实验七、荧光显微镜及激光扫描共聚焦显微镜使用
实验七、荧光显微镜及激光扫描共聚焦显微镜使用资料教程
3. 暗视野显微镜观察蛙血细胞（示范）
4. 观察人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（HE染色）
五、注意事项
1. 荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观 察。
Laser Scanning Confocal Microscope
一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理
1. 普通荧光显微镜的不足
2. 使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅 图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使 用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61 λ/ NA ）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微 镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下 方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧 光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以 外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是 层次区别的PI AMCA Hoechst 33258 FITC Acridine Orange Acridine Yellow CY3 TRITC Propidium Iodide
激发波长 372 350 365 490 490 470 552 541 530
发射波长 456 450 465 520 590 550 565 572 615
2. 共聚焦扫描显微镜的成像原理
采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的 光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光 路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到 探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明 针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相 对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的 透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自 焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上 方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光 逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光 点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕 上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。
Zeiss激光扫描共聚焦显微镜操作手册
Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册目录：1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明2 系统的使用开机顺序软件的快速使用说明显微镜的触摸屏控制关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成;系统组成及光路示意图：电脑工作站激光器电动荧光显微镜扫描检测单元实物照片说明：电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用开机顺序1打开稳压电源绿色按钮等待2 分钟电压稳定后,再开其它开关2主开关MAIN SWITCH “ON”电脑系统SYSTEMS/PC “ON”扫描硬件系统COMPONENTS “ON”3打开电动显微镜开关打开荧光灯开关注：具有5 档光强调节旋钮4Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约15分钟,将激光器扳钮由“Standby”扳至“Laser run”状态,即可正常使用5打开电脑开关,进入操作系统注：键盘上也具有电脑开关软件的快速使用说明1电脑开机进入操作系统界面后,双击桌面共聚焦软件ZEN 图标2进入ZEN 界面,弹出对话框：“Start System”——初始化整个系统,用于激光扫描取图、分析等;“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件,用于已存图像数据的处理、分析;3软件界面：1 功能界面切换：扫描取图Acquisition、图像处理Processing、维护Maintain注：Maintain仅供Zeiss专业工程师使用2 动作按钮；3 工具组多维扫描控制；4 工具详细界面；5 状态栏；6 视窗切换按钮；7 图像切换按钮；8 图像浏览/预扫描窗口；9 文档浏览/处理区域；10 视窗中图像处理模块动作按钮：Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示;Start ——开始扫描单张图片或一个实验流程1组图片,如XYZ、XYT 等;Stop ——暂停/结束扫描;New ——建立一个新图像扫描窗口/文档;激光连接状况检查眼睛观察/相机/共聚焦LSM 光路切换ZEN软件界面右上角：Ocular ——通过观察筒用眼睛观察;激光安全保护装置自动阻断激光、保护眼睛; Camera ——光路切换至相机;LSM ——共聚焦扫描成像光路;显微镜设置：“Ocular”——>“Light Path”——>点击物镜图标,选择物镜——>样品聚焦;透射光控制Transmitted Light Control反射光光闸控制Reflected Light Shutter荧光激发块选择Reflector共聚焦LSM 扫描设置点击“LSM”ZEN软件界面右上角,系统切换至共聚焦扫描光路：光路设置：Smart Setup ——自动预设光路选取“荧光探针”、“颜色”、扫描方法,应用“Apply”;注：Fastest 为最快速扫描,多条激光谱线同时扫描;Best signal 为最佳信号扫描,多条激光谱线顺序扫描;Best compromise 为兼顾速度与信号的折中式扫描;扫描图像参数设置：每个通道的精细调节：包括：1Pinhole的调节一般设为1AU;该值越大,则信号越强,但共聚焦图像效果会降低;原则上, 在保证图像质量的前提下,该值越接近于1AU 越好；2Master Gain的调节增大则信号和噪音都增强,减小则信号和噪音均减小;原则上,在保证图像质量的前提下,Gain值越小越好；3Digital Offset的调节可扣除背景噪音,但标本信号也有一定程度的扣除;原则上,在保证图像质量的前提下,Digital Offset值越接近于0越好；4Digital Gain的调节增大则信号和噪音都增强,减小则信号和噪音均减小;原则上,在保证图像质量的前提下,Gain值越接近于~越好；5另外,对于每个通道,需要灵活调节激光的强度激光强度越高,则信号越强,但噪音也相应增强,同时标本更容易被漂白或淬灭;原则上,在保证图像质量的前提下,激光强度越低越好; 选择可连续扫描、一边预览图像效果、一边精细调节各个通道的扫描参数;如果预览图像的效果可以,则先“Stop” ,再点击“Single” 或“Start”即可完成图像的扫描;图像的保存：三种方法：1“File”菜单下,“Save”或者“Save AS”;2点击右下角按钮;3点击工具栏按钮;如图所示另外,通过“File”菜单下的“Export”,也可将图像以其它格式输出;显微镜的触摸屏控制显微镜可由TFT 液晶触摸屏进行控制：由触摸屏“Home/主页”进入“Control/显微镜控制”界面,触摸屏常用控制界面：TFT触摸屏控制直观、便捷;Objectives物镜控制TL透射光光闸RL反射光光闸Reflector荧光激发块控制荧光观察时,需要选择相应的荧光激发块或者激发波长、发射波长相近的荧光激发块Light path光路设置触摸控制,可将光路切换至“Eyepiece”目镜观察筒,或者将光路切换至左侧共聚焦光路“Sideport L”,或者将光路切换至前侧“Frontport”相机;关机顺序：1关闭软件：主菜单“File”——>“Exit”,退出共聚焦软件ZEN;2关闭主电脑操作系统、显示器电源;3关闭荧光灯电源;4关闭电动显微镜电源;5关闭Ar 激光器：先将扳钮从“Laser run” 扳到“Standby” 状态；再将钥匙逆时针从“—”旋转到“O”状态；等待约8-10分钟、激光器风扇停止转动后切记,将主开关按钮按到“OFF”;6扫描硬件系统COMPONENTS “OFF”电脑系统SYSTEMS/PC “OFF”主开关MAIN SWITCH “OFF”7等灯箱充分冷却后,再放防尘罩;8如果系统长时间超过5个小时不使用,则关闭稳压电源;3 系统的维护主要注意事项如下：1打开稳压电源时,应等待2 分钟电压稳定后,再开其它开关;2严格遵守激光器的开、关流程详见“、开/关机顺序”;3如果使用过油镜,或者物镜表面较脏,则需用擦镜纸擦干净物镜的前表面清洁液使用无水乙醇和无水乙醚的混合液,混合比例：无水乙醇30%、无水乙醚70%;4不使用荧光时,不打开荧光灯;避免频繁开/关荧光灯;5必须等灯箱充分冷却后,再小心地盖上防尘罩;6显微镜可由TFT触摸屏控制,使用触摸屏时注意：①手指保持清洁、干燥状态,并且为了保证他人使用安全,触摸时严禁配戴有可能接触污染物或危险样品的手套；②触摸屏已足够灵敏,不要大力按压触摸屏；③不要旋转、插拔触摸屏;7刻录图像数据资料：应使用刻录光驱刻录,实验前应准备好刻录光盘; 切记：为了防止计算机病毒,严禁在共聚焦电脑上使用U盘、硬动硬盘或者上网8未经授权,严禁自行安装任何软件9实验室温度应保持在22℃±2℃,湿度40%-60%;10避免空调直接对着显微镜吹风;11整个实验过程应注意保持显微镜周围环境清洁;。
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构 显微镜操作规程
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构显微镜操作规程（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析仪器。
紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。
成像原理接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
两者的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。
这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。
以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面的共聚焦图像。
每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。
由于焦点处的光强宏大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。
把X—Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。
即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。
激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。
基本结构（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。
荧光显微镜荧光显微镜（Fluorescencemicroscope）及其操作
荧光显微镜荧光显微镜（Fluorescencemicroscope）及其操作荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。
它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。
是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。
原理编辑本段回目录某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态；当其从激发态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出来，由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光部就是荧光(fluorescence)。
所谓荧光就是某些物质在一定波长光（如紫外光）的照射下、在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光。
由此可见，被照射物质产生荧光必须具备以下两个条件：①物质分子（或所特异性结合的荧光染料）必须具有可吸收能量的生色团；②该物质还必须具有一定的量子产率和适宜的环境（如溶剂、pH、温度等）。
荧光显微术是利用荧光显微镜结可发荧光的物质进行观测的一种实验技术。
某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时, 就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如见光)，这种光就称为荧光。
有些生物体内的物质受激发光照射后可直接产生荧光, 称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不能产生荧光，但它吸收荧光染料后同样却能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后便可发出桔红色荧光。
荧光显微镜具特殊光源（多为紫外光光源），提供足够强度和波长的激发光，诱发荧光物质发出荧光。
在视场中所所观察到的图像，主要是样品的荧光映像。
（一）光源现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。
Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜 操作手册
Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册目录：1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明2 系统的使用2.1 开机顺序2.2 软件的快速使用说明2.3 显微镜的触摸屏控制2.4 关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。
系统组成及光路示意图：电脑工作站激光器电动荧光显微镜扫描检测单元实物照片说明：电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用2.1 开机顺序（1）打开稳压电源（绿色按钮）等待2 分钟（电压稳定）后，再开其它开关（2）主开关[ MAIN SWITCH ]“ON”电脑系统[ SYSTEMS/PC ]“ON”扫描硬件系统[ COMPONENTS ]“ON”（3）打开[ 电动显微镜开关]打开[ 荧光灯开关]（注：具有5 档光强调节旋钮）（4）Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约15分钟，将激光器[ 扳钮] 由“Standby”扳至“Laser run”状态，即可正常使用（5）打开[ 电脑开关]，进入操作系统注：键盘上也具有[ 电脑开关]2.2 软件的快速使用说明（1）电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件ZEN 图标（2）进入ZEN 界面，弹出对话框：“Start System”——初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。
“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件，用于已存图像数据的处理、分析。
（3）软件界面：1 功能界面切换：扫描取图（Acquisition）、图像处理（Processing）、维护（Maintain）（注：Maintain仅供Zeiss专业工程师使用）2 动作按钮；3 工具组（多维扫描控制）；4 工具详细界面；5 状态栏；6 视窗切换按钮；7 图像切换按钮；8 图像浏览/预扫描窗口；9 文档浏览/处理区域；10 视窗中图像处理模块动作按钮：Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示。
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
18Biblioteka THANK YOU19
7
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
8 8
弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
10
11
12
Phe
红树植物秋茄
与GC-MS检测浓度相符
Pyr
12
13
黑麦草
洋葱
13
北京化工 大学
14
15
15
16
16
A surfactant template-assisted strategy for synthesis of ZIF-8 hollow nanospheres
17
(a) Preparation process for HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres. (b,c) CLSM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm). (d,e) SEM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm; scale bar 100 nm).
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
共聚焦显微镜使用原则
共聚焦显微镜使用原则共聚焦显微镜（Confocal Microscope）使用原则：1. 标本准备：在使用共聚焦显微镜前，确保标本制备完好无损。
清洁标本并使用适当的固定剂固定样本。
2. 配置参数：根据所需观察的标本类型和目的，设置合适的共聚焦显微镜参数。
选择适当的荧光染料和滤光片以增强信号和降低背景噪声。
3. 调整焦距：使用共聚焦显微镜时，要注意调整焦距以确保所需的图像清晰可见。
通过检查目标标本来确保镜头与标本之间的距离。
4. 控制激光功率：共聚焦显微镜使用激光扫描来获得显著的信号。
应注意控制激光功率，以避免对标本造成损伤。
5. 点扫描模式：使用共聚焦显微镜时，常常采用点扫描模式以获取高分辨率图像。
在扫描过程中，确保扫描速度适中，以保证图像质量。
6. 避免光纤碰撞：共聚焦显微镜通常使用光纤将激光引导到样本上。
在操作时，避免光纤碰撞标本表面以及其他部件。
7. 后处理图像：共聚焦显微镜提供丰富的图像信息，然而，在后处理过程中可能需要进行图像叠加、3D重建和图像分析等操作以获得更多信息。
8. 定期维护与校准：共聚焦显微镜是精密的科学仪器，需要定期进行维护和校准。
清理光路、校准扫描仪和检查系统所有部件的工作状况是必不可少的。
9. 安全操作：在操作共聚焦显微镜时，请遵守实验室安全操作规程。
戴好个人防护装备，避免直接暴露在激光束下，并注意样本的处理和废液的处理。
10. 文档记录：对于使用共聚焦显微镜获得的数据和图像，及时进行记录和保存。
详细记录样本信息、仪器参数和获取的图像等，以便后期分析和引用。
总之，遵循这些共聚焦显微镜使用原则，您可以获得高质量的图像，并在生命科学、医学等领域中获得更深入的洞察力。
荧光显微镜的使用流程
荧光显微镜的使用流程一、前言荧光显微镜是一种高端的显微镜，广泛应用于生物学、医学等领域。
本文将详细介绍荧光显微镜的使用流程，包括准备工作、样品制备、仪器操作等方面。
二、准备工作1.检查仪器：首先要检查荧光显微镜是否正常工作。
确认灯泡是否亮着，光源是否正常，调整好滤镜等。
2.清洁仪器：使用前要清洁荧光显微镜，以确保样品不会受到污染。
可以用纯净水和酒精擦拭仪器表面和物镜。
3.调节目视系统：荧光显微镜的目视系统需要进行调节。
首先要调节目视系统的放大倍数和对焦，以便更好地观察样品。
三、样品制备1.选择适当的标记物：根据实验需求选择适当的标记物。
比如选择与待测蛋白质结合能力较强的荧光染料。
2.固定样品：将待测样品固定在载玻片上，并进行脱水处理。
可以在载玻片上加一滴PBS缓冲液，然后用吸水纸吸干，再滴上荧光染料。
3.封片：将载玻片和盖玻片封起来，以防止样品受到外界污染。
四、仪器操作1.调节荧光显微镜：首先要调节荧光显微镜的亮度和对比度。
可以通过调节荧光显微镜的滤镜来选择合适的波长。
2.选择放大倍数：根据需要选择合适的放大倍数。
一般情况下，使用40-100倍的物镜进行观察。
3.观察样品：将载玻片放在样品台上，并用目视系统进行对焦。
观察样品时要注意避免强光照射，以免影响荧光信号。
4.拍照记录：可以使用相机或者电脑软件对观察到的图像进行拍照记录。
五、数据分析1.图像处理：使用图像处理软件对拍摄到的图像进行处理，以增强对比度和清晰度。
可以使用Photoshop等软件进行处理。
2.数据统计：根据实验需求对数据进行统计分析，并得出结论。
六、注意事项1.避免强光照射：荧光显微镜对强光非常敏感，避免强光照射可以减少样品的损伤。
2.注意样品制备：样品制备过程中要注意防止样品受到污染，以保证实验结果的准确性。
3.仪器维护：荧光显微镜是一种高端仪器，需要定期进行维护和保养，以确保其正常工作。
七、结论本文详细介绍了荧光显微镜的使用流程，包括准备工作、样品制备、仪器操作等方面。
量子荧光成像实验报告
一、实验目的1. 了解量子点纳米晶体的荧光成像原理和特点。
2. 掌握量子荧光成像实验的基本操作步骤。
3. 通过实验，学会利用量子点纳米晶体进行荧光成像，并对实验结果进行分析。
二、实验原理量子点纳米晶体是一种具有优异光学性能的荧光染料，能够吸收光子并几乎立即重新发射出更长波长的光子。
在荧光成像实验中，量子点纳米晶体作为荧光标记物，通过标记生物分子或细胞，实现对生物样品的荧光成像。
实验原理如下：1. 将量子点纳米晶体与生物分子或细胞结合，形成荧光标记物。
2. 将荧光标记物加入待测样品中，进行孵育。
3. 使用荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜等设备，对样品进行荧光成像。
4. 通过图像分析软件对荧光图像进行处理和分析，得到所需信息。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 量子点纳米晶体- 生物分子（如抗体、DNA等）- 待测样品- 标本固定液- 荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜2. 实验仪器：- 荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜- 荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜图像分析软件- 紫外-可见分光光度计- 培养箱- 电子天平四、实验步骤1. 将量子点纳米晶体与生物分子（如抗体）进行偶联，制备荧光标记物。
2. 将待测样品进行固定，加入荧光标记物，进行孵育。
3. 用清洗液清洗样品，去除未结合的荧光标记物。
4. 使用荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对样品进行荧光成像。
5. 通过图像分析软件对荧光图像进行处理和分析，得到所需信息。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 成功制备了荧光标记物。
- 成功实现了待测样品的荧光成像。
- 成功分析了荧光图像，得到所需信息。
2. 结果分析：- 量子点纳米晶体在荧光成像实验中表现出优异的性能，具有高亮度、高稳定性和良好的生物相容性。
- 通过荧光成像实验，成功实现了待测样品的标记和成像，为后续的研究提供了有力支持。
六、实验总结1. 本实验成功制备了荧光标记物，并实现了待测样品的荧光成像。
激光共聚焦显微镜方法步骤
激光共聚焦显微镜方法步骤
激光共聚焦显微镜（简称CLSM）是一种高分辨率的显微镜技术，常用于生物学、医学和材料科学领域。
下面我将从多个角度全面介
绍激光共聚焦显微镜的方法步骤。
1. 样品准备：
在进行CLSM观察之前，首先需要准备样品。
样品的准备包
括固定、染色和清洁等步骤。
固定样品可以使用化学试剂或生理盐水，染色则可以使用荧光染料或荧光蛋白等方法，以增强样品的对
比度和可见性。
2. 仪器设置：
在进行CLSM观察之前，需要对显微镜进行仪器设置。
这包
括选择合适的激光波长、光学滤波器和放大倍数等参数，以确保获
得清晰的荧光信号和高分辨率的图像。
3. 成像扫描：
接下来是进行成像扫描。
CLSM使用激光束来扫描样品，并
收集样品发出的荧光信号。
通过逐点扫描和逐层堆叠，可以获得样
品的三维图像。
4. 数据分析：
获得图像后，可以进行数据分析。
这包括图像处理和三维重
建等步骤，以获取更多关于样品结构和组织的信息。
5. 结果解释：
最后是结果的解释。
根据获得的图像和数据，可以对样品的
结构和功能进行解释和分析，从而得出科学研究或临床诊断的结论。
总的来说，激光共聚焦显微镜的方法步骤包括样品准备、仪器
设置、成像扫描、数据分析和结果解释。
这些步骤需要精确操作和
细致处理，以获得准确、可靠的显微镜图像和数据。
leica共聚焦显微镜使用说明
Leica共聚焦显微镜使用说明Step 1: 打开PC电源——“1”Step 2: 打开汞灯控制开关——“2”Step 3: 打开中控盒——“3”Step 4: 打开计算机主机——“4”，启动计算机。
注：计算机操作系统启动后方可继续开机！！Step 5: 顺序打开激光器电源Scanner—“5”，激光冷却系统LASER Ar/ArKr—“6”★注：须确认冷风开启后方可打开激光电源！！！！！Step 6: 将上图虚线框中激光功率控制旋钮——“6.5”顺时针旋转60°左右。
Step 7: 将上图所示488 nm激光管开关——“7”钥匙沿顺时针旋转约120°至显示灯亮，再将钥匙旋回竖直位置Step 8: 依次将上图所示543/594 nm激光管开关——“8”和633 nm 激光管开关——“9”钥匙沿顺时针旋转约90°至显示灯亮。
Step 9:依次打开半导体激光器电源——“10”和405 nm激光管开关——“11”，（“11”的开启方式同“8”、“9”。
）Leica共聚焦显微镜关机顺序及注意事项Step 1: 关闭软件→拷贝Data→关闭计算机Step 2: 依照开机顺序倒序关闭各个开关，由”11”→”7”, ”5”→”1”。
★注：（1）冷风——”6”不能立即关闭！！须在关闭所有硬件设备30min 后方可关闭，以使激光管完全冷却，延长使用寿命。
（2）PC电源——“1”须在电脑确定关闭后方可关闭！！数据采集Step 1: 实验前扫描样本片观察激光通路是否正常工作。
Step 2: 上样，须轻起轻落科勒照明系统，选择合适倍数物镜，通过FLUO键选择相应荧光通道，调节载物台和焦距，找到合适视野。
Step 3: 点击由Visual→Scan，点击选择扫描模式，如xy, xyz, xyt, xyzt, xyλ etc..点击选择扫描格式（一般为默认值512*512）。
Step 4: 点击打开Beam path setting窗口，对光路和检测器进行设置。
激光扫描共聚焦显微镜操作手册
激光扫描共聚焦显微镜（A1R-si）操作指南目录第一章：Ti-E 显微镜操作2-7 显微镜光路调节和照明注意事项 6Ti-E 物镜，DIC 插片，DIC 棱镜对照表7第二章：共聚焦开关机8-10 第三章：共聚焦图像拍摄1-38NIS-Elements C 软件开启和操作界面简介1-15NIS-Elements C 的实时图像获得基本操作16-23图像拍摄24-27探测模式（标准探测器）设置28-38 第四章: 图像的保存和查看39-42 第五章：图像分析43-46 附件一、多维拍摄功能和操作方式介绍47-51附件二：图像格式批量转换操作52-53第一章Ti-E 显微镜操作指南（一）认识显微镜各个部件（1）滤光片：包括D---毛玻璃；NCB---色温（8）滤色块转盘（包括DIC 检偏器）；平衡片；ND---减光片；“G IF”---绿色滤（9）手动荧光光闸；光片和用于PFS 的红外滤光片；（10）电动焦距调节旋钮；（2）视场光阑；（11）ND 减光片；（3）聚光器升降旋钮；（12）遥控器；（4）起偏器（DIC 用）；（13）透射光电源；（5）聚光器对中旋钮；（14）汞灯荧光光源；（6）孔径光阑；（15）PFS 控制器（7）聚光器模块（包括明视场，DIC）；（16）HUB 控制器遥控器示意图(根据具体配置有些图标可能不显示)1）物镜切换按钮；2）滤光块，DIC 检偏器切换按钮；3）DIC 检偏器快速切换按钮；4）光路端口切换按钮；5）PFS 开关控制按钮；6）聚光器转盘切换按钮；7）透射光源控制按钮*。
*请注意：CNTL 按钮灯亮，则可以通过遥控器或电脑控制软件来调节透射光源强度，此时显微镜底座左侧光源开关和调节旋钮锁定；CNTL 功能关闭，可以通过显微镜底座开关和旋钮来控制透射光源。
前面板示意图1）状态显示屏；2）PFS 开关按钮和PFS 聚焦状态指示灯（需要选购PFS 部件）；3）光路端口切换按钮；4）中间变倍旋纽；侧面板示意图1）调焦旋钮2）粗微调切换按钮3）物镜切换按钮；4）滤光块，DIC 检偏器切换按钮5）透射光光源开关（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此按钮无效）；6）透射光量度调节旋钮（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此旋按钮无效）；7）物镜复位；8）物镜向下移动2 毫米；注意：在使用显微镜之前，要把主机底座右后端的黑色HUB 控制器（显微镜示意图15 位置）右侧的电源开关打开。
Zeiss激光扫描共聚焦显微镜操作手册
Zeiss激光扌：］描共幣茂显微锻操作于•冊目录：1系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明2系统的使用2.4开机顺序-22软件的快速使用说明2.3显微镜的触摸屏控制2.4矢机顺序3系统的维护「系统的组成激光扫描共惡焦显微镜系统主要由：电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器・电脑工作站及各相矢附件组成。
系统组成及光路示意图：电脑工作站激光器电动荧光显微視扫描检测单元实物照片说明：电动荧光显微視扫描检测单元CO2培养系统控制器激光器电脑工作站2系统的使用2.1开机顺序(1) 翻开稳压电源(绿色按钮)等待2分钟(电压稳定)后，再开其它开矢(2) 主开矢［MAIN SWITCH〕"ON 电脑系统［SYSTEMS/PC ］9N扫描硬件系统［COMPONENTS “ON(3) 翻开［电动显微鏡开矢］翻开「灾光灯开矢］(注：具有5档光强调节旋钮)(4) Ar离子激光器主开矢“ON顺时针旋转钥匙至“一’预热等待约15分钟，|将激光器［扳钮］由Standby扳至〕“ Laser run状态;即可正常使用(5) 翻开［电脑开矢］，逬入操作系统注：键盘上也具有［电脑开矢〕2.2软件的快速使用说明(4 )电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件ZEN图标(2) 逬入ZEN界面，弹出对话框：“ Start System 初始化整个系统，用于激光扫描取图“Image Process ing 不启动共惡焦扫描硬件，用于已存图像数据的处理、分析。
(3) 软件界面：1功能界面切换：扫描取图(Acquisition)、图像处理(Processing)・维护(Maintain)(注：Maintain仅供Zeiss专业工程师使用)2动作按钮；3工具组(多维扫描控制)；4工具详细界面；5状态栏；6视窗切换按钮；7图像切换按钮；8图像浏览/预扫描窗口；9文档浏览/处理区域；10视窗中图像达理模块动作按钮：Sin g I e ------------------------- 扫描单张图片♦并在图像预览窗口显示。
Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜 操作手册
Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册目录：1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明2 系统的使用2.1 开机顺序2.2 软件的快速使用说明2.3 显微镜的触摸屏控制2.4 关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。
系统组成及光路示意图：电脑工作站激光器电动荧光显微镜扫描检测单元实物照片说明：电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用2.1 开机顺序（1）打开稳压电源（绿色按钮）等待2 分钟（电压稳定）后，再开其它开关（2）主开关[ MAIN SWITCH ]“ON”电脑系统[ SYSTEMS/PC ]“ON”扫描硬件系统[ COMPONENTS ]“ON”（3）打开[ 电动显微镜开关]打开[ 荧光灯开关]（注：具有5 档光强调节旋钮）（4）Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约15分钟，将激光器[ 扳钮] 由“Standby”扳至“Laser run”状态，即可正常使用（5）打开[ 电脑开关]，进入操作系统注：键盘上也具有[ 电脑开关]2.2 软件的快速使用说明（1）电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件ZEN 图标（2）进入ZEN 界面，弹出对话框：“Start System”——初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。
“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件，用于已存图像数据的处理、分析。
（3）软件界面：1 功能界面切换：扫描取图（Acquisition）、图像处理（Processing）、维护（Maintain）（注：Maintain仅供Zeiss专业工程师使用）2 动作按钮；3 工具组（多维扫描控制）；4 工具详细界面；5 状态栏；6 视窗切换按钮；7 图像切换按钮；8 图像浏览/预扫描窗口；9 文档浏览/处理区域；10 视窗中图像处理模块动作按钮：Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示。
实验荧光显微镜的使用演示文稿
现在是29页\一共有51页\编辑于星期六
反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜
标本
现在是30页\一共有51页\编辑于星期六
汞灯
激发滤色镜
反射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜
紫外线 保护罩
激发滤色镜 孔径光栏（FS） 视场光栏（AS）
分色镜
汞灯
现在是31页\一共有51页\编辑于星期六
荧光素的特性
荧光素
激发波长 发射波长
DAPI
372
456
AMC A
350
450
Hoe chst 33258
365
465
FITC
490
520
Acridine O range 4 9 0
590
Acridine Ye llow
470
550
C Y3
552
565
TRITC
541
572
Propidium Iodide 5 3 0
转变为高能状态，再回到低能状态时释放出 的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
现在是10页\一共有51页\编辑于星期六
荧光的性质
保持固有的荧光特性
n荧光波长＞激发波长
n荧光强度极小于激发光的强度
n有不同程度的衰减 n荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效 率
现在是11页\一共有51页\编辑于星期六
暗场聚光镜
现在是6页\一共有51页\编辑于星期六
汞灯箱
激发滤色镜
透射荧光显微镜原理
目镜
透射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
物镜
暗场聚光镜
激光共聚焦显微镜原理和操作
激光扫描共焦显微镜应用
2)溶酶体 Lysosome 中性红 541/640: 微偏碱性, 可标记溶酶体等酸性器官 为非特异性 AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活细胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red 3)内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特异性, 较高浓度标记内质网, 较低浓度标记线粒体 4)高尔基体 Golgi apparatus
激光扫描共焦显微镜技术
• 技术指标（Leica TCS SP2) :
1. xy分辨率比传统显微镜小1.4x 传统显微镜: Rxy=0.61/NA （0.25 mm ) Confocal: Rxy=0.4/NA（0.18 mm ) 2. 样品的最大厚度: 取决于: 物镜的NA、物镜的工作距离 激光的穿透力、样品的透明度 Z轴的最大移动范围(166mm、Z-wide) 3. 样品的最小光切厚度: (载物台最小移动距离为40nm） 取决于: 物镜的NA、针孔大小 Z轴的最小移动步距: 40nm Z轴的分辨率: 0.35 mm
激光扫描共焦显微镜应用
应用
• 定位、定量 • 三维重组 • 动态测量 活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化 测量 (Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) 自由基的检测 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位
激光扫描共焦显微镜应用
• • • • • • 活细胞内H+浓度（ pH值）的测量 线粒体膜电位的测量 荧光漂白恢复（FRAP）的测量 笼锁解笼锁的测量 荧光能量共振转移（FRET）的测量 其他应用
2)细胞膜表面受体
Zeiss激光扫描共聚焦显微镜LSM700操作说明-cai讲解
ÓÉ Foxit PDF Editor ±à¼-°æȨËùÓÐ (c by Foxit Software Company, 2004 - 2007½öÓÃÓÚÆÀ¹À¡£德国Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册制作：制作：Zeiss 光学仪器（光学仪器（上海）上海）国际贸易有限公司2011年6月目录：目录：系统组成及光路示意图实物照片说明实物照片说明2.1 开机顺序2.2 软件的快速软件的快速使用快速使用说明使用说明2.3 显微镜的显微镜的触摸屏控制2.4 关机顺序激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：电动荧光显微镜、电动荧光显微镜、扫描检测单元、扫描检测单元、激光器、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。
电脑工作站及各相关附件组成。
系统组成及光路系统组成及光路示意图组成及光路示意图：示意图：电动荧光显微镜扫描检测单元激光器电脑工作站 ½öÓÃÓÚÆÀ¹À¡£°æȨËùÓÐ (c by Foxit Software Company, 2004 - 2007ÓÉ Foxit PDF Editor ±à¼-实物照片说明：实物照片说明：电动荧光显微镜扫描检测单元CO 2培养系统控制器激光器电脑工作站ÓÉ Foxit PDF Editor ±à¼-°æȨËùÓÐ (c by Foxit Software Company, 2004 - 2007½öÓÃÓÚÆÀ¹À¡£2.1 开机顺序（打开稳压电源（ 1）打开稳压电源（或拖线板的电源）（2）打开 [扫描载物台开关 ][ 电动显微镜开关 ]打开 [ 荧光灯开关（注：具有荧光光强调节旋钮具有荧光光强调节旋钮）旋钮）（3）打开 [ 电脑开关 ]，进入操作系统注：键盘上也具有 ]（4）打开激光器电源开关，将激光器上的钥匙转到水平位置ÓÉ Foxit PDF Editor ±à¼-°æȨËùÓÐ (c by Foxit Software Company, 2004 - 2007½öÓÃÓÚÆÀ¹À¡£2.2 软件的快速使用说明（1）电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件ZEN 图标（2）进入ZEN 界面，弹出对话框：“Start System”——初始化整个系统，用于激光扫描取图、——分析等。
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四、实验步骤
1. 取涂有细胞的载玻片（细胞涂在中间），冷丙酮40C固定 10 min; 2. PBS漂洗2次，每次3 min; 3. 滴加DAPI溶液100 ul室温孵育30 min; 4. PBS漂洗3次，每次5min; 5. 滴一小滴甘油/PBS封片剂(pH8.5，PBS:甘油=1:9，v/v)封 片; 6. 激光扫描共聚焦显微镜观察。
LSCM的基本特点
3. 共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用
细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞
骨架蛋白等基因表达产物）、DNA、RNA等 细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术） 细胞内氧自由基活性 细胞内钙离子浓度变化
膜电位
三、试剂与器材
青蛙 冷丙酮、 DAPI 、甘油/PBS封片剂、滤纸、吸管、载 玻片、盖玻片 激光扫描共聚焦显微镜
五、注意事项
注意染色时间 注意避光
六、作业与思考题：
试述激光扫描共聚焦显微镜成像基本原理，并 描述实验中所观察的现象
思考题：激光扫描共聚焦显微镜观察到的图象为什
么比普通的荧光显微镜的清晰度、层次感要强许多？
激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的应用
实验目的与要求
1. 掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像基本 原理及其在生命科学中的应用。
Laser Scanning Confocal Microscope
一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理
1. 普通荧光显微镜的不足
使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图 像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用 短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61 λ/ NA ）。 但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接 收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射 荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察 到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光 结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别 的重叠结构）。
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态 转变为高能状态，再回到低能状态时释 放出的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
荧光的性质
保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
荧光显微镜的优点和用途
五、注意事项
1. 荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观 察。 2. 使用荧光显微镜时要注意不要直接观察 激发光源，保护眼睛。 3. 暗视野显微镜要在光线尽量暗的环境下 观察。
六、作业与思考题： 1.描述在荧光显微镜下所观察到 的实验现象。
2.绘图比较人正常肝组织细胞和胞的刺激小 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
荧光素的特性
ÓÓÓ DAPI AMC A Hoe ch st 33258 FITC Acri di n e O ran ge Acri di n e Ye l l ow C Y3 TRITC Propi di u m Iodi de ¤· Ó ÓÓ ¨Ó ¤ · ¢ É ä ² ¨³ ¤ 372 350 365 490 490 470 552 541 530 456 450 465 520 590 550 565 572 615
实验七-1
细胞荧光染色观察与荧光显微镜的使用
（示范：细胞形态观察与暗视野显微镜的使用）
实验目的与教学要求
1.
掌握荧光显微镜的成像基本原理及 其使用； 掌握暗视野显微镜的成像基本原理 及其使用。
2.
一、荧光显微镜的成像原理
荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其 基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激 发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品 结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。
三、试剂与器材
青蛙、洋葱、人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片 （HE染色）
甲醇、1‰ 丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片
荧光显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜
四、实验内容和实验步骤
1. 蛙血细胞染色观察：取少许蛙血 → 常规血涂片→ 凉干 → 甲醇固定10 min → 1‰ 丫啶橙染色5 min → 水洗 → 室温 干燥（滤纸擦干玻片底面） → 荧光显微镜观察（先低倍后 高倍观察） （可在同一玻片上观察未荧光染色的血细胞） 2. 取洋葱→撕取一小片内表皮→平面单层铺展于玻片上→室温 凉干→1‰丫啶橙染色5min →水洗（用吸管，小心掉片） →室温干燥（或用滤纸擦干） →荧光显微镜观察 3. 暗视野显微镜观察蛙血细胞（示范） 4. 观察人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（HE染色）
荧光显微镜技术在生命科学研究中的应用
1. 对细胞结构或组分的定性、定位、半 定量研究。 2. 作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。
二、暗视野显微镜的成像原理
通过特殊的暗视野聚光器，使照明光线改 变途径，不直接进入物镜，而是倾斜地照 射到样品上，由样品表面的绕射光线入射 到物镜内，产生样品的衍射图象。
Confocal Principle
每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面， 这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学 薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强， 而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的 景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断 层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学 切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴） 扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经 过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维 图像。