如几mm到几十mm)、芽尖及侧芽 这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便， 茎尖容易成活，成苗所需时间短
植物组织培养植物器官以及组织培养
（5）生根培养 刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降
低或不加细胞分裂素浓度，提高生长素浓度，促进芽苗 生根，提高其健壮度。 （6）炼苗移栽
选择生长健壮，有3～5条根的生根苗进行炼苗，移 栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫。当苗 完全成活后，再移向大田。
（四）果实和种子的灭菌
表皮有茸毛或蜡质，需在灭菌剂中加入几滴土温-80。 果实70%酒精浸泡数秒—0.1-0.2%氯化汞浸泡3-10min， （或1%次氯酸钠浸泡10-20min）—灭菌水冲洗3-5次—无 菌滤纸吸干—分割—接种。
植物组织培养植物器官以及组织培 养
初代培养物的建立
（一）无菌环境
培养基、接种器械、超净工作台、接种室环境、抗 生素物质（去除侵入组织内部的病菌。见表）
器官发生 体细胞胚胎发生
植物组织培养植物器官以及组织培 养
形态发生和植株再生
器官发生：芽或芽原基起源于培养组织中比较表 层的细胞，即外起源。根原基发生在组织较深处，即 内起源。两者之间一般没有什么联系，呈现单向极性。
胚状体发生：极大多数体细胞胚起源于单细胞， 形成的胚状体具有双极性，在其发育的早期阶段，在 方向相反的两端分化出茎端和根端，其维管组织与母 体植物或外植体的维管组织通常没有联系。胚状体维 管组织呈独立的Y形。
植物组织培养植物器官以及组织培 养
拟定培养方案
外植体预处理
外植体无菌接 种
启动培养
分化出芽、胚 状体或原球茎
继代增殖培养
生根培养
炼苗移栽
成活供生产使 用
培养基配制灭菌
植物组织培养的一般程序
植物组织培养植物器官以及组织培 养
第一节 植物器官和组织培养的基本程序
植物的器官和组织培养
二、植物根段培养
植物根段培养是指以植物的根切段为外 植体进行离体培养，再生完整植株的过程 。是研究根系生理代谢、器官分化及形态 建成的良好实验体系。培养方法与叶片培 养相似。
培养过程包括愈伤组织诱导、不定芽分 化、无菌苗的增殖与生根等。
大蒜根尖培养及植株再生
三、植物茎段培养
植物茎段培养是指对植物的带有定芽或 不定芽的外植体进行离体培养，再生完 整植株的过程。
利用灭菌剂对 外植体灭菌
无菌水冲洗 3-5次
1、茎尖、茎段、叶片的灭菌 2、根、块茎、鳞茎的灭菌 3、花蕾的灭菌 4、果实、种子的灭菌
二、初代培养物的建立
（一）无菌环境 （二）规范操作 （三）条件合适
三、形态发生和植株再生
外植体 愈伤组织
体胚途径
植株
具根茎的两极器官
器官化途径
先茎后根
单极器官
先根后茎
对培养的要求：成熟种子萌发培养所用培养基成 分简单，不需生长调节剂；未成熟种子萌发培养 则需要添加一定的营养成分和生长调节剂。若需 要其形成愈伤组织，需要相应的生长调节剂及营 养物质。
第四节 植物组织培养和脱毒苗的生产
一、植物分生组织(meristem culture)培养：
定义：是指对植物的分生组织进行离体培养 的技术，包括植物根尖、茎尖等顶端分生组 织和形成层组织的培养。其中茎尖培养广泛 应用于植物再生和脱病毒研究。
植物茎尖培养过程
➢茎尖离体培养可能出现的培养反应：
生长太慢 生长过旺，愈伤增多 生长正常
三、利用茎尖培养生产脱毒苗
脱毒苗生产的意义 茎尖脱毒机理 基本技术规程 影响脱毒效果的因素
1、脱毒苗生产的意义：
目前受病毒危害严重影响生产的有：
植物组织培养
（3）肌醇 又叫环己六醇，在糖类的相互转 化中起重要作用。 使用浓度：一般为lOOmg／L。 作用：适当使用肌醇，能促进愈 伤组织的生长以及胚状体和芽的形 成。对组织和细胞的繁殖、分化有 促进作用，对细胞壁的形成也有作 用。
（4）氨基酸 (almino acide） 作用：蛋白质的组成部分，也是一种有机氮化 合物。是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、 谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等 半胱氨酸及多种氨基酸的混合物（水解酪蛋白、水 解乳蛋白）等。
（11）再分化 经脱分化的组织或细胞在一定 的培养条件下可又转变为各种 不同细胞类型的能力。 （12） 分化培养 经过脱分化阶段的外植体（形 成愈伤组织），转移到另一培 养基上分化出芽（或小球茎） 或胚时，则称为分化培养，所 用的培养基为分化培养基。
（13） 增殖培养 已分化芽、小球茎或无性幼胚再继续进行增殖，即
1. 培养条件可人为控制，周年生产
植物组织培养中的植物材料完全是在人为提供的 培养基及小气候环境下生长的，摆脱了大自然中 四季、昼夜气温频繁变化及灾害性气候等外界不 利因素的影响，且条件均一、对植物生长极为有 利。因此植物组织培养不受气候和季节的限制， 可周年进行生产。
2. 生长周期短，繁殖速度快
植物组织培养可根据不同植物、不同器官、不同 组织的不同要求而提供不同的培养条件，满足其 快速生长的要求，缩短培养周期。一般20~30d就 完成一个繁殖周期.每一繁殖周期可增殖几倍到几 十倍,甚至上百倍,植物材料以几何级数增加。
3. 管理方便，可实现工厂化生产
植物组织培养是在人为的提供一定温度、光照、 湿度、营养和植物生长调节剂等条件下进行的， 不受自然界中病、虫、杂草等有害生物危害，生 产微型化、精细化、高度集约化，重复性强，便 于标准化管理和自动化控制，真正实现了种苗的 工厂化生产。与田间栽培、盆栽等相比，省去了 中耕除草、浇水施肥、病虫防治等一系列繁杂劳 动，可大大节省人力、物力及田间种植所需要的 土地。
3.植物细胞培养（植物组织培养）
3.植物细胞培养（植物组织培养）第三章植物细胞培养植物细胞培养：指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或⼩细胞团）进⾏培养，形成单细胞⽆性系或再⽣植株的技术。
Haberlandt（1902）⾸次尝试分离和培养植物叶⽚单细胞。
细胞培养的意义有利于进⾏细胞⽣理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。
进⾏细胞培养，通过单细胞的克隆化，即称为“细胞株”（cell line），可以把微⽣物遗传技术⽤于⾼等植物以进⾏农作物的改良。
细胞培养的增殖速度快，适合⼤规模悬浮培养，⽣产⼀些特有的产物，如许多种植物的次⽣代谢产物，包括各种药材的有效成分等，⽤于医药业、酶⼯业及天然⾊素⼯业，这是植物产品⼯业化⽣产的新途径。
由于植物组织培养中细胞之间在遗传和⽣理⽣化上会出现种种变异，这些细胞形成的植株也都表现出⼀定的差异。
这种差异反映在它们的植株的形态、产量、品质、抗病⾍和抗逆性等⽅⾯。
所以由单细胞培养获得的单细胞⽆性繁殖系，并对不同的细胞进⾏研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。
细胞培养就是从⾼等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进⾏培养，并诱导其分裂增殖，由细胞分裂形成细胞团，再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体，长成完整植株。
第⼀节植物细胞培养⼀. 单细胞培养(⼀)单细胞分离1.机械法2.酶解法3.从愈伤组织中分离(⼆)单细胞的培养⽅法1、平板培养（细胞的⽣长周期）2、看护培养3、微室培养 4. 条件化培养⼆. 细胞悬浮培养（⼀）悬浮培养的⽅法1、分批培养（细胞的⽣长周期）2、半连续培养3、连续培养——封闭型、开放型（化学、浊度恒定式）4、固定化培养（⼆）培养细胞的同步化1. 化学⽅法(饥饿法、抑制法、有丝分裂抑制法）2. 物理⽅法（分选、低温）（三）培养基振荡⼀、单细胞培养（⼀）单细胞的分离1.机械法: Ball(1965)⾸次由花⽣成熟叶⽚利⽤机械的⽅法使叶⾁细胞得到分离的技术。
⑴⼑⽚刮: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠)→撕去下表⽪(露出叶⾁细胞) →⽤解剖⼑刮下细胞→单细胞悬浮培养⑵研磨离⼼法: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠) →研磨匀浆(10g叶⽚+40ml研磨介质)→匀浆过滤(细纱布) →离⼼(先低速去碎屑) →游离细胞沉降到底部(净化细胞) →植株培养或悬浮培养研磨介质: 20µmol蔗糖+ 10µmol MgCl2 + 20µmol Tris-HCl (pH7.8)机械法的特点：⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发⽣质壁分离。
植物器官和组织培养的基本程序
植物器官和组织培养的基本程序离体的植物器官和组织在人工培养条件下，通过不同的器官发生途径，形成体细胞胚或茎芽，进一步再生成完整植株。
因此，植物器官和组织培养的基本程序包括：无菌外植体的获得、初代培养物的建立、形态发生、植株再生以及培养产物的观察记载。
一、无菌外植体的获得从自然界和室内采集的植物器官和组织材料携带有各种微生物，这些污染源一旦进入培养容器中，造成培养基和培养材料污染，实验无法进行。
所以，污染是组织培养的一大障碍。
利用各种灭菌剂可以进行外植体的灭菌，但不同植物或同一植物不同器官和组织的带菌程度不同，所用灭菌剂的种类、浓度及灭菌方法也不尽相同。
(一)茎尖、茎段、叶片的灭菌灭菌前外植体用清水冲洗，茸毛较多的外植体用皂液洗涤后再用清水冲洗、用吸水纸吸干表面水分；将外植体浸泡在0.1%～0.2%的氯化汞溶液中2～10min，或先在70%～75%酒精中浸数秒，然后在10%次氯酸钙溶液中浸泡10～20min。
或先在70%～75%酒精中浸泡数秒，再在2%次氯酸钠溶液中浸泡15～30min进行灭菌；灭菌后倒掉灭菌液，无菌水冲洗外植体3～5次，置外植体于无菌滤纸上吸干表面水分，适当分割后接种。
(二)根、块茎、鳞茎的灭菌这类材料生长在土中，灭菌较困难，且挖取时易受损伤。
所以灭菌前应仔细清洗，对凹凸不平及鳞片缝隙处，需用软刷清洗，并切除损伤部位。
灭菌时应增加灭菌时间或增大灭菌剂浓度，如将外植体浸泡在0.1%～0.2%氯化汞溶液中5～12min，或在70%～75%酒精中浸数秒，然后用6%～10%次氯酸钠溶液浸5～20min进行灭菌。
灭菌后的操作步骤同上。
(三)花蕾的灭菌未开放花蕾中的花药为花被包裹，处于无菌状态，所以采摘后可直接灭菌。
灭菌时先在70%～75%酒精中浸蘸10～30s，然后在0.1%氯化汞溶液中浸泡3～10min或在1%次氯酸钠溶液中浸泡10～20min。
灭菌后的处理同上。
(四)果实、种子的灭菌这类材料有的表皮具有茸毛或蜡质。
第三章 植物器官培养2013
(二) 影响茎尖培养微繁殖的因素
基因型 外植体的大小 供试植株的生理状态 芽在植株上的部位 供试植株的年龄 培养基：植物生长物质 褐变 玻璃化
玻璃化苗的叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状； 整株矮化肿胀、失绿； 叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎； 叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。 玻璃化苗中因其体内含水量高， 干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和酶活性降低， 组织畸形，器官功能不全， 分化能力降低，所以很难成活， 严重影响组培苗繁殖率的提高。
细胞分裂素与生长素的组合 细胞分裂素与生长素配合使用， 诱导芽分化效果好于单独使用细胞分裂素。
（3）供试植株的发育时间和叶龄
个体发育早期的幼嫩叶片较成熟幼嫩叶片分化能力高，
（4）叶脉 叶脉、叶柄分化能力较强。 （5）极性 叶背面朝上放置就不生长。
（6）损伤 损伤后刺激诱导愈伤组织生长和器官发生。
第四节
3.培养条件 25-28℃， 光照12-14h， 光照度 1500-2000Lx， 不定芽分化和生长期间3000-10000Lx。
4.离体叶组织的茎和芽发生途径
⑴直接产生不定芽； ⑵由愈伤组织产生不定芽； ⑶胚状体形成； ⑷其他途径。
叶片的分化程度较高，
一般需要通过诱导愈伤组织并经再分化才能产生植株，变异率较高。
方法二（成熟叶片）
70%酒精漂洗约10秒 ——饱和漂白粉液中浸3-15分钟
——无菌水冲洗数次
——放在无菌的干滤纸上吸干水分以供接种用。 对一些粗糙或带绒毛的叶片要延长灭菌时间。 注意要选择成熟的叶片。 同一叶片的栅栏组织比海绵组织较成熟。 培养叶肉组织时因海绵组织在分裂前就死亡， 如果栅栏组织不发达就难培养。
第三章 植物组织培养的基本原理2011.3.9
（二）再分化
1.定义 定义 再分化（redifferentiaton）：离体培养的 ）：离体培养的 再分化（ ）： 植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行 分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、 分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、 器官、甚至形成完整的植株的现象。 器官、甚至形成完整的植株的现象。
兰花的原球茎生命力强，遗传性状稳定， 兰花的原球茎生命力强，遗传性状稳定，对快 原球茎生命力强 速繁殖及种质资源保存极为有利。 速繁殖及种质资源保存极为有利。 外植体接种后放置在23一25度的黑暗条件下培 外植体接种后放置在23一25度的黑暗条件下培 23 个月后可分比出1 养，1～2个月后可分比出1至数个乳白色的原球 在解剖镜下观察类似桑果形状的园球突起， 茎，在解剖镜下观察类似桑果形状的园球突起， 以后转绿，再经培养易呈根状茎（ 以后转绿，再经培养易呈根状茎（或呈树枝状 的丛生形）。 的丛生形）。
1新陈代谢方面：培养基 新陈代谢方面： 新陈代谢方面 2.调控能力方面：异养 调控能力方面： 调控能力方面 3.生长发育和繁殖方面：细胞脱分化，体细胞胚 生长发育和繁殖方面：细胞脱分化， 生长发育和繁殖方面 发生。 发生。 4.在遗传进化方面 4.在遗传进化方面 ：变异性增加
二、植物细胞分化
分化：指植物体各个部分出现异质性的现象， 分化：指植物体各个部分出现异质性的现象，包括 细胞分化、组织分化或器官分化等。 细胞分化、组织分化或器官分化等。 细胞分化：指在个体发育过程中，不同部位的细胞 细胞分化：指在个体发育过程中， 的形态结构和生理功能发生改变， 的形态结构和生理功能发生改变，形成不同的组织 和器官。 和器官。 细胞分化是发育生物学的核心问题， 细胞分化是发育生物学的核心问题，是基因选择性 活化或阻遏的结果。5%-10% 活化或阻遏的结果。
植物组织培养
绪论植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。
外植体：愈伤组织：一、植物组织的主要特征：（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
三．植物组培的应用1.植物离体快繁。
2.无病毒苗木培养。
3.培育新品种或创制新物种。
4.次生代谢物生产。
5.植物种质资源的离体保存。
6.人工种子。
第一章1.）实验室包括：准备室，无菌操作室，培养室，温室。
2.）器具的灭菌：1、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。
（1）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，150 ℃保温2小时，成本较高。
（2）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌锅内120 ℃15－20分钟。
（3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95％乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。
2、培养基灭菌：采用高压蒸汽灭菌。
植物组织培养与器官培养
2019/10/6
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培养基分类
• 根据培养基无机盐含量的差异将其分为以 下4类：
①高无机盐含量培养基（植物器官、花药、 细胞及原生质体培养）；-MS
②较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科 和单子叶植物的组织和花药培养）；-B5
材料灭菌 培养基筛选
器
官 发
增殖、分化
培养基中激素配比
生
型
激素种类及浓度
基 本
植株再生及鉴定 基本培养基组成
程
渗透压
序
炼苗和移植
逐步过渡
2019/10/6
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胚状体发生型(embryogenesis type)：
• 指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱 分化形成胚状体再成苗的方式。
• 技术关键：提高不同外植体胚状体发生及 萌发率和提高胚状体同步化率。
FLash
• 技术关键：打破顶端优势， 促使腋芽增殖并促其生根。
• 特点：繁殖率高、保持物种 的遗传稳定性，多用于林木
的繁殖。
器官型(organ type)
• 指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不 定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球 茎、小块茎）产生再生成植株的方式。
• 技术关键：对培养基要求高，控制好激素 浓度，避免愈伤组织发生。
来自茎尖或茎段
培养物的不定芽。
• 通常玻璃化苗
恢复正常的比例很低，
在继代培养中仍然
形成玻201璃9/10化/6 苗。
32
玻璃化的解决方法
1. 增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的 水势；
植物组织培养基本原理园艺
三．培养基
○ 植物营养 ○ 植物生长调节剂 ○ 培养基的物理性质
四．培养条件
#2022
第三章作业：
愈伤组织 外植体
细胞水平再分化
薄壁细胞 分生细胞 管胞细胞 色素细胞
再生植株
各种器官
器官水平再分化
(器官发生-----形成器官原基)
离体培养中器官发生的两种类型：
1. 器官型
2. 器官发生型
组织水平再分化
分 生 组 织
维 管 组
结织
节
3.2.3 植株再生
离体培养中再生植株的主要途径：器官发生 途径和胚胎发生途径
外植体细胞
胚胎发生 愈伤组织
萌发
脱分化 （器官发生型）器官发生
不定根
器官发生 （器官型）
胚胎发生
不定芽 萌发
再生植株
三．愈伤组织培养
四．愈伤组织形成过程的三个阶段
○ 诱导期：外植体细胞准备进行分裂的时期； ○ 分裂期：外植体外层细胞迅速分裂并逐渐恢复到分生组织状态，细胞进行脱分化的时
期； ○ 分化期：分裂期的愈伤组织中由于一些停止分裂的细胞内发生一系列形态和生理变化，
丛生芽：指由顶芽或侧芽 在适宜的培养基和培养条 件下，诱导腋芽原基不断 萌发而形成的丛生状芽。
原球茎：兰科植物组织培 养中形成的一种特殊的中 间繁殖体，是呈珠粒状、 由胚性细胞组成、基部生 假根、类似嫩茎的器官。 圆球茎可以增殖形成原球 茎丛。
3.2.2 再分化
外植体经离体培养形成完整再生植株所经历的再 分化过程:
脱分化和再分化
脱分化概念：
再分化概念：
不定芽：植物组织培养中，外植体在适宜的培养基和培
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（二）规范操作
操作技术熟练、工作经验、操作者、进入超净工作台 的物品表面。
（三）条件合适
培养基种类、激素种类和浓度、其他添加物、外植 体来源、生长发育状态、培养条件。
形态发生和植株再生 建立的无菌培养物在适宜的离体环境 中，生长发育（形态发生）形成完整的 小植株。 离体材料的形态发生的途径： 器官发生 体细胞胚胎发生
（5）生根培养 刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降
低或不加细胞分裂素浓度，提高生长素浓度，促进芽苗
生根，提高其健壮度。 （6）炼苗移栽
选择生长健壮，有3～5条根的生根苗进行炼苗，移
栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫。当苗 完全成活后，再移向大田。
拟定培养方案
外植体预处理
外植体无菌接 种
形态发生和植株再生
器官发生：芽或芽原基起源于培养组织中比较表 层的细胞，即外起源。根原基发生在组织较深处，即 内起源。两者之间一般没有什么联系，呈现单向极性。 胚状体发生：极大多数体细胞胚起源于单细胞， 形成的胚状体具有双极性，在其发育的早期阶段，在 方向相反的两端分化出茎端和根端，其维管组织与母 体植物或外植体的维管组织通常没有联系。胚状体维 管组织呈独立的Y形。
2、无菌苗的增殖
优缺点： 第一、二种途径的好处是增殖速度快，但会产生变 异， 第三种途径的好处是不会产生变异，能保持品种优 良特性，且方法简便，可在各种植物上使用，但增殖速 度不如前二者。 若用于育种，以第一、第二种途径有利，而用于良 种快速增殖，以第三种途径有利，主要是要保证良种的 优良品性，不产生变异。目前已广泛采用，每年每个芽 可增殖10万株乃至上百万株。
⑵腋芽增殖的原理
高等植物的每个叶腋中都有腋芽存在，通常由于 顶芽的存在，顶端优势阻止腋芽的生长，但在一定的 条件下可以使它生长，如除去顶芽或使用生长激素， 可以解除顶端优势，腋芽便不断分化和生长，逐渐形 成芽丛。 若反复切割这些腋芽和移植到新的培养基中继代 培养，就可在短期内得到大量的芽。
⑶影响增殖成功的关键因素
第二节 植物营养器官培养
植物根段培养 植物茎段培养 植物叶培养
一、离体根的培养
植物根段培养是指以植物的根切段为外植体进行培 养的技术。 （一）根无性系的建立 来自无菌种子发芽产生的幼根切段或植物根系经灭 菌处理后的切段，可以以两种方式进行培养，建立根的 无性繁殖系。
一、离体根的培养
1、根的直接增殖 1）根无性繁殖系的建立 将种子进行表面消毒，在无菌条件下进行无菌萌 发，待根伸长后从根尖一段切取长1.0cm的根尖，接种 培养基中。 这些根的培养生长很快，番茄根每天约生长10mm， 几天后发育出侧根。待侧根生长约一周后，即可切取 侧根的根尖进行扩大培养，它们又迅速生长出侧根， 又可切下进行培养，如此反复，就可得到从单个根尖 衍生而来的离体根的无性系。 2）培养条件：黑暗培养，温度为25—27℃
一、离体根的培养
3）培养基 离体根培养所用的培养基很多，多为无机离子浓 度低的White培养基，其他培养基如MS、B5培养基等也 可采用，但必须将其离子浓度稀释到2/3或1/2。
一、离体根的培养
4）培养方式 离体根的培养方式有三种类型。 第一种固体培养法，即将根尖接种在固体培养基 上，根依靠培养基中的养分和生长物质而不断生长。 第二种是液体培养法，把根尖接种在无琼脂的液 体培养基中，经常振荡使根获得充足的氧气。 第三种是固体-液体培养法，就是把根基部插入固 体琼脂培养基中，根尖浸在液体培养基中，根尖生长 而根不断的伸长和分枝。
（二）根、块茎、鳞茎的灭菌
生长在土中，灭菌困难，以受损伤。 灭菌前仔细清洗，加大灭菌剂浓度或延长灭菌时间。
无菌外植体的获得 （三）花蕾的灭菌
未开放的花蕾中的花药为花被包裹，处于无菌状态， 采摘后可直接灭菌。 70%酒精浸泡10-30s—0.1-0.2%氯 化汞浸泡3-10min，（或1%次氯酸钠浸泡10-20min）—灭 菌水冲洗3-5次—无菌滤纸吸干—分割—接种。
二、茎段培养
茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的 外植体（包括块茎、球茎、鳞茎等在内的幼茎切段） 的无菌培养。 目的:1、快速繁殖，2、探讨茎细胞的分裂潜力和全能 性，以及诱发细胞变异，筛选突变体。 我们主要是介绍用于快速繁殖为目的的茎段培养。
茎段
茎尖取 材有限，可 采用带节或 不定牙的茎 段进行培养。
第三章 植物器官和组织培养
植物器官和组织培养的基本程序 植物营养器官培养 植物繁殖器官培养 植物组织培养
组织培养步骤图
（1）准备阶段 查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合 实际制定出切实可行的培养方案。 根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段 所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。
（2）外植体的选择与消毒
选择合适的部位作为外植体，采回后经过处理，然后进 行消毒处理。
将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块， 或剥离出茎尖、挑出花药，接种到启动培养基上。
（3）启动培养 接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使 外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋 芽直接萌发形成芽。 将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基 或形成胚状体，最后发育形成再生植株。 （4）增殖培养 分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的增殖培 养基经反复多次切割转接。 当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根， 另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的还要进行病 毒检测。
3、无菌苗的生根
这个阶段的目的是使再生的大量试管苗形成根系， 获得完整的植株，在前两阶段以长苗为目的，使 用的生长激素往往不利于生根的发生和生长，因 此在这个阶段，必须创造一个适于根的发生和生 长的条件。 主要是降低或除去细胞分裂素，而加入或增加生 长素。
影响生根成功的关键因素
①培养基的盐浓度 试管苗的生根，对基本培养基的种类要求不严， 一般的培养基都可用于诱导生根，但对其含盐浓度 要适量加以稀释。前面的几种培养基中，除White培 养基外，都富含N、P、K盐，它们都抑制根的发生。 因此，应将它们降低到1/2、1/3或1/4，甚至更低的 水平。就可得到理想的生根结果。
Murashige(1974)曾提出用组织培养法进行植物快速繁 殖三个阶段的概念， 第一阶段——外植体成苗； 第二阶段——繁殖体增殖； 第三阶段——移植于土壤中长根。 这三个阶段对于不同植物来说有不同的反应，应用于 草本植物是成功的，但对木本植物来说，最大的困难是
第三个阶段。
1、无菌苗的建立
茎段培养用于快速繁殖的优点
培养技术简单易行，繁殖速度较快，每年可增殖 105-1012株苗； 加速良种和珍贵植物的繁殖，芽生芽方式增殖的 苗木质量好，且无病，性状均一； 解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖 的问题，且可节省种株； 试管苗便于运输和防止种苗带菌传播，有利于国 际种质交流； 试管苗可用于保存某些难以用种子保存的种质资 源。
（四）果实和种子的灭菌
表皮有茸毛或蜡质，需在灭菌剂中加入几滴土温-80。 果实70%酒精浸泡数秒—0.1-0.2%氯化汞浸泡3-10min， （或1%次氯酸钠浸泡10-20min）—灭菌水冲洗3-5次—无 菌滤纸吸干—分割—接种。
初代培养物的建立 （一）无菌环境
培养基、接种器械、超净工作台、接种室环境、抗 生素物质（去除侵入组织内部的病菌。见表）
外植体形态发生形成完整植株的途径
（一）外植体-愈伤组织-完整植株。 具体又可分为三种： 1、愈伤组织-同时长芽和根-植株。 2、愈伤组织-茎-根-植株。 3、愈伤组织-根-芽-植株。 4、愈伤组织-体细胞胚-植株
（二）外植体-胚状体-植株。可从以下几种培养物中产生： 1、器官上发生。 2、愈伤组织上发生。 3、游离单细胞发生。 4、小孢子发生。 诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整。 （三）外植体-直接形成根与芽-植株。如茎尖培养
启动培养
分化出芽、胚 状体或原球茎
继代增殖培养
生根培养
炼苗移栽
成活供生产使 用
培养基配制灭菌
植物组织培养的一般程序
第一节
植物器官和组织培养的基本程序
无菌外植体的获得 初代培养物的建立 形态发生和植株再生 培养产物的观察记载
无菌外植体的获得 （一）茎尖、茎段、叶片的灭菌
清水冲洗，吸干—0.1-0.2%氯化汞浸泡2-10min， （70%酒精浸泡数秒，10%次氯酸钙浸泡10-20min或2% 次氯酸钠浸泡15-30min）—灭菌水冲洗3-5次—无菌滤 纸吸干—分割—接种。
⑶影响成功的关键因素
B、生长素 生长素虽不能促进腋芽增殖，但可改善苗的生长， 因此，许多种植物也都加入一定的生长素类物质。其中 使用最多的是NAA，依次为IBA、IAA和2，4-D，它们的 使用浓度多为0.5mg/L以下。
⑶影响成功的关键因素
C、GA GA对芽的伸长有促进作用，故常加入少量的GA，使 用浓度为0.5mg/L。 D、光照 光照条件也十分重要，这一阶段必须保持适当的光 周期(16小时光照)和光强(2000-3000Lux)，以利芽的再 生和生长。
一、离体根的培养
2、根的间接增殖 第一步在脱分化培养基上诱导形成愈伤组织，如胡杨 的根段培养，可诱导形成白色愈伤组织。 第二步在再分化培养基上诱导形成芽的分化，如胡杨 从绿色愈伤组织分化出小植株。
胡 萝 卜 根 培 养
一、离体根的培养
（二） 离体根生长的营养要求
1、无机成分 要求培养基中有全部必要元素， 因为它是离体生长所需要的，一般的为MS、B5培 养基。 2、氮源 氮源有铵态氮、硝态氮和可溶性有机 氮如氨基酸或酰胺等，其中以硝态氮的效果最好。 加入含各种氨基酸的水解酪蛋白，能促进离体根 的生长。
②生长素的浓度