流式细胞仪

FALS Sensor Fluorescence detector
Charged Plates
-
+
Single cells sorted into test tubes
阴 阳 性
MACS-Magnetic Cell Sorting MACS-Magnetic Cell Sorting Magnetic Cell Sorting Magnetic Cell Sorting MACS-Magnetic Cell Sorting MACS-Magnetic Cell Sorting Magnetic Cell Sorting Magnetic Cell Sorting
(一)外周血淋巴细胞样品的制备
淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞. 淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞. Ficoll,40kd,高密度,低渗透压,无毒性. Ficoll,40kd,高密度,低渗透压,无毒性. (比重为1.0177±0.001的分层液). 比重为1.0177 0.001的分层液 1.0177± 的分层液).
利用红细胞裂解液去除红细胞后, 利用红细胞裂解液去除红细胞后,得到外周血 中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图
(二) 培养细胞的样品制备
单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法 使细胞从培养皿上消化下来,然后离心漂洗. 使细胞从培养皿上消化下来,然后离心漂洗. 悬浮培养细胞,可不用酶消化,直接吹打制备 悬浮培养细胞,可不用酶消化, 成单细胞悬液. 成单细胞悬液.
特点: 特点:
单细胞的流动的 活细胞的 定量的 多参数的 高统计学精度的 分选细胞
第一节 流式细胞仪的分析及分选原理 第二节 数据的显示与分析 第三节 流式细胞仪分析的技术要求 第四节 流式细胞术在免疫学检查中应用
第一节 流式细胞仪的分析及分选原理 工作原理: 一 工作原理: FCM是一种在计算机技术支持下的高度
(三)新鲜实体组织单细胞悬液的制备 三 新鲜实体组织单细胞悬液的制备
机械法:剪碎法,网搓法,研磨法. 机械法:剪碎法,网搓法,研磨法. 酶处理法:胃蛋白酶,胰蛋白酶,胶原酶等. 酶处理法:胃蛋白酶,胰蛋白酶,胶原酶等. 化学试剂处理法:EDTA,EGTA等. 化学试剂处理法: , 等 表面活性剂处理法: 表面活性剂处理法: Triton-100,皂素等. ,皂素等.
自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪. 自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪.
(一) 基本组成构
1,液流系统 样品流和鞘流 激光,透镜组, 2,光学系统 激光,透镜组, 光电倍增管等. 光电倍增管等. 3,数据处理系统
1,液流系统
样品流和鞘流
Injector Tip
Sheath fluid
荧光信号
激光束
(三) 三参数直方图
三维坐标匀为参数(散射光或荧光) 三维坐标匀为参数(散射光或荧光)而 非细胞数. 非细胞数.
(四)流式细胞仪的多参数分析
一般利用所得参数的两两组合并利用设门( 一般利用所得参数的两两组合并利用设门(Gate) 技术,来分析参数之间的相互关系. 技术,来分析参数之间的相互关系.
Common Laser Lines
350
300 nm
457 488 514
400 nm 500 nm
610 632
600 nm 700 nm
PE-TR Conj. PETexas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid cis-
Excitation
前向散色光FSC 前向散色光FSC
侧向散色光SSC 侧向散色光SSC
散射光的测定
利用前向角和 测向角散射光可 以把外周血白细 胞分成三群, 胞分成三群,淋 巴细胞, 巴细胞,单核 细胞和粒细胞. 细胞和粒细胞.
三 荧光测量
荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长 (一)光信号测量 线性放大器 对数放大器
(四)单细胞悬液的保存
防止细胞自溶,保持细胞膜原有的特性保存的方法: 防止细胞自溶,保持细胞膜原有的特性保存的方法: 深低温保存法:深低温冰箱,保存一年. 1,深低温保存法:深低温冰箱,保存一年. 乙醇与甲醇保存法:70%冷乙醇 75%的甲醇 冷乙醇, 的甲醇. 2,乙醇与甲醇保存法:70%冷乙醇,75%的甲醇. 3,甲醛或多聚甲醛固定法:细胞不具有生物活性,但 甲醛或多聚甲醛固定法:细胞不具有生物活性, 细胞表面荧光染色分析不受影响. 细胞表面荧光染色分析不受影响.
1 ,点图
纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量 参数, 参数,在图中每一个点代表一个细胞
2 ,二维等高图
用等高线来表示细胞数, 用等高线来表示细胞数,在一条等高线上细胞数相 不同的等高线上细胞数不同. 同,不同的等高线上细胞数不同.
3 ,假三维等高图
纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参 ,Z轴为细胞数 轴为细胞数. 数,Z轴为细胞数.
Forward Angle Light Scatter
Laser
FALS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关. 细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.
90 Degree Light Scatter
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关. 细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.
流式细胞仪 分析技术及应用
什么是流式细胞术(FCM)? 什么是流式细胞术(FCM)? (FCM)
FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项 FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项 能快速,精确的对单个细胞理化特性进 快速,精确的对单个细胞理化特性进 行多参数定量分析和分选的新技术. 多参数定量分析和分选的新技术
1 ,Region设置 Region设置
2 ,
Gate 设
置
第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求
样品制备: 样品制备:单细胞悬液 特定荧光染料的选择: 特定荧光染料的选择:光谱重叠 阴性对照的设置:检测标本的重复性 阴性对照的设置: 质量控制
一,免疫检测样品制备
细胞碎片 细胞团块 离心漂洗 固定剂
第二节 数据的显示和分析
一,参数
前向散射光FS: 前向散射光FS: 反映颗粒的大小 侧向散射光SS: 细胞内部结构复杂程度 侧向散射光SS: 散射光 荧光FL: 荧光FL: 细胞被染上荧光部分数量的多少
二,数据的显示方式
(一) 单参数直方图 (二) 双参数显示 (三) 三参数显示
(一) 单参数直方图的显示
Single-Parameter Histogram Displays 以分布直方图( distribution histogram ) 以分布直方图( 来显示,横轴为该参数测量强度相对值, 来显示,横轴为该参数测量强度相对值,单位是 道数.强度分布可以是线性的,也可以是对数的. 道数.强度分布可以是线性的,也可以是对数的. 纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数. 纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数.
机械法往往常成严重的细胞损伤, 机械法往往常成严重的细胞损伤,而结果却是 往往常成严重的细胞损伤 较低的细胞产量. 较低的细胞产量. 如用低速离心去碎片,用尼龙网过滤团块等, 如用低速离心去碎片,用尼龙网过滤团块等, 也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片 的干扰. 的干扰. 酶学法,化学法对实体组织的分散效果较理想 对实体组织的分散效果较理想, 酶学法,化学法对实体组织的分散效果较理想, 但会造成所测化学成份的不良影响.FCM所测细胞 但会造成所测化学成份的不良影响.FCM所测细胞 是单个分散状态;对细胞团块, 是单个分散状态;对细胞团块,细胞碎片尽可能 细胞的活性不受损害, 少;细胞的活性不受损害,以保证下一步的荧光 染色处理不受影响. 染色处理不受影响.
能量传递染料: 能量传递染料:
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起, 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起,在 488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光 波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光 染料产生的荧光信号. 染料产生的荧光信号.
CY5 488nm Laser CY5 PE
300 nm 400 nm 500 nm
Emisson
600 nm 700 nm
DNA
( 二 ) 荧 光 补 偿
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻 荧光通道的信号加以扣除的技术称"荧光补偿" 荧光通道的信号加以扣除的技术称"荧光补偿"
四 细胞分选原理
(一)分选的基本原理
488 nm laser
CY5
(二)免疫荧光标记
荧光染料与细胞成分的结合方式: 荧光染料与细胞成分的结合方式: 结构亲和方式 嵌入结合方式 共价结合方式 荧光抗体特异性结合方式 1,直接免疫荧光染色 , 2,间接免疫荧光染色 ,
3,双或多参数荧光抗体的组合标记 ,
荧光染料 FITC+PE FITC+T red FITC+PeCy5 FITC+ ECD F+P +PeCy5 F+P+APC 激发波长( 激发波长(nm) 488 488 568 488 488 488 488 633 发射波长( 发射波长(nm) 525 ,575 525 615 525, 675 , 525, 625 , 525,575,675 , , 525,575,675 , , 525 , 575 670 颜色 绿色, 绿色,橙色 绿色 红色 绿色, 绿色, 红色 绿色, 绿色,橙红色 绿,橙,红色 橙红色, 绿, 橙红色,红色 绿色, 绿色,橙色 红色
性 选 择
选
择
磁
珠
分
离
(二)分选的技术要求
分选速度:几千个细胞/ 1 ,分选速度:几千个细胞/秒 分选纯度:99.5% :99.5%左右 2 ,分选纯度:99.5%左右 3 ,分选收获率:90-95% 分选收获率:90 :904 ,分选得率
分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞 所占的百分比. 所占的百分比. 分选收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原 细胞样品中该亚群细胞数的百分比. 细胞样品中该亚群细胞数的百分比.
单细胞检测: 单细胞检测:信号处理
488 nm laser
二 散射光的测定
scatter): (一)前向散射光 (foword scatter):FSC 信号的强弱与细胞的大小相关 scatter): (二)侧向散射光(side scatter):SSC 侧向散射光( 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关
二,免疫分析中常用的荧光染料与标记染色
染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生 (一)免疫荧光标记最常用的荧光染料
荧光染料 FITC FITC PE(RDI) PE(RDI) ECD ECD PeCy-5 PeCy-5 PeCy-7 PeCy-7 PI PI APC APC 激发波长( 激发波长(nm) 488 488 488 488 488 488 488 488 488 488 488 488 633 633 发射波长( 发射波长(nm) 525 525 575 575 620 620 670 670 755 755 620 620 670 670 颜色 深蓝色 深蓝色 橙色 橙色 橙红色 橙红色 红色 红色 深红色 深红色 橙红色 橙红色 红色 红色
2,光学系统
激光,透镜组,光电倍增等. 激光,透镜组,光电倍增等.
Dichห้องสมุดไป่ตู้oic Filters
PMT
2
PMT 4
PMT
3
Flow cell
Bandpass Filters
PMT
1
Laser
(二) 基本工作原理
单细胞流: 单细胞流:流动室
单细胞照明: 单细胞照明:激光
488 nm laser
X轴表示绿荧光信号 轴表示绿荧光信号(CD3)强弱 轴则反应细胞的数量 强弱,Y轴则反应细胞的数量 轴表示绿荧光信号 强弱 轴则反应细胞的数量.
(二)双参数数据的显示
Two-Parameter Data Displays 细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞 数量的关系, 数量的关系,更重要的是获得了这二个参数之间 的相关关系,其中包含了更多的生物学信息.双 的相关关系,其中包含了更多的生物学信息. 参数数据显示最常用的是二维的散点图( 参数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot ).在二维图上,横轴代表第一个测量参数, Plot ).在二维图上,横轴代表第一个测量参数, 纵轴代表第二个测量参数. 纵轴代表第二个测量参数.