藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度

藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度

作者：邱李莉来源：藻蓝蛋白提取纯化测定专题资源时间：2007-11-18

一、实验目的

学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度的方法

二、实验材料

螺旋藻藻粉

三、实验设备

天平，量筒，塑料杯，药匙，小烧杯（5个），铁架台，铁夹，玻棒（若干），胶头滴管（若干），滤纸，收集器，树脂柱，梯度洗脱器，蠕动，磁力搅拌器，高速离心机

四、实验原理

1.冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下(或40℃左右)迅速融化。如此重复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。

2.盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升(盐溶)，但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出(盐析)。盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。

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3.DEAE－纤维素：英文名称DEAE－Cellulose，二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g 功能基：二乙基胺乙基.弱碱性阴离子交换剂。

原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换。性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。

4.葡萄聚糖凝胶：商品名称Sephadex，是效果较好的分子筛凝胶层析。

原理：分子筛指多孔介质。小分子能进入介质内部空隙，大分子物质排阻在介质之外，从而达到分离目的，这种作用为“分子筛效应”。

5.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。装柱的方法分干装和湿装两种。干装法是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随机将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶液慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降至需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。

6.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2(体积越小越有利于提高分辨率)。

7.洗脱：待样品液的液面流到固体相表面时，用滴管加入洗脱剂(5cm)，并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。

洗脱流速：如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全，如果太慢，洗脱物会扩散。

8.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果，即可绘制出洗脱曲

线(以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液样品的浓度或活性为纵坐标)。

五、实验步骤

1.取螺旋藻粉颗粒20粒，每颗0.5g,一共取藻粉0.5g/粒×20=10g，倒入塑料瓶中，加提取液100ml。

2.将塑料瓶用滤纸封住瓶口置低温（－20℃）下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。如此反复冻融多次（实验中此步骤我们只做了一次，其余由老师帮做）,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞盐浓度的同时,发生溶胀破碎。

实验现象:解冻前:墨绿色固状(略带紫色)解冻后:墨绿色溶液

3.冻融所得溶液分两次在10000rpm下高速离心15min，得到亮蓝色上清液67.8ml，用小烧杯收集，弃去下层墨绿色沉淀。

4.称取之前已经研磨好的(NH4)2SO4固体粉末8.72g，分多次缓慢加入小烧杯中，边加边搅拌，使溶液的(NH4)2SO4浓度达到20％。在10000rpm下高速离心15min，离心沉降后，取得亮蓝色上清液67.2ml，弃去蓝色沉淀。

5.称取之前已经研磨好的(NH4)2SO4固体粉末12.7g，分多次缓慢加入小烧杯中，边加边搅拌，使溶液的(NH4)2SO4浓度达到50％。在10000rpm下高速离心15min，离心沉降后，取得深蓝色沉淀，弃去黄绿色上清液。加不超过15ml蒸馏水溶解所得沉淀备用(水因尽量少,有利于渗析)。

6.剪取约25cm长的层析袋，放入烧杯中煮沸5min（从水沸开始计时），将其中一头用细线扎住，对折后再用细线扎住。将之前溶解沉淀的溶液倒入层析袋中。放入蒸馏水中，4℃下透析2—3天。

7.取一支层析柱，检漏后清洗干净，用两个铁夹固定在铁架台上，要从正面和侧面检查是否竖直，如不竖直则作出调整。称取40gDEAE—纤维素—52于一烧杯，加150ml0.5MHCL 溶液，轻搅,浸20min，小心倒掉上清液，补水到同一刻度，轻轻搅拌溶液，均匀地倒入柱中。柱中液面上要保留2～3cm的空间，之后液面每下移到原刻度位置，就补水到相应高度，使蒸馏水始终高于填料2cm以上。

8.以下由老师完成。用0.5MNaCL__0.5MNaOH溶液融胀20min，再用蒸馏水洗至中性。接着用0.5MHCL溶液融胀20min，再用蒸馏水洗至中性。后用0.5MNaCL__0.5MNaOH溶液融胀20min，再用蒸馏水洗至中性。最后用0.02M，pH6.5磷酸缓冲液平衡过夜。至此，层析柱准备完毕。

9.剪一片刚好可以覆盖填料平面的滤纸，轻放入填料面。将准备好的层析柱中的缓冲液放出，待液面比填料高出大约只有1cm时，关闭柱开关。用胶头滴管吸取透析后的藻蓝蛋白粗提液，伸入柱液面内，沿管壁以很慢的速度将粗提液滴到液面中部，待液面升高后可以加快滴加速度。待液面离柱口只有大约2cm距离时，把开关完全打开，一边继续滴加粗提液。

现象：开始有颜色分层，由上到下分别为蓝色，绿色，黄色

10.待粗提液液面比填料高出大约只有1cm时，滴加50ml，0.02M，pH6.5磷酸缓冲液冲洗残余粗提液，不要一次加入，应先加少量把残余粗提液冲洗干净(至溶液澄清为止)，再大量加入。最后加入0.5MNaCL—0.02M，Ph6.5磷酸缓冲液（流速：1.0ml/min）。