螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度
藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度谭一心一、实验目的学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测纯度的方法。
二、实验原理1冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。
2盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。
3DEAE—纤维素：二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g功能基：二乙基胺乙基，弱碱性阴离子交换剂。
原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换，性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。
1.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。
装柱的方法分干装和湿装两种。
干装是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。
湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降到需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。
2.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。
加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2（体积越小越有利于提高分辨率）。
3.洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂（5cm），并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。
同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集）。
4.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。
螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程
螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程王艺生物技术二班20100404071、预处理将螺旋藻洗净晾干2、细胞破碎利用超声波破碎发破碎细胞，藻胆蛋白属于胞内蛋白质，要提取分离藻胆蛋。
首先必须要破坏藻类细胞的细胞壁、细胞膜，使藻胆蛋白以溶解的状态释放出来，并保持其活性。
超声波细胞粉碎仪破碎鱼腥藻细胞的最佳处理条件是超声仪的功率为600 W，超声时间为9min，固液比为1：8，破壁容量为20 mL。
也可与其他方法合用最大限度的破碎细胞。
3、提取（初步分离）（1）用超滤膜过滤藻胆蛋白提取液，获得藻胆蛋白粗制品。
用NaNO3，高渗一超滤法分离提纯藻胆蛋白，超滤时选用聚砜膜，在超滤过程中，无机盐和小分子蛋白质，包括小分子的藻毒素透过滤膜而去掉，特别适用于易产生水华的微囊藻脱毒，提高产品的安全性。
NaNO3高渗．超滤法是提取藻胆蛋白的简单易行的方法，用此法提取的藻胆蛋白是安全无毒的，且易于纯化，脱水方便，产品易于干燥。
（2）也可利用沉淀法将大量盐加到蛋白质溶液中，蛋白质胶粒凝结并沉淀析出，因此向细胞破碎液中加入盐溶液使蛋白质沉淀析出。
用25％硫酸铵可将藻红蛋白沉淀出，用30％硫酸铵可将藻蓝蛋白沉淀出，再用50％硫酸铵可将蓝藻蛋白沉淀出。
4、精制（高度纯化）离子交换层析法，用 DEAE一步纯化藻蓝蛋白；改变传统以离子强度作梯度洗脱的方法，根据藻红蛋白的等电点进行pH梯度洗脱，仅用DEAE一步层析，就将藻红蛋白纯度从1.042提高至5.6，回收率达67.33％。
用硅藻土545柱分级洗脱，再用该法纯化，从螺旋藻中获得初度为4.1的藻蓝蛋白和纯度为4.6的别藻蓝蛋白；将提取液上DE。
AE一52纤维素柱，提取纯度只有1.9，在上葡聚糖凝胶柱，则得到了纯度较高的蓝藻蛋白。
5、成品制作随着藻蓝蛋白制品的应用范围的不断扩大，对提取分离工艺的要求也逐渐提高。
不仅要有高的提取率、好的产品质量，而且要考虑省时、省力、自动化程度高。
利用缓慢冷却加晶种的方法使藻蓝蛋白结晶，干燥后进行保存。
藻蓝蛋白的提取
藻蓝蛋白的提取方法1.PBS 缓冲液直接提取法(1)配制pH=6.0 的PBS 缓冲溶液。
(2)称取20 g 螺旋藻粉, 加入步骤( 1) 配制的缓冲溶液200 mL, 然后将其放在磁力搅拌器上搅拌 4 h, 将搅拌后的溶液置于离心机中10 000 g 离心10 min, 收集蓝色上清液。
(3) 将离心得到的上清液加洗涤剂洗涤, 再将洗涤后溶液进行过滤。
(4)将滤液用旋转真空蒸发仪蒸干, 可得蓝色固体,将固体置于干燥器中 1 h, 待完全干燥后取出, 将其研磨成蓝色粉末样品。
2藻蓝蛋白的富集分离2 .1螺旋藻细胞的破碎准确称取0 .5 g 螺旋藻粉, 加入100 mL 的pH =7 .0 、0 .01 mol/L 的H3PO4 缓冲液, 采用反复冻融(3 次)的方法对藻体细胞进行破碎, 在显微镜下观察计数细胞破碎率在90%以上即可.将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于4 000 r/min 离心20min , 倾倒上清液可得到含藻蛋白的粗提液.在568 、620 和650 nm处测粗提液的吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2.2 盐析法沉淀藻蓝蛋白在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入一定量的(N H4)2SO4 溶液, 边加边搅拌, 以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性, 最终(NH4)2 SO4 溶液的质量浓度分别为20 %、40 %、50 %和60 %, 然后分别在20 ℃和40 ℃下对(NH4)2 SO4 盐析法沉淀藻蓝蛋白进行实验研究.在设置的温度和盐浓度下静置过夜, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min 离心20 min , 将离心得到的沉淀用1/4 上清液体积的H3PO4 缓冲液(pH =7 .0)溶解, 并倾倒于透析袋中, 再置于去离子水中透析24h(每隔4 h 更换一次去离子水);透析结束后, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min离心25 min ;用移液管抽取上清液,在568 、620 和650 nm 下测吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2 .3 等电点法沉淀藻蓝蛋白在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入0 .1 mo l/L 稀H2 SO4 溶液, 边加边搅拌,以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性, 将藻蛋白粗提液pH调节为3 .0 、4 .0 和5 .0 , 即藻蓝蛋白的等电点附近,静置过夜, 于-4 ℃离心机中以10 000 r/min 离心20 min ;将离心得到的沉淀用1/4 上清液体积的H3PO4 缓冲液(pH =7 .0)充分溶解, 再于-4 ℃高速离心机中以10 000 r/min 离心25 min ;用移液管抽取上清液,在568 、620 和650 nm 下测吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.2 .4 藻蓝蛋白的收率和分离因数分别计算藻蓝蛋白的收率(Y )、浓缩率(m)和分离因数(β):式(3)-(5)中, N(g/L)为藻液比, 0 和t 分别代表冷冻-融化后藻蛋白粗提液和经过盐析法沉淀或等电点法沉淀最终得到的藻蓝蛋白上清液.双水相萃取（1）藻蓝蛋白的初步提取。
藻蛋白提取实验报告
一、实验目的本实验旨在通过学习并掌握藻蛋白的提取方法，了解不同提取方法对藻蛋白提取效果的影响，并对提取得到的藻蛋白进行初步的纯化及鉴定。
二、实验原理藻蛋白主要存在于藻类植物中，如螺旋藻、小球藻等。
藻蛋白的提取方法主要有物理法、化学法和生物法。
本实验采用物理法中的冻融法提取藻蛋白，该方法操作简单，对藻类植物损伤小，提取效率较高。
三、实验材料与仪器材料：1. 螺旋藻粉2. 蒸馏水3. 0.1mol/L的KOH溶液4. 0.1mol/L的HCl溶液5. 95%乙醇6. 无水乙醇7. 丙酮8. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）仪器：1. 电子天平2. 磁力搅拌器3. 超声波清洗器4. 高速离心机5. 蒸发皿6. 烧杯7. 离心管8. 吸管9. 滤纸四、实验步骤1. 藻蛋白粗提1. 称取10g螺旋藻粉，置于100ml离心管中。
2. 加入50ml蒸馏水，充分搅拌，使螺旋藻粉充分溶解。
3. 将混合液置于冰浴中冷却，每隔30分钟搅拌一次，共冷却2小时。
4. 冷却完成后，以4000r/min的转速离心10分钟，收集上清液。
5. 将上清液转移至烧杯中，加入95%乙醇，使蛋白质沉淀，静置30分钟。
6. 以4000r/min的转速离心10分钟，收集沉淀。
7. 将沉淀用蒸馏水洗涤三次，以去除杂质。
2. 藻蛋白纯化1. 将洗涤后的沉淀溶于适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中。
2. 将混合液通过DEAE纤维素层析柱，用磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱。
3. 收集含有藻蛋白的洗脱液，经浓缩、冷冻干燥后得到藻蛋白。
五、实验结果与分析1. 藻蛋白粗提通过冻融法提取的藻蛋白，在95%乙醇中沉淀，经离心后得到淡蓝色沉淀，表明藻蛋白提取成功。
2. 藻蛋白纯化通过DEAE纤维素层析柱纯化后，得到的藻蛋白在紫外-可见光谱上呈现出典型的藻蓝蛋白特征峰，表明纯化成功。
六、实验结论本实验采用冻融法和DEAE纤维素层析柱法成功提取并纯化了藻蛋白。
实验结果表明，冻融法是一种简单、高效的藻蛋白提取方法，而DEAE纤维素层析柱法可以进一步纯化藻蛋白，提高其纯度。
藻蓝蛋白生产工艺
藻蓝蛋白生产工艺藻蓝蛋白是一种天然的蓝色色素，广泛用于食品、药品和化妆品等领域。
藻蓝蛋白的生产工艺一般包括培养和提取两个步骤。
首先是藻类培养。
选择一种高产藻类作为目标菌株，常用的有蓝细菌和蓝藻等。
蓝藻是一种常见的藻类，具有高产蓝色素的特点。
蓝藻可以在光合作用下自主合成藻蓝蛋白，因此只需提供充足的光照和适宜的培养基即可。
蓝藻的培养一般采用液体培养法或固体培养法。
液体培养法是将蓝藻菌种接种到含有适宜营养物的培养液中，利用搅拌或充气等方法提供充足的氧气和养分，以促进菌株的生长和藻蓝蛋白的合成。
固体培养法是将蓝藻菌种接种到含有固体基质的培养皿或柱中，通过调节温度和湿度等因素，为蓝藻的生长提供适宜的环境条件。
在培养过程中，需要控制培养液的温度、光照强度和光周期等参数，以及添加适当的营养物，如碳源、氮源和矿物盐等。
此外，还要注意防止外源污染和细胞自身的寄生菌感染等问题。
培养达到一定程度后，即可进行藻蓝蛋白的提取。
提取工艺一般包括细胞破碎、离心和过滤等步骤。
首先将培养液中的藻藻菌株离心下沉，然后通过破碎细胞壁的方法将细胞内的藻蓝蛋白释放出来。
常用的破碎方法包括超声波破碎和高压破碎等。
接下来，通过离心和过滤等步骤将藻蓝蛋白与细胞碎片、杂质等分离，得到相对纯净的藻蓝蛋白溶液。
最后，对提取得到的藻蓝蛋白溶液进行精制和纯化。
常用的精制方法包括吸附、离子交换和凝胶过滤等。
通过这些方法，可以去除藻蓝蛋白中的杂质和不纯物质，提高藻蓝蛋白的纯度和质量。
总之，藻蓝蛋白的生产工艺包括培养和提取两个步骤。
培养过程中需要控制好培养液的环境参数和添加适宜的营养物，提取过程中需要采用破碎、离心和过滤等方法将藻蓝蛋白与细胞碎片等分离，最后通过精制和纯化等步骤提高藻蓝蛋白的纯度和质量。
藻蓝蛋白的生产工艺流程
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在进行藻蓝蛋白的生产之前，藻种培养是关键的第一步。
螺旋藻藻蓝蛋白的分离
螺旋藻藻蓝蛋白的分离摘要: 藻蓝蛋白(Phycocyanin)是一个具有生物活性功能的天然蓝色素蛋白,已被用作优质蛋白源,添加于食品和鱼饵料中, 具有抗氧化、增强人体免疫力等功能, 又可制成荧光探针, 用于免疫学、细胞生物学等领域。
本文主要介绍运用硫酸铵盐析与层析柱结合法从螺旋藻中分离提取藻蓝蛋白。
藻蓝蛋白是一类普遍存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素,一种特殊的色素蛋白, 由开链四吡咯化合物和脱辅蛋白通过硫链键结合。
藻蓝蛋白在螺旋藻中的含量高达10%～20% , 是螺旋藻细胞中重要的光合作用的天然色素,在光合作用中能以近乎100% 的高效率把光能优先地传递给光系统。
藻蓝蛋白既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业。
同时藻蓝蛋白具有强烈荧光可制成荧光试剂、荧光探针、荧光示踪物质等, 用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域中。
同时藻蓝蛋白还是一种无毒副作用的理想光敏剂。
由于藻蓝蛋白具有良好的开发前景, 在螺旋藻的含量较高, 螺旋藻中藻蓝蛋白的研究成了藻类蛋白研究的热点。
1工艺流程弃去下层墨绿色沉淀↗螺旋藻（加入提取液）→冻融→离心（10000r/min,15min）→取亮蓝色上清液→加入↗弃去蓝色沉淀(NH4)2SO4固体粉末（在溶液浓度达到20%）→离心（10000r/min,15min）→取亮蓝色上清液→加入(NH4)2SO4固体粉末（在浓度达到50％）→离心（10000r/min,15min）→取得深蓝色沉淀→加入蒸馏水→装入层析袋→蒸馏水中层析（4℃）→过柱纯化→结果检测↘弃去黄绿色上清液2分离纯化具体方法2.1取螺旋藻粉颗粒倒入塑料瓶中，加提取液。
2.2.将塑料瓶用滤纸封住瓶口置低温（－20℃）下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。
如此反复冻融多次（实验中此步骤我们只做了一次，其余由老师帮做）,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞盐浓度的同时,发生溶胀破碎。
实验现象:解冻前:墨绿色固状(略带紫色)解冻后:墨绿色溶液2.3.冻融所得溶液分两次在10000rpm下高速离心15min，得到亮蓝色上清液，用小烧杯收集，弃去下层墨绿色沉淀。
藻蓝蛋白的提取与纯化
螺旋藻粉提取藻蓝蛋白摘要：藻蓝蛋白是一种可用于配制化妆品及各种天然食品或荧光探针标记的多用途蛋白。
本实验旨在找出最适螺旋藻粉中提取藻蓝蛋白的工业提取工艺。
对藻蓝蛋白的提取，本课题组采用了反复冻融法、水提法、缓冲液法，以找出提取效率高，成本低的方法。
实验结果显示，反复冻融三次的藻蓝蛋白浓度A620/A280分别为：0.819/1.871、0.597/1.676、0.245/0.629;水提法三次的A620/280分别为：0.842/1.768、0.650/1.136、0.177/0.737;缓冲液提取三次的A620/A280分别为：1.040/2.102、0.260/0.630、0.052/0.247。
在蛋白质的分离时，采用两步盐析法，盐析前A620=1.143，A280=1.983；两步盐析后，A620=2.203，A280=1.492。
最后在纯化方法上选择了羟基磷灰石柱分离，得到蛋白样品A620=1.379，A280=0.528。
关键词：螺旋藻；藻蓝蛋白；二次盐析；柱分离介绍：藻蓝蛋白既是一种蛋白质，又是一种很好的天然食用色素，同时又是极好的保健食品。
藻蓝蛋白是自然界中少见的色素蛋白之一，不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。
藻蓝蛋白具有抗癌、促进血细胞再生、养护卵巢、促使人体内合成弹力蛋白等功效。
21世纪初，在欧美、日本等国，藻蓝蛋白广泛用作食品和化妆品的高级天然色素，并被制成生化药品。
因为藻蓝蛋白为胞内蛋白，所以细胞破碎技术是直接影响蛋白提取得率的关键因素之一。
藻蓝蛋白的提取一般有超声波、高压均质、反复冻融、水提法、缓冲液提法等【1】。
本实验通过反复冻融、水提法和缓冲液法对螺旋藻细胞进行破碎提取藻蓝蛋白，对各条件下得到的蛋白溶出率进行了比较分析，确定了各条件下蛋白提取的最佳条件。
在藻蓝蛋白的分离时，主要是把蛋白质与提取液中其他物质分离。
可利用蛋白质的盐析【2】，和调节PH使蛋白变性等，使蛋白质从提取液中分离出来；最后，再把藻蓝蛋白从杂蛋白中分离出来，常用的方法有柱分离法等【3】。
一种高纯度藻蓝蛋白及其从螺旋藻中提取的方法[发明专利]
![一种高纯度藻蓝蛋白及其从螺旋藻中提取的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/955b061ac8d376eeafaa3153.png)
专利名称：一种高纯度藻蓝蛋白及其从螺旋藻中提取的方法专利类型：发明专利
发明人：杨南超
申请号：CN202110162085.3
申请日：20210205
公开号：CN112694529A
公开日：
20210423
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种高纯度藻蓝蛋白及其从螺旋藻中提取的方法，应用于生物化学技术领域，包括以下步骤：(1)螺旋藻破壁：将螺旋藻粉浸泡于氯化钠溶液中，离心，得上清液；(2)藻蓝蛋白粗提纯：向步骤(1)上清液中加入多功能化硅胶材料I，搅拌，过滤，取上清液，得藻蓝蛋白粗提液；(3)藻蓝蛋白精提纯：向步骤(2)上清液中加入多功能化硅胶材料II，搅拌，过滤，洗脱，干燥，得高纯度藻蓝蛋白。
本发明是一种具有低成本易操作、高纯度，适合于大规模生产等优点的藻蓝蛋白提取纯化方法，其具有非常重要的意义。
申请人：无锡定象改性硅胶材料有限公司
地址：214100 江苏省无锡市惠山经济开发区堰新路311号3号楼0806-1室
国籍：CN
代理机构：武汉智慧恒知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：彭冲
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机械搅拌提取藻蓝蛋白
机械搅拌提取藻蓝蛋白
一、目的
1、掌握螺旋藻机械搅拌破壁方法。
2、掌握藻蓝蛋白的性质和提取工艺优化方法。
3、熟练天然产物提取技术。
二、原理
藻蓝蛋白是螺旋藻细胞内的一种水溶性蛋白，它是重要的光合作用天然色素。
藻蓝蛋白可作为一种天然色素，色调为美丽的天蓝色，可用于食品添加剂和化妆品中，同时还具有提高人体免疫力，促进动物血细胞再生功能等生理活性。
由于藻蓝蛋白属于胞内蛋白，因此提取首先要进行破壁。
常用的破壁方法有机械破壁：超声破碎法、高压匀质法等；非机械破壁：反复冻融法、酶溶法、化学试剂法等。
机械搅拌提取藻蓝蛋白是利用搅拌桨高速旋转产生的剪切力和搅拌过程中螺旋藻颗粒之间的碰撞破坏螺旋藻细胞壁，使胞内的藻蓝蛋白溶解到浸出剂中，进而被提取出来。
提取剂、pH、搅拌转速、液固比等因素都会影响藻蓝蛋白的提取率。
三、实验器材及试剂
1、实验仪器及工具：
冰箱、机械搅拌器、电子天平、漏斗、滤纸、酸度计、三角瓶、烧杯、吸管、移液枪等。
2、实验原料及试剂
螺旋藻粉、氢氧化钠、稀硫酸。
四、实验步骤
1、提取液制备：按照设定的液固比，称量相应的螺旋藻粉加入到相应量的超纯水中，用稀酸或稀碱调节提取液的pH至设定值。
2、藻蓝蛋白机械搅拌提取：将上述提取液在室温条件下用六联机械搅拌器在设定的转速下搅拌提取设定时间。
五、实验结果
记录所研究pH、液固比、提取液体积、搅拌转速等实验条件。
别藻蓝蛋白 生产工艺
别藻蓝蛋白生产工艺藻蓝蛋白是一种天然的蓝色食品色素，通常用作食品和饮料的添加剂。
生产藻蓝蛋白的工艺通常包括以下几个步骤。
第一步：选材和培养选用高产藻蓝蛋白的藻类进行培养。
常用的蓝藻有螺旋藻、链藻、蓝绿藻等。
蓝藻可以在温水培养池中进行大规模培养，通常使用光合作用来提供生长所需的能量。
此外，还需添加适当的营养物质，如无机盐、有机碳、氮源和磷源等。
第二步：藻细胞收获当著生藻细胞已经达到一定密度时，就需要进行收获。
收获藻细胞的方法多种多样，可以采用离心、过滤或者沉积等方法。
根据产量的需求，也可以选择不同的收获方法。
第三步：细胞破碎和提取将收获的藻细胞进行破碎和提取，以获得藻蓝蛋白。
目前常用的方法是机械破碎和超声波破碎。
机械破碎通过高速搅拌或者高压打碎的方式破坏细胞膜，超声波破碎则是利用超声波的能量将细胞破碎为细小的颗粒。
然后通过过滤和离心等方法，分离出藻蓝蛋白。
第四步：纯化和浓缩藻蓝蛋白含有其他的蛋白质和杂质，需要经过纯化和浓缩处理，提高纯度和浓度。
常用的方法有离子交换层析、凝胶过滤和透析等。
纯化过程可以通过离子交换树脂或者凝胶过滤层析柱来完成。
透析则是一种常用的去除盐离子和其他小分子的方法。
第五步：产品包装和贮存纯化后的藻蓝蛋白需要进行包装和贮存。
通常使用密封的塑料袋或者密封罐进行包装，防止氧气和水分的进入。
同时，还需要冷暗贮存，以保持其稳定性和色泽。
藻蓝蛋白的生产工艺可以根据需求的不同而有所变化，但以上步骤是常见的生产方法。
近年来，随着生物技术的进步，还出现了通过基因工程和发酵技术生产藻蓝蛋白的方法，这种方法可以提高藻蓝蛋白的产量和纯度，但目前较为复杂和昂贵，还在进一步研究和发展中。
螺旋藻藻蓝蛋白的提取实验报告
螺旋藻藻蓝蛋白的提取实验报告嘿，大家好，今天我来跟你们聊聊螺旋藻和它的藻蓝蛋白，听起来有点复杂，其实不然！螺旋藻，这个名字一听就像是外星来的植物，其实它是一种超级食物，充满了营养，特别是它的藻蓝蛋白，简直是宝贝中的宝贝。
你知道吗？这玩意儿对我们的身体可是有大大的好处，像是增强免疫力、抗氧化、提高能量等等，简直是个“万金油”。
所以今天的任务就是提取这个神奇的藻蓝蛋白，准备好了吗？我们得准备好材料和工具，像是新鲜的螺旋藻、一些化学试剂和各种器具，光是想想就觉得兴奋。
把螺旋藻弄到手了，先得清洗干净，把那些杂质和污垢统统甩掉。
你想啊，谁想在实验中弄得一团糟呢？洗干净之后，我们就可以开始提取了。
这个过程可有意思了，像是做魔术一样，得用一些化学试剂。
我们要把螺旋藻和这些试剂混合，像是搅拌一锅美味的汤，看看能否从中提取出藻蓝蛋白。
在这个过程中，可不能马虎，一定要注意比例，太多或太少都会影响结果。
咕噜咕噜，搅拌得差不多的时候，就得让它静置一会儿。
你知道，这个时候就像是让面团醒发，静静等待它的变化。
这时候我们可以喝杯水，或者聊聊天，顺便期待一下最终的成果。
接下来就是过滤的环节，把混合物过筛，分离出固体和液体。
嘿，过滤的过程就像是在筛选宝藏，液体部分就是我们要的藻蓝蛋白啦！这时候得小心翼翼，不然可就把好东西给漏掉了。
过滤完了，我们得到了一些漂亮的液体，颜色鲜艳得像阳光下的蓝天，真是赏心悦目。
再来就是浓缩了，得把液体加热，去掉一些多余的水分。
这一步就像是在熬汤，慢慢浓缩，直到它的味道和色泽都变得更为浓厚。
浓缩完成后，我们得把它冷却，冷却的过程就像是在给它“降温”，让它更加稳定。
哇，真的是越看越有成就感，想想自己亲手提取的蛋白质，心里美滋滋的。
最后一步，就是检测一下这个藻蓝蛋白的质量。
我们得做些实验，看看它的浓度和活性，确保它真的是好东西。
哦，这时候就像是为自己的作品打分，心里小鹿乱撞。
结果出来后，哇，果然不负我所望，藻蓝蛋白的质量超赞，简直就像是发现了新大陆，心里那个高兴啊！整个提取过程，虽然有些繁琐，但每一步都充满乐趣。
藻蓝蛋白提取工艺
藻蓝蛋白提取工艺嘿，朋友们！今天咱就来唠唠藻蓝蛋白提取工艺这档子事儿。
你说这藻蓝蛋白啊，就像是大海里藏着的宝贝。
要把它给弄出来，那可得有点门道呢！咱先得找到合适的藻类来源，这就好比要去果园里找最甜的果子，得精挑细选才行。
然后呢，就是一系列的操作啦。
把藻类弄回来，就开始清洗啦，得把那些杂质啥的都洗掉，就像给它洗个舒舒服服的澡。
接下来就是破碎这一步，把藻类给弄碎，让藻蓝蛋白能跑出来。
这就好像是打开一个宝库的大门。
然后呢，就是提取啦！这可是关键的一步。
就好像是从一堆沙子里淘出金子一样，得有耐心，还得有技巧。
要用合适的溶剂，慢慢把藻蓝蛋白给弄出来。
提取完了可还不算完事儿，还得进行纯化呢！把那些不要的东西都去掉，只留下纯净的藻蓝蛋白。
这就好比是把宝石从一堆乱石里挑出来，还得给它打磨得亮晶晶的。
你想想，经过这么多步骤，最后得到那纯净美丽的藻蓝蛋白，是不是很有成就感？这过程可不比寻找宝藏容易啊！在这个过程中，每一步都很重要，就像链条上的一环扣一环，哪个环节出了问题都不行。
要是清洗不干净，那后面提取出来的藻蓝蛋白能纯吗？要是破碎不到位，藻蓝蛋白能顺利跑出来吗？而且啊，不同的藻类，提取的方法可能还不太一样呢！这就更得考验我们的本事啦。
咱得根据实际情况，灵活调整方法，就像打仗一样，得随机应变。
说真的，藻蓝蛋白的提取工艺真的很神奇，也很有趣。
当你看到那一点点被提取出来的藻蓝蛋白，你会觉得之前的所有努力都值了！这就是科学的魅力啊，能让我们从平凡的事物中发现不平凡的东西。
所以啊，朋友们，别小看了这藻蓝蛋白提取工艺，这里面的学问大着呢！咱们可得好好研究，好好探索，说不定还能发现更多有趣的东西呢！这藻蓝蛋白可是个宝，就看我们怎么去挖掘啦！。
螺旋藻中分析级藻蓝蛋白的高效制备
收稿日期:２０２２Ｇ０３Ｇ１５.基金项目:江西省博士后日常资助项目(２０２０R C ０８).作者简介:关㊀瑞(１９９７),女,硕士生.㊀∗通信作者:曹雷鹏(１９８６ ),男,助理研究员,博士.E Ｇm a i l :c a o l e i p e n g ２＠１６３．c o m ,l i u yu h u a n ＠n c u ．e d u ．c n ．关㊀瑞,王㊀玉,曹雷鹏,等．螺旋藻中分析级藻蓝蛋白的高效制备[J ]．南昌大学学报(理科版),２０２３,４７(２):１５７Ｇ１６４．G U A N R ,WA N G Y ,C A OLP ,e t a l ．E f f i c i e n t p r o d u c t i o n o f a n a l y t i c a l Ｇg r a d e p h y c o c y a n i n f r o mS p i r u l i n a p l a t e n s i s [J ]．J o u r n a l o f N a n c h a n g U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e ),２０２３,４７(２):１５７Ｇ１６４．螺旋藻中分析级藻蓝蛋白的高效制备关㊀瑞,王㊀玉,曹雷鹏∗,李聪苗,黄正花,冯硕儒,周㊀悦,樊瑞娟,刘玉环∗(南昌大学食品科学与工程国家重点实验室,生物质转化教育部工程研究中心,江西南昌㊀３３００４７)㊀㊀摘要:为了低成本高效生产分析级藻蓝蛋白(C ＧP h y c o c y a n i n ,C ＧP C ),本文以钝顶螺旋藻藻粉为原料,采用超声耦合高压均质高效提取藻蓝蛋白,通过盐析㊁透析和葡聚糖凝胶柱G Ｇ７５纯化所提取的藻蓝蛋白,从而使得藻蓝蛋白的纯度达到分析级,同时利用S D S ＧP A G E 和紫外吸光度分析纯化提物中的成分变化.实验结果表明,高压均质耦合超声法可有效提高藻蓝蛋白的产率,其最佳组合提取条件为:３９０W 超声２m i n ,超声２s /间隔２s ,６０M P a 处理３次,其粗提液中藻蓝蛋白产率和纯度(A ６２０/A ２８０)分别为１３１．２m g g －１和０．６９,比单独高压均质和超声的产率分别提高了５１．０７％和５８．１５％,且高于先前报道的.粗提液经过两步铵盐析(１２％硫酸铵和５０％硫酸铵)和透析,藻蓝蛋白纯度可提升至１．０９(＞０．７),最后经过２５m i n 葡聚糖凝胶G Ｇ７５层析纯化得藻蓝蛋白产率和纯度(A ６２０/A ２８０)分别为１０７．６５m g g －１和４．２３(＞４．０),达到分析级标准,其回收率达到８２．０５％,此外,分析级藻蓝蛋白的色度L ∗a ∗b ∗值分别为５８．０７,－１５．４４,－１７．８６,其主要与纯度㊁浓度及原料来源有关.采用S D S ＧP A G E 凝胶电泳图分析藻蓝蛋白的分子量(１７k D a )及纯化效果,与先前报道的藻蓝蛋白分子量(１５~２１k D a )基本一致.该研究结果为低成本高效生产分析级藻蓝蛋白提供技术支撑.关键词:螺旋藻;藻蓝蛋白;高压均质;超声;分离纯化中图分类号:T Q ４６４．７㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:１００６Ｇ０４６４(２０２３)０２Ｇ０１５７Ｇ０８E f f i c i e n t p r o d u c t i o no f a n a l y t i c a l Ｇg r a d e p h y c o c ya n i n f r o mS pi r u l i n a p l a t e n s i s G U A N R u i ,WA N G Y u ,C A O L e i p e n g ∗,L IC o n g m i a o ,HU A N GZ h e n gh u a ,F E N GS h u o r u ,Z HO U Y u e ,F A N R u i ju a n ,L I U Y u h u a n ∗(S t a t eK e y L a b o r a t o r y o fF o o dS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,E n g i n e e r i n g Re s e a r c hC e n t e rf o rB i o m a s s C o n v e r s i o n ,M i n i s t r y o fE d u c a t i o n ,N a n c h a ng U n i v e r s i t y ,N a n ch a n g ３３００４７,C h i n a )A b s t r a c t :I no r d e r t o p r o d u c e a n a l y t i c a l Ｇg r a d eC ＧP h y c o c y a n i n (C ＧP C )f r o mS p i r u l i n a p l a t e n s i s a t l o wc o s t a n dh i gh e f f i c i e n Ｇc y ,t h eu l t r a s o n i c c o u p l i n g h i g h Ｇp r e s s u r e h o m o g e n i z a t i o nm e t h o dw a s u s e d t o i m p r o v e t h e y i e l d o f C ＧP C f r o mS p i r u l i n a p o w d e r ．T h e a n a l y t i c a l g r a d eC ＧP Cc o u l db e o b t a i n e db yp u r i f i c a t i o no f s a l t i n g o u t ,d i a l y s i s a n dc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y (gl u c a n g e lG Ｇ７５)．M e a n w h i l e ,t h eS D S ＧP A G E ㊁t h e c o l o r a n d t h eU Va b s o r b a n c ew e r eu s e d t oc h a r a c t e r i z e t h e a n a l y t i c a l g r a d eC ＧP C ．T h e r e Ｇs u l t s s h o w e d t h a t t h e u l t r a s o n i c c o u p l i n g h i g h Ｇp r e s s u r e h o m o g e n i z a t i o nm e t h o d c o u l d e f f e c t i v e l y i m pr o v e t h e y i e l d o f C ＧP C ,a n d t h eo p t i m a l e x t r a c t i o n c o n d i t i o n sw e r e a s f o l l o w s :u l t r a s o n i c p o w e r ３９０Wf o r ２m i n ,２s /２s o f f ;６０M P a t r e a t m e n t f o r ３t i m e s ．T h e c r u d e y i e l d a n d p u r i t y (A ６２０/A ２８０)o f C ＧP Cw e r e １３１．２m g g －１a n d ０．６９u n d e r t h e o p t i m a l c o n d i t i o n ,w h i c hw e r e ５１．０７％a n d５８．１５％h i g h e r t h a n t h o s e o f s i n g l e h i g h Ｇp r e s s u r e h o m o g e n i z a t i o n a n d s i n g l e u l t r a s o u n d ,r e s p e c t i v e l y ．T h e p u r i t y of C ＧP C i n Ｇc r e a s e d t o １．０９(＞０．７)a f t e r t w o s t e p s o f s a l t i ng o u t (１２％a n d ５０％a mm o n i u ms u l f a t e )a n dd i a l y s i s ,a n d th e n c o u l d r e a c h４．２３(＞４．０)a f t e r f u r t h e r p u ri f i c a t i o no f ２５m i n c h r o m a t o g r a p h y (d e x t r a n g e lG Ｇ７５)．F i n a l l y ,t h e y i e l do f t h e a n a l y t i c a l Ｇg r a d eC ＧP Cw a s １０７．６５m g g －１w i t h８２．０５％r e c o v e r y ra t e f r o mc r u d eC ＧP Ce x t r a c t i o n ．I na d d i t i o n ,t h eL ∗a ∗b ∗v a l u e so f t h e a n a Ｇl y t ic a l Ｇg r ad eC ＧP Cwe r e ５８．０７,－１５．４４a n d －１７．８６,r e s p e c t i v e l y ,w h i c h c l o s e l y r e l a t e d t o p u r i t y ,c o n c e n t r a t i o n ,a n dm a t e r i a l ．A Ｇn a l y s i s of S D S ＧP A G Es h o w e d t h a t t h e a n a l y t i c a l Ｇg r a d eC ＧP Ch a d c l e a r s t ri p a n dm o l e c u l a rw e i g h t o f １７k D a ,w h i c hw a s c o n s i s t Ｇ第４７卷第２期２０２３年４月㊀㊀㊀㊀㊀㊀南昌大学学报(理科版)J o u r n a l o fN a n c h a n g U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e )V o l ．４７N o ．２A pr ．２０２３㊀Copyright ©博看网. All Rights Reserved.e n tw i t h t h e p r e v i o u s l y r e p o r t e dm o l e c u l a rw e i g h t(１５~２１k D a)of p h y c o c y a n i n．T h e r e s u l t s c o u l d p r o v i d e t e c h n i c a l s u p p o r t f o r t h e p r o d u c t i o no f a n a l y t i c a l CＧP Cw i t hh ig hc o s tＧe f f i c i e n c y．K e y W o r d s:S p i r u l i n a p l a t e n s i s;CＧp h y c o c y a n i n;h i g hＧp r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o n;u l t r a s o u n d;s e p a r a t i o n p u r i f i c a t i o n㊀㊀螺旋藻因其营养价值高而被广泛应用于人类和动物健康补充剂中,如食品和饲料㊁药品和个人护理等,其所有的功能性成分中,蛋白质的含量最高(高达干重的６０％~７０％),其中必需氨基酸含量高达８％,是营养全面的纯天然蛋白质食品源[１－２].螺旋藻中藻胆蛋白根据吸收光谱差异主要分为藻蓝蛋白(CＧp h y c o c y a n i n,CＧP C)㊁别藻蓝蛋白(AＧp h y c o c y aＧn i n,AＧP C)及藻红蛋白(RＧp h y c o c y a n i n,RＧP C),其中藻蓝蛋白占螺旋藻干重的２０％,可作为天然色素用于食品㊁化妆品等[３].藻蓝蛋白是一种多链全蛋白,主要由αＧ亚基(两个半胱氨酸和两个甲硫氨酸残基)和βＧ亚基(３个半胱氨酸和５个甲硫氨酸残基)组成,其中每个亚基含有１６０~１８０个氨基酸序列,而α３β３环状三聚体和(α３β３)２六聚体为藻蓝蛋白的主要存在形式[４].同时,藻蓝蛋白的发色团主要来源于藻蓝素(线性四吡咯化合物),通过硫醚键与载体蛋白连接.CＧP C溶液呈现水钴蓝而AＧP C 溶液为亮水蓝,CＧP C和AＧP C最大吸收波长分别在６２０和６５２n m[５].CＧP C是一种被广泛开发的藻蓝蛋白类的天然蓝色化合物,根据其６２０n m的特征峰值吸光度与２８０n m的蛋白质吸光度之比的纯度等级进行划分,当A６２０/A２８０ȡ为０．７时,C P C为食品级;当A６２０/A２８０为０．７~３．９时,CＧP C为试剂级;当A６２０/A２８０ȡ为４．０时,CＧP C为分析级[６].CＧP C 的纯度越高,其商业价值越高,食品级CＧP C的价格在于０．９元 m g－１,而分析级CＧP C的价格约１０５元 m g－１[７].此外,先前的文献报道高纯度的藻蓝蛋白具有抗炎㊁抗氧化性㊁抗肿瘤㊁免疫荧光性等生物活性,可作为药物成分用于医疗保健无毒副作用的天然理想物质[８－９],因此大量的高纯度藻蓝蛋白成为当前实现藻蓝蛋白高价值应用的迫切需要.目前研究报道从螺旋藻中提取CＧP C的方法有物理㊁化学㊁生物等技术,如超声㊁高压均质㊁反复冻融㊁化学溶剂及酶处理法等[１０－１３].W a n i d a[１４]等采用螺旋藻粉为原料,采用超声细胞破碎法,１０mm o l L－１磷酸缓冲液㊁料液比为１ １５㊁功率为７５０W㊁时间５m i n,最终得到的CＧP C产率和纯度分别为６０m g g－１和０．５２.T a v a n a n d i[１５]等以螺旋藻干粉为原料,采用冻融法提取藻蓝蛋白,提取条件:０．１m o l L－１磷酸缓冲液㊁料液比１ ８㊁浸泡４h㊁冻融４h㊁解冻１h,得到CＧP C得率和纯度分别为７３．７３m g g－１和０．６６.目前CＧP C提取方法都存在一定的缺陷,如单独使用超声细胞破碎法或冻融法所提取的CＧP C产率和纯度均比较低,且冻融法耗时较长,化学法和酶处理法成本较高.CＧP C的纯化技术主要有盐析[１６]㊁柱层析[１７]㊁双水相萃取[１５]㊁膜过滤[１８]等.M a r i n a[１９]等利用５０k D a聚醚砜膜超滤藻蓝蛋白粗提液,CＧP C纯度提高至１．５,之后经过离子交换柱,最终得到CＧP C纯度为３．９,其回收率为７９．７％. R a v i[２０]等将超声波细胞破碎提取的CＧP C粗提液,经过２０％㊁７０％硫酸铵两步沉淀,再经过D E A EＧC e l l u l o s e阴离子交换柱层析,得到纯度为４．０３的分析级CＧP C.现有的CＧP C分离纯化技术存在不稳定㊁不适合大规模应用㊁回收率不高等问题[２１],为了促进藻蓝蛋白的深加工及其高价值应用,低成本高效快速生产高纯度藻蓝蛋白成为当前主要研究方向.因此,本论文研究目的主要通过超声耦合高压均质法以低成本高效提取CＧP C,并利用盐析－透析及柱层析方法纯化CＧP C,以提高CＧP C的纯度,同时采用S D SＧP A G E和色泽分析鉴定所获得的分析级CＧP C的分子量及色泽,为螺旋藻藻蓝蛋白的低成本高效生产及其高价值应用提供技术支撑.１㊀材料与方法１．１㊀原料、试剂与仪器螺旋藻干藻粉原料(江西中藻生物科技有限公司);硫酸铵㊁氯化钠㊁氯化钡等均为分析纯(广州西陇科学股份有限公司);透析袋(８０００~１４０００D a,北京索莱宝科技有限公司);葡聚糖凝胶柱GＧ７５(北京索莱宝科技有限公司);电泳试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);低分子量M a r k e r(北京索莱宝科技有限公司)紫外可见分光光度计(U VＧ９０００,上海元析仪器有限公司);台式高速冷冻离心机(H１８５０R,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);电脑紫外层析仪(H DＧ３００１,上海嘉鹏科技有限公司);高压均质机(G J JＧ０．０６/１００,上海台驰轻工装备有限公司);超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);电泳系统(B i oＧB A D公司);凝胶成像分析仪(WDＧ９４１３C,北京六一生物科技有限公司);色差仪８５１ 南昌大学学报(理科版)２０２３年㊀Copyright©博看网. All Rights Reserved.(T S７７００,深圳市三恩时科技有限公司).１．２㊀藻蓝蛋白的提取方法及条件优化１．２．１㊀高压均质提取取５０．０g螺旋藻粉,添加１．０L超纯水制备螺旋藻溶液,后于高压均质机连续处理３次,处理压力分别为０㊁２０㊁４０㊁６０㊁８０M P a,处理后的藻浆于８０００r m i n－１条件下离心１０m i n.取上清液进行全波长扫描(２００~８００n m)并测定６２０㊁２８０㊁６５２n m处的吸光度,并计算不同压力下提取藻蓝蛋白的产率和纯度,以上实验重复３次.１．２．２㊀超声提取取５０．０g螺旋藻粉于２．０L烧杯中,之后加入１．０L超纯水.在超声功率为３９０W,超声２s后间歇２s的条件下,分别破碎１㊁２㊁３㊁４㊁５㊁６m i n,超声细胞破碎于４ħ的水浴中进行以防止过热.超声结束后样品于４ħ㊁８０００r m i n－１条件下离心１０m i n,取上清液进行紫外全波长扫描(２００~８００n m)并测定６２０㊁２８０㊁６５２n m处的吸光度,计算不同的超声时间所得藻蓝蛋白的产率和纯度,以上实验重复３次.１．２．３㊀超声耦合高压均质法提取藻蓝蛋白超声破碎法提取藻蓝蛋白的最佳条件为超声功率为３９０W,超声２s后间歇２s,总处理时间为２m i n;高压均质法提取藻蓝蛋白的最适处理压力为６０M P a连续处理３次.取５０．０g螺旋藻粉于２．０L 烧杯中,之后加入１．０L超纯水搅拌均匀后,于超声破碎/高压均质法的最佳条件下进行细胞破碎,将破碎的溶液于４ħ㊁８０００r m i n－１条件下离心１０m i n,取上清液进行全波长扫描(２００~８００n m)并测定６２０㊁２８０㊁６５２n m处的吸光度,计算所得藻蓝蛋白的产率和纯度[２２],以上实验重复３次.１．２．４㊀藻蓝蛋白(CＧP C)含量与纯度测定将所得样品测定６２０㊁２８０㊁６５２n m处的吸光度,并根据公式１~３计算藻蓝蛋白的浓度㊁产率及纯度[１３]:P u r i t y＝A６２０/A２８０(１) C(m g m L－１)＝(A６２０－０．４７４A６５２)/５．３４(２) CＧP C产率(m g g－１)＝C∗V/m(３)式中:A６２０n m,A２８０n m,A６５２n m分别为藻蓝蛋白溶液在６２０,２８０,６５２n m处的吸光度,C为藻蓝蛋白体积浓度(m g m L－１),m为螺旋藻藻粉质量(g),V为藻蓝蛋白溶液体积(m L).１．３㊀藻蓝蛋白的盐析及透析处理处理所得的藻浆于冷冻离心机４ħ㊁８０００r m i n－１转速下离心１０m i n,取上清液,添加硫酸铵至１０％㊁１１％㊁１２％㊁１３％㊁１４％㊁１５％硫酸铵后,４ħ避光保存６h后于８０００r m i n－１转速下离心１０m i n,所得到的上清液继续补加硫酸铵至５０％后,在４ħ避光保存６h后,并在４ħ㊁８０００r m i n－１下离心１０m i n,最后将所得沉淀采用透析袋(８０００~１４０００D a)透析１２h,用氯化钡检验透析终点.１．４㊀藻蓝蛋白柱层析纯化采用葡聚糖凝胶柱GＧ７５对透析脱盐后的样品进一步纯化.首先将葡聚糖凝胶干粉浸泡于蒸馏水中２４h,使其充分溶胀,柱形为２c mˑ５０c m,柱床高３０c m.用p H７．０的P B S缓冲液冲洗葡聚糖凝胶柱床,使填料达到阴阳离子平衡.将透析过夜后的样品用０．１m o l L－１的N a C l进行梯度洗脱(洗脱速度为０．５m L m i n－１),每５m i n收集１管.分别测定收集样品在６２０㊁２８０㊁６５２n m处的吸光度并计算藻蓝蛋白的浓度和纯度.再将所得到纯度最高的组分进行２００~８００n m全波长扫描.１．５㊀S D SＧ凝胶电泳分离胶质量分数为１５％,浓缩胶质量分数为５％.样品在浓缩胶中的电泳仪电压为８０V,电泳３０m i n,再将电压变为１２０V,电泳１２０m i n.电泳结束之后,采用考马斯亮蓝染色３０m i n,用乙酸 乙醇 水＝１ １ ８的脱色液脱色,直至颜色脱净为终点.１．６㊀色泽的测定色泽的测定采用T S７７００色差计,测色光源为D６５光源,光斑直径为８mm,均匀选取５个测量点,色差计经黑白色板校正后,测定各个测量点的L∗a ∗b∗值并取平均值,其中:L∗代表样品的明度,其值范围为０~１００;a∗代表绿红值,其值范围为－１２０~＋１２０;b∗代表样品的蓝黄值,其值范围为－１２０~＋１２０[２３].１．７㊀实验处理与数据统计方法实验数据的统计与分析采用O r i g i nP r o９．０和S P S S９．０软件.对所有数据进行单因素方差分析,每组实验重复３次以上确保数据的准确性.不同字母代表数据之间存在显著差异(P＜０．０５).２㊀结果与分析２．１㊀高压均质提取藻蓝蛋白高压均质法是一种用于细胞破碎的快速方法,主要通过用高压的方法对细胞膜进行破碎,最终使得细胞内成分流出[２４].图１A中显示为５０g L－１９５１第２期㊀㊀㊀㊀㊀关㊀瑞等:螺旋藻中分析级藻蓝蛋白的高效制备Copyright©博看网. All Rights Reserved.螺旋藻的藻溶液在不同压力处理连续处理３次后获得的藻蓝蛋白产量及其纯度.结果显示C ＧP C 的产率随处理压力的增加而显著上升,并在６０M P a 达到最大值８８．１５m g g －１,之后随着压力的继续升高无显著性差异.此外,C ＧP C 纯度(A ６２０/A ２８０)在随着压力的升高而显著上升,２０~６０M P a 之后维持在０．６３~０．６６(＜０．７),随着压力的进一步提高至８０M P a ,其纯度降低至０．５３左右,其主要原因可能是随着处理压力的增加,对细胞壁及细胞膜的破坏逐渐加大,导致细胞中C ＧP C 溶出较多,最终使得C ＧP C 产量提高[１５].在０~２０M P a,随着压力的提高,细胞内藻蓝蛋白的溶出显著提高,使得C ＧP C 纯度也显著提高至最大值,之后随着处理压力增加至８０M P a,细胞壁破坏程度进一步加大,细胞内的核酸㊁糖类㊁脂质等物质释放,使C ＧP C 纯度下降.图１B为６０M P a 所获得的螺旋藻C ＧP C 紫外扫描图(２００~８００n m ),结果显示C ＧP C 于６２０n m 处具有最大吸收峰,与先前报道藻蓝蛋白的特征峰基本一致,表明６０M P a 处理螺旋藻对藻蓝蛋白结构无影响.因此,综合考虑提取能耗成本效益,选择６０M P a 作为高压均质法提取螺旋藻C ＧP C 的最适压力.9080706050403060402080C -P C 产率/（m g ·g -1）(A)0.80.70.60.50.40.30.2C -P C 纯度/（A 620/A 280）F /M P a3.02.52.01.51.00.5600500400300700A b s o r b a n c e (B)200800λ/n m图１㊀不同处理压力对C ＧP C 产率纯度的影响及紫外扫描图(６０M P a)F i g．１㊀E f f e c t o f d i f f e r e n t t r e a t m e n t p r e s s u r e o n p u r i t y a n d y i e l do fC ＧP Ca n dU Vs c a n n i n g (６０M P a )２．２㊀超声法提取藻蓝蛋白超声波细胞破碎通过超声波破坏生物组织的细胞壁,促进细胞壁内可提取化合物的释放,增强溶剂从连续相中进入细胞,增加细胞内化合物的释放而增加提取细胞内物质的得率[２５].图２A 显示超声时间对藻蓝蛋白产量及纯度的影响.结果表明C ＧP C 产率在前２m i n 内显著上升至８１．２９m gg －１,之后在２~４m i n 内产率无显著性差异,随着时间的进一步延长至６m i n 后期,产率显著下降至６８．６２m gg －１.由于超声波具有的空化效应和机械效应,可在极短的时间内,击碎细胞壁,促使细胞内物质外流[２６],提高C ＧP C 的溶出度因而C ＧP C 得率增加.２~４m i n 条件下随着时间增加超声波对细胞壁的破坏没有显著影响,得率几乎不变.随着超声时间的延长(４~６m i n ),体系可能产生过多的热量,引起C ＧP C 变性,导致得率下降.同时,随着超声时间的延长,细胞内的杂质持续浸出,C ＧP C 纯度(A ６２０/A ２８０)由０．６显著下降至０．４８(图２A ).图２B 为超声２m i n 所获得的螺旋藻C ＧP C 紫外扫描图(２００~８００n m ),结果显示C ＧP C 于６２０n m 处具有最大吸收峰,与先前报道藻蓝蛋白的特征峰基本一致,表明超声２m i n 处理螺旋藻对藻蓝蛋白结构无影响.因此,综合考虑提取能耗成本效益,选择２m i n 作为超声法提取藻蓝蛋白的最适时间.２．３㊀超声－高压均质联用法提取藻蓝蛋白图３显示了高压均质和超声处理的最佳条件下,高压均质耦合超声法提取螺旋藻藻蓝蛋白效果.由图３A 可知,高压均质耦合超声提取所获得的C ＧP C 产率显著高于高压均质或超声提取,但其纯度显著低于高压均质或超声提取.超声处理后高压均质提取C ＧP C 产率达到最大值(１３１．２m g g －１),其次是高压均质＋超声处理(１２４．３m gg －１)㊁高压均质(８６．８５m g g －１)㊁超声处理(８２．９６m g g －１),比高压均质和超声提取所得产率分别提高了５１．０７％和５８．１５％.其主要的原因在于高压均质耦合超声法对细胞壁和细胞膜的破坏程度远高于单独处理,蛋白质㊁核酸㊁叶绿素㊁多糖等细胞内容物大量溶出,最终导致藻蓝蛋白含量显著提高,而其纯度达到最低值(０．６９)[１５].该结果表明该耦合方法提取藻蓝蛋白效率远高于先前文献报道,T a v a n a n d i [１５]等采用４次冻融４h 法提取的藻蓝蛋白产率为７３．７３m gg －１;P a n Ｇu t a i [２６]等利用超声法提取５m i n 后所得藻蓝蛋白产量为６０m g g －１;I l t e r [２７]等采用均质法获得的C ＧP C 产率为６７．６１m g g －１;K a f e r b o c k [２８]等采用脉冲电场处理７h 所得C ＧP C 产率为１１９．４８m gg －１.因此,为获得较高藻蓝蛋白产率,后续实验采用０６１ 南昌大学学报(理科版)２０２３年㊀Copyright ©博看网. All Rights Reserved.超声法＋高压均质作为C ＧP C 的最适提取方法.85807570656043216C -P C 产率/（m g ·g -1）(A)0.620.600.580.560.540.520.480.46C -P C 纯度/（A 620/A 280）5t /m i n1.81.51.20.90.60.30600500400300700A b s o r b a n c e(B)200800λ/n m图２㊀超声处理对C ＧP C 产率纯度的影响及紫外扫描图(２m i n)F i g．２㊀E f f e c t o f u l t r a s o n i c t r e a t m e n t o n t h e y i e l d a n d p u r i t y o fC ＧP Ca n dU Vs c a n n i n g (２m i n )图３B 显示了４种方法所得C ＧP C 的紫外全波长扫描结果,结果显示中显示４种提取方法得到的样品都有４个吸收峰,分别在２８０㊁４００~４５０㊁６２０㊁６７０n m .先前研究表明２８０n m 为蛋白质特征吸收峰,４００~４５０n m 为类胡萝卜素的特征吸收峰,６２０n m 为藻蓝蛋白的特征吸收峰,而６７０n m 为叶绿素的特征吸收峰[２９].由３B 可知４种方法提取的样品在２８０㊁６２０n m 处都有较高的吸收峰,表明提取物中主要的物质为藻蓝蛋白;且超声＋高压均质提取的样品吸收峰都高于其他３条曲线,说明该提取方法所得的C ＧP C 得率最高,但其含有的杂质较多,其纯度低于其余３种提取方法,这与图３A 的结果是一致.1401201008060C -P C 产率/（m g ·g -1）(A)0.90.80.70.60.50.40.30.2C -P C 纯度/（A 620/A 280）超声+高压均质高压均质+超声超声高压均质t /m i n3.02.52.01.51.00.50600500400300700A b s o r b a n c e (B)200800λ/n m图３㊀不同处理方法对藻蓝蛋白产率纯度及紫外吸光度的影响F i g ．３㊀E f f e c t s o f t r e a t m e n tm e t h o d s o n t h e p u r i t ya n d y i e l do f p h y c o c y a n i na n dU Vs c a n n i n g２．４㊀硫酸铵盐析及透析纯化藻蓝蛋白利用硫酸铵对C ＧP C 进行纯化的原理是盐溶和盐析.低浓度的硫酸铵包围着蛋白质分子,蛋白质分子将被盐化(溶解).高浓度时,盐离子强度很强,更容易与水分子结合,盐与水分子的结合导致蛋白质分子之间的吸引力增加,从而使蛋白质分子发生疏水相互作用,降低溶解度因而形成沉淀[３０].由图４可知,C ＧP C 的纯度随着硫酸铵浓度的增加,呈先上升至后下降的趋势.当硫酸铵浓度为１２％时,C ＧP C 纯度(A ６２０/A ２８０)达到最大值(１．０９),之后显著下降至０．７６.此外,随着硫酸铵浓度的增加,上清液中C ＧP C 的回收率在硫酸铵浓度为１０％~１２％保持不变在９０％左右,之后随着硫酸铵浓度提高至１５％,C ＧP C 的回收率显著下降至６９．５％左右.其主要的原因可能是由于盐溶原理,刚开始时硫酸铵能够使杂质(叶绿素㊁类胡萝卜素等)沉淀下来,而目标产物不会损失故在上清液中C ＧP C 的回收率不变而纯度增加.随着硫酸铵浓度的增加(＞１２％),过多的硫酸铵能够让C ＧP C 沉降下来使目标产物损失,上清液中C ＧP C 回收率下降.因此,本实验采用１２％硫1.41.31.21.11.00.90.80.70.61312111015C -P C 纯度9590858075706560回收率/%14硫酸铵浓度/％图４㊀硫酸铵浓度对藻蓝蛋白纯度和回收率的影响F i g．４㊀E f f e c t o f a m m o n i u ms u l f a t e c o n c e n t r a t i o no n t h e p u r i t y a n d r e c o v e r y r a t e o f p h y c o c ya n i n１６１ 第２期㊀㊀㊀㊀㊀关㊀瑞等:螺旋藻中分析级藻蓝蛋白的高效制备Copyright ©博看网. All Rights Reserved.酸铵作为盐析的第一步对藻蓝蛋白进行溶解,之后添加硫酸铵浓度至５０％使得C ＧP C 完全沉淀以进行后续的纯化.２．５㊀葡聚糖凝胶G Ｇ７５纯化藻蓝蛋白凝胶柱层析主要根据蛋白质相对分子质量不同从而对蛋白质进行分离纯化.先前研究表明C ＧP C在结构上由两条多肽链组成,即α单位(１３~２０．５k D a )和β单位(１１~２４．４k D a )[３０].葡聚糖凝胶G Ｇ７５的分离范围大约在３~８０k D a ,因此,本实验选择葡聚糖凝胶G Ｇ７５对C ＧP C 进行纯化.图５a 为C ＧP C 在吸光度为２８０和６２０n m 时的洗脱曲线.洗脱时间２５m i n 时,在２８０和６２０n m 处均出现洗脱峰,而在６２０n m 的吸光度值远远大于在２８０n m 的吸光度,其纯度A ６２０/A ２８０达到最大值为４．２０(分析级＞４．０),其可能的原因是分子量比较大的杂蛋白经过葡聚糖凝胶柱G Ｇ７５柱所需要时间较短,而分子量比较小的杂蛋白所需要的时间较长,杂蛋白与C ＧP C 被分开[２９],导致２８０n m 处吸收峰下降.通过柱层析的方法可将杂蛋白和C ＧP C 分开以提高C ＧP C 的纯度.因此,２５m i n 作为葡聚糖凝胶G Ｇ７５层析柱纯化藻蓝蛋白的最佳时间.图５b 显示藻蓝蛋白经过葡聚糖凝胶柱G Ｇ７５洗脱２５m i n 后收集的样品紫外扫描图,在６２０n m 处的吸光度出现了大幅度上升,而在２８０n m 处的吸3525155C -P C 纯度(A)454.54.03.53.02.52.01.51.00.50洗脱时间/m i n700600500400A b s o r b a n c e(B)8004.03.53.02.52.01.51.00.50300200λ/m i n图５㊀葡聚糖凝胶G Ｇ７５洗脱曲线及过柱前后紫外扫描图F i g．５㊀E l u t i o n c u r v e o f d e x t r a n g e lG Ｇ７５a n dU VS c a n n i n g ofC ＧP C 光度出现了轻微的下降,其主要原因为经过葡聚糖凝胶G Ｇ７５后杂蛋白质被进一步去除,故２８０n m 处吸光度下降,３００~４００n m 处出现微弱的峰可能是蛋白质中二硫键的吸收引起的.经过葡聚糖凝胶柱G Ｇ７５,C ＧP C 纯度由原来的０．８５进一步提升至４．２,达到了分析级纯度.２．６㊀分析级藻蓝蛋白的S D S ＧP A G E 及色泽超声－高压均质提取所得的粗藻蓝蛋白提取液经两步盐析㊁透析及２５m i n 柱层析后,纯化的样品进行冷冻干燥,所得分析级藻蓝蛋白产率为１０７．６５m gg －１,纯度为４．２３,其回收率达到了８２．０５％.图６显示了分析级藻蓝蛋白S D S ＧP A G E 和色泽.由图６a 可知,经过盐析后透析的藻蓝蛋白的电泳泳道的条带比较多而且不明显,表明所得到的样品的杂质较多且纯度较低,而经过葡聚糖凝胶G Ｇ７５柱层析纯化后的藻蓝蛋白电泳条带较少且清晰,表明杂质通过柱层析大部分全部被去除,因而电泳条带显示出目标蛋白质,纯化效果理想,这与图４和图５a 所得到的藻蓝蛋白纯度结果一致.此外,通过与M a r k e r 样品对比评估,C ＧP C 的分子量约为１７k D a,(A)(B)柱层析盐析+透析Marker 图６㊀S D S ＧP A G E 电泳图和藻蓝蛋白色泽F i g ．６㊀S D S ＧP AG Ee l e c t r o p h o r e s i s d i a gr a ma n d c o l o r o fC ＧP C２６１ 南昌大学学报(理科版)２０２３年㊀Copyright ©博看网. All Rights Reserved.这与先前文献等所报道的分子量基本一致[３１].图６b显示了柱层析纯化后所获得的藻蓝蛋白色泽值,其亮度(L∗值)为５８．０７,红度(a∗)为－１５．４４,黄度(b∗)为－１７．８６,该结果可能与先前报道的结果有差异,其可能与藻蓝蛋白的纯度和浓度㊁藻种有关[３２].３㊀结论㊀㊀本文通过研究螺旋藻分析级CＧP C的分离纯化工艺,以低成本高效生产分析级CＧP C.首先分别优化高压均质处理压力和超声法的超声时间,并将二者的最佳条件联用,比较不同处理方法下CＧP C的得率和纯度.结果显示超声－高压均质处理提取CＧP C产率最高,其提取率分别比单独使用高压均质和超声处理提高了５１．０７％和５８．１５％,且高于先前报道的.优化了硫酸铵对藻蓝蛋白的盐溶浓度(１２％)及盐析浓度为５０％.超声－高压均质法的藻蓝蛋白粗提液经过硫酸铵两步沉淀㊁透析和２５m i n葡聚糖凝胶柱GＧ７５柱层析法进行纯化后,藻蓝蛋白产率和纯度分别为１０７．６５m g g－１和４．２３(＞４．０),其回收率达到８２．０５％.此外,采用S D SＧP A G E对纯化后CＧP C进行纯度及分子量(１７k D a)进行验证,与先前报的结果基本一致.本文通过对传统提取纯化工艺上进行改进,以高效低成本快速生产分析级CＧP C,为螺旋藻分析级藻蓝蛋白的广泛应用提供技术支撑.参考文献:[１]㊀J A E S C H K EDP,T E X I E I R AIR,MA R C Z A KLDF,e t a l．P h y c o c y a n i nf r o mS p i r u l i n a:a r e v i e wo f e x t r a c t i o nm e t h o d s a n d s t a b i l i t y[J]．F o o dR e s e a r c hI n t e r n a t i o n a l,２０２１,１４３:１１０３１４．[２]曹雷鹏,段邓乐,黎紫含,等．螺旋藻培养过程中生长因素的影响[J]．过程工程学报．２０１７,１７(３):４３３Ｇ４３９．[３]MA H D I E H S,HA D IM,HAM I D R E Z AS,e t a l．D e v e lＧo p m e n to fan o v e l m e t h o df o rt h e p u r i f i c a t i o no fCＧp h y c o c y a n i n p i g m e n t f r o ma l o c a l c y a n o b a c t e r i a l s t r a i nL i m n o t h r i xs p．N S０１a n de v a l u a t i o no fi t sa n t i c a n c e rp r o p e r t i e s[J]．S c i e n t i f i cR e p o r t s,２０１９,９(１):１７５Ｇ１４２０．[４]C AM P O S A D A,C A V A L C A N T E B R,S A L A L,e ta l．C o l o u r s t ab i l i t y a n da n t i o x i d a n t ac t i v i t y o fCＧp h y c oＧc y a n i nＧad de di c ec r e a m saf t e ri n v i t r o d ig e s t i o n[J]．F o o dR e s e a r c h I n t e r n a t i o n a l,２０２０,１３７:１０９６０２．[５]N I U H F,WA NG G C,L I N XZ,e t a l．L a r g eＧs c a l e r eＧc o v e r y o fCＧp h y c o c y a n i n f r o mS p i r u l i n a p l a t e n s i s u s i n ge x p a n d e db e da d s o r p t i o nc h r o m a t o g r a p h y[J]．J o u r n a lo fC h r o m a t o g r a p h y B,２００７,８５０(１):２６７Ｇ２７６．[６]M I N G H,G U S T A V OC,MA R I O A,e t a l．P h y c o c y a n i na n d p h y c o e r y t h r i n:S t r a t e g i e st oi m p r o v e p r o d u c t i o ny i e l da n dc h e m i c a l s t a b i l i t y[J]．A l g a lR e s e a r c h,２０１９,４２:１０１６００．[７]K A F E R B O C K A,S M E T A N AS,D E V O SR,e t a l．S u sＧt a i n a b l e e x t r a c t i o no fv a l u a b l ec o m p o n e n t s f r o m S p i rＧu l i n a a s s i s t e db yp u l s e de l e c t r i cf i e l d st e c h n o l o g y[J]．A l g a lR e s e a r c h,２０２０,４８:１０１９１４．[８]D I N I C O L A N T O N I O JJ,B HA T A G,O K E E F E J．E f f e c t s o fS p i r u l i n ao n w e i g h t l o s sa n db l o o dl i p i d s:ar e v i e w[J]．O p e nH e a r t,２０２０,７(１):e００１００３．[９]任顺成,曹悦,李林政,等．天然食用色素藻蓝蛋白研究进展[J]．食品研究与开发．２０２１,４１(７):２０３Ｇ２０８．[１０]L IY,Z HA N G Z,P A C I U L L I M,e ta l．E x t r a c t i o no f p h y c o c y a n i n An a t u r a l b l u e c o l o r a n t f r o md r i e dS p i rＧu l i n ab i o m a s s:I n f l u e n c eo f p r o c e s s i n gp a r a m e t e r sa n de x t r a c t i o n t e c h n i q u e s[J]．J o u r n a l of F o o d s c i e n c e,２０２０,８５(３):７２７Ｇ７３５．[１１]C A R U L L O D,D O N S IF,F E R R A R IG,e ta l．E x t r a cＧt i o ni m p r o v e m e n to f w a t e rＧs o l u b l ec o m p o u n d sf r o mA r t h r o s p i r a p l a t e n s i s t h r o u g h t h e c o m b i n a t i o no f h i g hＧs h e a r h o m o g e n i z a t i o na n d p u l s e de l e c t r i c f i e l d s[J]．A lＧg a lR e s e a r c h,２０２１,５７:１０２３４１．[１２]A F T A R IRV,R E Z A E IK,B A N D A N IA,e t a l．A n t i o xＧi d a n t a c t i v i t y o p t i m i z a t i o n o f S p i r u l i n a p l a t e n s i sCＧp h yＧc o c y a n i no b t a i n ed b y f re e z eＧt h a w,m i c r o w a v eＧa s s i s t e da n du l t r a s o u n dＧa s s i s t e de x t r a c t i o n m e t h o d s[J]．Q u a l i t yA s s u r a n c e a n dS a f e t y o f C r o p s&F o o d s,２０１７,９(１):１Ｇ９．[１３]T A V A N A N D IH A,R A G HA V A R A O K．U l t r a s o u n dＧa s s i s t e de n z y m a t i ce x t r a c t i o no fn a t u r a l f o o dc o l o r a n tCＧPh y c o c y a n i n f r o md r y b i o m a s so fA r t h r o s p i r a p l a tＧe n s i s[J]．L WTＧF o o dS c i e n c e&T e c h n o l o g y,２０２０,１１８,１０８８０２．[１４]WA N I D A P,S I R I L U C KI．P h y s i c a l e x t r a c t i o na n de xＧt r u s i o ne n t r a p m e n t o f CＧp h y c o c y a n i n f r o m A r t h r o s p i r ap l a t e n s i s[J]．J o u r n a l o fK i n g S a u d U n i v e r s i t yＧS c i e n c e,２０１９,３１(４):１５３５Ｇ１５４２．[１５]T A V A N A N D I H A,M I T T A L R,C H A N D R A S E K H A R J,e ta l．S i m p l ea n de f f i c i e n tm e t h o df o re x t r a c t i o no fCＧP h y c o c y a n i nf r o m d r y b i o m a s so fA r t h o s p i r a p l a t e n s i s[J]．A l g a lR e s e a r c h,２０１８,３１:２３９Ｇ２５１．[１６]于淑坤,岳思君,李敏,等．钝顶螺旋藻藻蓝蛋白分离纯化[J]．食品科技,２０１９,４４(０５):２４８Ｇ２５２．[１７]P I N A K IH,G A R G IS K．I s o l a t i o na n d p u r i f i c a t i o no f p h y c o c y a n i nf r o m c y a n o b a c t e r i ao fa m a n g r o v ef o r e s t３６１第２期㊀㊀㊀㊀㊀关㊀瑞等:螺旋藻中分析级藻蓝蛋白的高效制备Copyright©博看网. All Rights Reserved.[J]．A p p l i e d B i o l o g i c a lC h e m i s t r y,２０１７,６０(６):６３１Ｇ６３６．[１８]G A R C IAＧL O P E Z D A,O L G U I N EJ,G O N Z A L E ZＧP O R T E L A R E,e ta l．A n o v e lt w oＧp h a s eb i o p r o c e s sf o r t h e p r o d u c t i o no fA r t h r o s p i r a(S p i r u l i n a)m a x i m aL J G R１a t p i l o t p l a n t s c a l e d u r i n g d i f f e r e n t s e a s o n s a n df o r p h y c o c y a n i ni n d u c t i o nu n d e rc o n t r o l l e dc o n d i t i o n s[J]．B i o r e s o u r c e t e c h n o l o g y,２０２０,２９８:１２２５４８．[１９]MA R I N AC A A,A N N A R C B,L U I S A S,e t a l．D eＧs i g ns t r a t e g i e sf o rCＧp h y c o c y a n i n p u r i f i c a t i o n:p r o c e s si n f l u e n c eo n p u r i t yg r a d e[J]．S e p a r a t i o na n dP u r i f i c aＧt i o nT e c h n o l o g y,２０２０,２５２:１１７４５３．[２０]R A V IR．S,S T U T IP,B E L A B,e ta l．P u r i f i c a t i o na n da n t i o x i d a n t a c t i v i t y o f p h y c o c y a n i nf r o m s y n c h r o n o u ss p．R４２D Mi s o l a t e df r o mi n d u s t r i a l l yp o l l u t e ds i t e[J]．B i o r e s o u r c eT e c h n o l o g y,２０１７,２４５:３２５Ｇ３３１．[２１]郭静,王峰,崔正刚,等．膨胀床Ｇ固定床层析偶联方式分离纯化藻蓝蛋白[J]．食品科学,２０１３,２４(１０):１０７Ｇ１１１．[２２]黎紫含,曹雷鹏,刘童莹,等．螺旋藻干粉微波灭菌工艺优化[J]．南昌大学学报(理科版),２０２０,４:３６３Ｇ３６９．[２３]曹雷鹏,樊玉霞,黄轶群,等．基于计算机视觉的鲶鱼肉色泽测定系统[J]．食品科学,２０１７,３８(１５):１３５Ｇ１３９．[２４]E L A I N A,N K O U N K O U C,F E L L I C M L,e t a l．G r e e ne x t r a c t i o nof p o l y s a c c h a r i d e s f r o m A r t h r o s p i r a p l a t e nＧs i su s i n g h i g h p r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o n[J]．J o u r n a lo fA p p l i e dP h y c o l o g y,２０２０,３２(３):１７１９Ｇ１７２７．[２５]B A C H C HHA V M,I N G A L E A,K U L K A R N I M．R eＧc e n tde v e l o p m e n t s i n p r o d u c t i o no fCＧp h y c o c y a n i na n dI t s a p p l i c a t i o n t h r o u g hb i o t e c h n o l o g i c a l p e r s p e c t i v e[J]．J o u r n a l o fA d v a n c e s i nE n g i n e e r i n g S c i e n c e s,２０１６,１３(２):２５Ｇ２９．[２６]P A N U T A IW,L AM T HAM S．P h y s i c a l e x t r a c t i o na n de x t r u s i o ne n t r a p m e n to fCＧp h y c o c y a n i nf r o m A r t h r oＧs p i r a p l a t e n s i s[J]．J o u r n a l o fK i n g S a u dU n i v e r s i t yＧS c iＧe n c e,２０１９,３１:１５３５Ｇ１５４２．[２７]I l T E RI,A K Y I LS,D E M I R E LZ,e t a l．O p t i m i z a t i o no f p h y c o c y a n i ne x t r a c t i o nf r o m S p i r u l i n a p l a t e n s i su s i n gd i f fe r e n t t e c h n i q u e s[J]．J o u r n a lo fF o o d C o m p o s i t i o na n dA n a l y s i s,２０１８,７０:７８Ｇ８８．[２８]K A F E R B O C K A,S M E T A N AS,D E V O SR,e t a l．S u sＧt a i n a b l e e x t r a c t i o no fv a l u a b l ec o m p o n e n t s f r o m S p i rＧu l i n a a s s i s t e db yp u l s e de l e c t r i cf i e l d st e c h n o l o g y[J]．A l g a lR e s e a r c h,２０２０,４８:１０１９１４．[２９]武康,汪家权,赵冰冰,等．柱层析法纯化藻胆蛋白的紫外Ｇ可见光谱特征研究与机理分析[J]．光谱学与光谱分析,２０２０,４０(４):１１０７Ｇ１１１２．[３０]赵冰冰,张发宇,陈裕,等．四步盐析提取巢湖新鲜蓝藻中藻蓝蛋白及其稳定性[J]．环境工程学报,２０１６,１０(５):２３０２Ｇ２３０８．[３１]F E R N A N D E ZＧR O J A SB,H E R N A N D E ZＧJ U A R E ZJ, P E D R A Z AＧC HA V E R R I J．N u t r a c e u t i c a l p r o p e r t i e so fp h y c o c y a n i n[J]．J o u r n a l o fF u n c t i o n a l F o o d s,２０１４,１１:３７５Ｇ３９２．[３２]C H E N T I R I,HAM D IM,L I S,e t a l．S t a b i l i t y,b i oＧf u n cＧt i o n a l i t y a n db i oＧa c t i v i t y o fc r u d e p h y c o c y a n i nf r o m a t w oＧp h a s e c u l t u r e ds a h a r i a nA r t h r o s p i r as p．S t r a i n[J]．A l g a lR e s e a r c h,２０１８,３５:３９５Ｇ４０６．４６１ 南昌大学学报(理科版)２０２３年㊀Copyright©博看网. 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从螺旋藻中提取藻蓝色素
从螺旋藻中提取藻蓝色素Ξ高天荣, 孙世中, 韦小岿(云南师范大学省农村能源工程重点实验室,云南昆明650092)摘 要: 螺旋藻是一种营养价值很高的天然绿色食品。
除了含有65%的植物蛋白和多种微量元素,维生素以外,还含有5～10%的藻蓝色素。
文章介绍由螺旋藻中提取藻蓝色素的研究成果及其藻蓝色素的基本性质。
关 键 词: 螺旋藻;藻蓝色素;超低温中图分类号: Q949.217 文献标识码: A 文章编号: 1007-9793(2002)01-28-02 螺旋藻是蓝藻门颤藻科螺旋藻属。
早在16世纪西班牙探险家哥伦布就在美洲墨西哥湖看到当地人食用湖中的螺旋藻,非洲乍得湖卡嫩布族也因食用当地螺旋藻而体格健壮。
本世纪60年代法国科学家开始研究螺旋藻,对其成份进行的系统分析研究,充分肯定了螺旋藻的营养价值。
今天,宇航员的太空食品中也有螺旋藻。
我国云南永胜县程海湖也生成着螺旋藻。
目前,螺旋藻商品已被老幼消费者所接受。
在螺旋藻众多营养组份中,开发其中含有的5～10%的藻蓝色素,从食用天然色素的利用而言,又有其特别的价值。
1 螺旋藻蓝色素的性质螺旋藻蓝色素是自然界中为数很少的天然纯蓝色素,螺旋藻蓝色素,其结构是由发色基团与蛋白质的结合体,分子量为120000,用1%琼脂糖等电聚焦法测得藻蓝色素p I 值为4.23[1];其热变性温度范围在40℃～54℃。
藻蓝色素有强烈的红色荧光,其特征荧光发射峰位于646nm (图1),其光谱吸收峰为620nm 和348nm (图2)[2]。
螺旋藻蓝色素有良好的水溶性,在酒精中立即变性,不溶于一般有机溶剂,与其它天然色素一样,对光、热不稳定,但其纯固体在冰箱内可长期保存。
与其它水溶性色素有良好的混配性能。
图1 藻蓝色素荧光发射峰Fig.1 fluorescent emission peak of p hycocyanin图2 藻蓝色素光谱吸收峰Fig.2 spectrum absorption peak of p hycocyanin2 材料与方法2.1原料:云南永胜程海螺旋藻干粉———云南施谱瑞公司产品“绿A ”。
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螺旋藻中藻蓝蛋白提取的工艺流程
王艺生物技术二班2010040407
1、预处理
将螺旋藻洗净晾干
2、细胞破碎
利用超声波破碎发破碎细胞，藻胆蛋白属于胞内蛋白质，要提取分离藻胆蛋。
首先必须要破坏藻类细胞的细胞壁、细胞膜，使藻胆蛋白以溶解的状态释放出来，并保持其活性。
超声波细胞粉碎仪破碎鱼腥藻细胞的最佳处理条件是超声仪的功率为600 W，超声时间为9min，固液比为1：8，破壁容量为20 mL。
也可与其他方法合用最大限度的破碎细胞。
3、提取（初步分离）
（1）用超滤膜过滤藻胆蛋白提取液，获得藻胆蛋白粗制品。
用NaNO3，高渗一超滤法分离提纯藻胆蛋白，超滤时选用聚砜膜，在超滤过程中，无机盐和小分子蛋白质，包括小分子的藻毒素透过滤膜而去掉，特别适用于易产生水华的微囊藻脱毒，提高产品的安全性。
NaNO3高渗．超滤法是提取藻胆蛋白的简单易行的方法，用此法提取的藻胆蛋白是安全无毒的，且易于纯化，脱水方便，产品易于干燥。
（2）也可利用沉淀法将大量盐加到蛋白质溶液中，蛋白质胶粒凝结并沉淀析出，因此向细胞破碎液中加入盐溶液使蛋白质沉淀析出。
用25％硫酸铵可将藻红蛋白沉淀出，用30％硫酸铵可将藻蓝蛋白沉淀出，再用50％硫酸铵可将蓝藻蛋白沉淀出。
4、精制（高度纯化）
离子交换层析法，用 DEAE一步纯化藻蓝蛋白；改变传统以离子强度作梯度洗脱的方法，根据藻红蛋白的等电点进行pH梯度洗脱，仅用DEAE一步层析，就将藻红蛋白纯度从1.042提高至5.6，回收率达67.33％。
用硅藻土545柱分级洗脱，再用该法纯化，从螺旋藻中获得初度为4.1的藻蓝蛋白和纯度为4.6的别藻蓝蛋白；将提取液上DE。
AE一52纤维素柱，提取纯度只有1.9，在上葡聚糖凝胶柱，则得到了纯度较高的蓝藻蛋白。
5、成品制作
随着藻蓝蛋白制品的应用范围的不断扩大，对提取分离工艺的要求也逐渐提高。
不仅要有高的提取率、好的产品质量，而且要考虑省时、省力、自动化程度高。
利用缓慢冷却加晶种的方法使藻蓝蛋白结晶，干燥后进行保存。
藻蓝蛋白具有较高的促红细胞生成素(EPO)活性，它能直接刺激CFU—E的形成，对骨髓造血具有刺激作用，有很好的抗病毒活性，在细胞受感染前用APC处理的抗病毒效果比感染后处理效果更好，并且还有抗氧化和消炎活性。
因此，可以利用藻蓝蛋白的这些特点把蓝藻蛋白制作成治疗药物或者是保健食品。
分离鸡蛋清中的溶菌酶及卵清蛋白
生物技术二班李美君2010021431
1离子交换法
选用DEAE做骨架，阴离子交换剂，碱性洗脱液，PH值在8.6以下缓冲液，采用硅胶基质阴离子交换剂作为填料制作的色谱分离纯化蛋清中的溶菌酶克服了上述的弊端，获得了良好的分离效果，这种方法比传统的软基质离子交换色谱分离法速度快，纯化效率高。
2离子交换膜色谱
离子交换膜色谱主要是利用膜介质表面的基团与目标蛋白质之间进行离子交换作用进行分离的。
选用DEAE做骨架，阴离子交换剂，碱性洗脱液，PH值在8.6以下缓冲液
1.树脂的选择，选择弱酸性羧甲基交联葡聚糖阳离子交换树脂。
2.树脂预处理
3.上柱，将溶菌酶与卵清蛋白的混合液自上向下流过树脂。
4.洗涤，用蒸馏水进行洗涤。
5.洗脱，用硫酸铵溶液洗脱溶菌酶，收集洗脱液，透析得到纯净的溶菌酶。
6.树脂再生，用大量的水冲洗，然后用酸处理。
3超滤法
第一步超滤采用错流过滤，膜的错流过滤可实现混合液中物质的分离，在生物工程领域有着广泛的应用。
此步目的是除去分子量大于卵清蛋白的蛋白分子，通过膜的筛选选择了分离及清洗效果均较好的PVDF100KDa超滤膜进行操作条件的优化。
同时选择了压力0.08MPa，流速1.5L/min作为最适操作条件。
在此条件得到的透过液中卵清蛋白透过率为26.32％，溶菌酶透过率为36.72％。
第二步超滤采用终端过滤，此步的目的是将溶菌酶和卵清蛋白分离纯化，根据两种蛋白的分子量及膜的性能选择了30 KDa再生纤维素超滤膜作为此步超滤膜。