叶绿素a提取方案
叶绿素-a测定
叶绿素-a的测定方法原理（荧光分光光度法）用丙酮溶液提取浮游植物色素进行荧光测定，根据提取液酸化前后的荧光值，可分别计算叶绿素-a及脱镁色素的含量。
试剂及其配置1、丙酮溶液（9+1）：量取900ml丙酮与100ml水混合，保存在棕色试剂瓶中。
2、碳酸镁悬浮液（10g/L）:称取1g碳酸镁，加水至100ml，搅匀，盛试剂瓶中待用，用时需要再摇匀。
3、盐酸：=1.18g/ml4、盐酸溶液（5+95）：在搅拌下，将5ml盐酸缓慢的加到95ml水中，混匀，保存于滴定瓶中。
5、硅胶仪器及设备1、荧光计2、冰箱3、离心机4、电动吸引器5、过滤装置6、玻璃纤维滤膜：直径为25mm的WhatmanGF/C或孔径为0.45um的纤维素脂微孔滤膜7、具塞离心管：容量10ml8、干燥器9、棕色试剂瓶：容量100ml，1000ml10、量筒：容量100ml、200ml、1000ml11、定量加液器：容量10ml12、镊子一般实验室常用设备分析步骤1、样品制备量取一定体积海水（通常大洋水250ml-500ml，近岸或港湾水50-100ml），加2ml 碳酸镁悬浮液，混匀，用玻璃纤维滤膜或孔径为0.45um的纤维素脂微孔滤膜过滤，过滤负压不得2超过50KPa.2、样品提取将过滤了的样品的滤膜放入具塞离心管，加入10ml丙酮溶液，摇荡，放置冰箱冷藏室14-24h，提取叶绿素-a。
若虑得的样品不能及时提取，应该将滤膜抽干、对折，再套上一张滤纸置于含硅胶的干燥器内，贮存在低于1摄氏度的冰箱中。
3、样品离心离心速度：（3000-4000）r/min离心时间:10min4、样品测定荧光计激发波长为436nm,发射波长670nm零点调节：用丙酮溶液调节，使荧光计指针指零。
将提取的上层提取液注入测定池。
选择相应量程，测定样品的荧光值R b。
加2滴盐酸溶液至测定池，摇匀，经30s后再测其荧光值Ra。
5、仪器校正用标准叶绿素-a校正。
用分光光度计校正：取一定体积正处于指数增长期的单细胞藻类培养液，依上述方法提取其叶绿素-a，用分光光度法测定，计算该提取液的叶绿素-a浓度。
叶绿素a测定实验报告
叶绿素a测定实验报告（一）实验目的及意义水体富营养化可以通过跟踪监测水中叶绿素的含量来实现，其中叶绿素a是所有叶绿素中含量最高的，因此叶绿素a的测定能示踪水体的富营养化程度。
（二）水样的采集与保存1.确定具体采样点的位置2.在采样点将采样瓶及瓶盖用待测水体的水冲洗3-5遍3.将采样瓶下放到距水面0.5-1m处采集水样2.5L4.在采样瓶中加保存试剂，每升水样中加1%碳酸镁悬浊液1mL5.将采样瓶拧上并编号6.用GPS同步定位采样点的位置（三）仪器及试剂仪器：1.分光光度计2.比色池：10mm3.过滤装置：过滤器、微孔滤膜（孔径0.45μm，直径60mm）4.研钵5.常用实验设备试剂：1.碳酸镁悬浮液：1%。
称取1.0g细粉末碳酸镁悬浮于100mL蒸馏水中。
每次使用时要充分摇匀2.乙醇溶液（四）实验原理将一定量的试样用微孔滤膜过滤，叶绿素会留在滤膜上，可用乙醇溶液提取。
将提取液离心分离后，测定750、663、645、630mm的吸光度，计算叶绿素的浓度。
（五）实验步骤1.浓缩：在一定量的试样中添加0.2mL碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60mm 的微孔滤膜吸滤.过滤器内无水分后,还要继续抽吸几分钟.如果要延时提取,可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。
2. 提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入7mL乙醇溶液至滤纸浸湿的程度,把滤膜研碎,再少量地加乙醇溶液，把滤膜完全研碎，然后用乙醇溶液将已磨碎的滤膜和乙醇溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的总体积不超过10mL，盖上管塞，置于的暗处浸泡24h。
3.离心：将离心管放入离心机中，以4000r/min速度离心分离20min。
将上清液移入标定过的10mL具塞刻度管中，加少量乙醇于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。
此操作重复2-3次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至10mL。
4.测定：取上清液于10mm的比色池中，以乙醇溶液为对照溶液，读取波长750,663,645和630mm的吸光度。
叶绿体色素的提取、分离,测定叶绿素a、b含量
实验四、叶绿体色素的提取、分离及叶绿素a、b含量的测定刘家富（40508014）05生科（一）一、实验原理1.脂溶性叶绿体色素提取：可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
2.分离：（1）叶绿体色素的分离＜纸层析法＞因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
纸层析是以滤纸纤维为固定相，而以有机溶剂作为流动相。
由于样品中各物质有不同的分配系数，移动速度因此而不同，从而达到分离的目的。
（2）叶绿素与类胡萝卜素的分离<皂化反应>叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇与叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
3.叶绿素a、b含量的测定：根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其溶液浓度c和液层厚度L成正比，即：A=φCL(φ为吸光系数)因此，根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，用公式即可计算出提取液中各色素含量。
测定663nm和645nm两个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b在对应波长下的吸光系数即可求出叶绿素a、b含量。
其校正过的公式为：C a＝12.7A663－2.69A645 Ca:叶绿素a浓度,mg/LC b＝22.9A645－4.68A663 Cb:叶绿素b浓度,mg/LCT＝Ca + Cb CT:叶绿素总浓度,mg/L二、仪器药品剪刀、漏斗、烧杯、分光光度计、分液漏斗、铁架台、移液管、吸耳球、试管、毛细管、平底大试管、石英砂、碳酸钙、丙酮、乙醚、四氯化碳、无水硫酸钠、30%KOH-甲醇溶液、天平、研钵、滤纸三、操作步骤1. 叶绿体色素的提取取去中脉叶片（2g左右），剪碎后加入少量石英砂、碳酸钙、纯丙酮5ml后放入研钵研磨成匀浆成深绿色提取液，之后用漏斗过滤。
实验名称：叶绿素a、叶绿素b含量测定
实验名称：叶绿素a、叶绿素b含量测定一、实验目的：熟悉在未经分离的叶绿体色素中测定叶绿素a、叶绿素b的方法。
二、实验原理；根据叶绿体色素提取液对可见光的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测其吸光度，即可利用公式计算出提取液中各种色素的含量：Ca=13.95A665-6.88A649Cb=24.96A649-7.32 A665C T= Ca+ Cb=18.08 A649+6.63 A665三、仪器、试剂与材料：仪器：分光光度计、离心机、研钵；试剂：96%乙醇溶液、石英砂、CaCO3粉末；材料：菠菜叶片；四、实验步骤：1.取干净的菠菜叶片剪碎，分别混匀。
2.称取剪碎的样品0.2g，各2份，分别放入研钵中，加少量石英砂和CaCO3粉末、及2-3ml 96%乙醇溶液，研成匀浆，倒入离心管，再用96%乙醇溶液多次洗涤研钵，洗涤液也倒入离心管中。
3．将离心管放入离心机后取上述提取液放入比色皿中，以96%乙醇为对照，分别测定665nm、649nm处的吸光度值。
4.按公式计算提取液中叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b的浓度。
五、实验结果及分析：1.研磨提取叶绿素是加入石英砂和CaCO3粉末各有什么作用？加入石英砂有助于研磨得更充分；加入CaCO3粉末可以保护叶绿素在研磨时不被破坏。
2.计算: A665(1)=0.399A A665(2)=1.237A 故A665=0.818AA649(1)=0.208A A649(2)=0.626A 故A649=0.417A 所以: Ca=13.95A665-6.88A649=8.542Cb=24.96A649-7.32 A665=4.421C T= Ca+ Cb=18.08 A649+6.63 A665=12.963。
叶绿素a的测定原理
叶绿素a的测定原理叶绿素a是一种存在于植物和藻类细胞叶绿体中的绿色色素，它起到了光合作用中接受和传递光能的关键作用。
测定叶绿素a的浓度对于研究光合作用的机制以及评估植物和藻类的生长状态具有重要意义。
在实验室中，存在多种方法来测定叶绿素a的浓度，其中包括光度法、荧光法和高效液相色谱法。
下面将重点介绍常用的光度法测定叶绿素a的原理和步骤。
光度法是一种通过测量溶液对特定波长的光的吸收来确定溶液中某种组分浓度的方法。
对于叶绿素a的测定，通常使用的波长为650nm或663nm。
叶绿素a在这两个波长的光下有很强的吸收能力，而溶液中的其他组分对该波长的光吸收较小。
因此，测定叶绿素a的浓度可以通过测量溶液对650nm或663nm光的吸光度来间接确定。
下面是光度法测定叶绿素a浓度的一般步骤：1. 样品制备：将待测样品中的叶绿素a提取到有机溶剂中，一般使用甲醇、乙醇或二氯甲烷等极性较强的有机溶剂作为提取剂。
提取的方法可以根据需求选择，包括搅拌法、超声波法或研磨法等。
提取过程需要避光，以防叶绿素a被光降解。
2. 溶液制备：将提取出的叶绿素a溶解在适当的溶剂中，一般使用甲醇或乙醇等有机溶剂。
溶液中的叶绿素a浓度可以通过分光光度计测定吸光度来确定。
3. 吸光度测定：使用分光光度计，在650nm或663nm的波长下测量样品吸光度。
为了获得准确的测量结果，一般需要对比测量待测样品和纯溶剂的吸光度，以消除对溶剂的吸光干扰。
4. 计算叶绿素a浓度：根据比色法或校正曲线法，将测得的吸光度转换为叶绿素a的浓度。
比色法是通过比较待测样品吸光度与已知浓度叶绿素a标准溶液吸光度的关系，进行定量测定。
校正曲线法是首先制备不同浓度的叶绿素a标准溶液，然后测定它们的吸光度并绘制出吸光度与浓度的标准曲线，通过待测样品的吸光度在标准曲线上插值得到其浓度。
需要强调的是，在测定叶绿素a浓度时，有几个实验注意事项需要注意。
首先，提取过程需要避光，以免叶绿素a被光降解，影响测量结果。
叶绿素的提取、分离和测定
Ca=12.7OD663-2.69OD645 Cb=22.9OD645-4.68OD663 Ct=Ca+Cb=20.2D645+8.02D663
解方程式得
(二）步骤
称取0.5g叶片，剪碎后置于玻璃匀浆器中加纯丙酮5mL，研成匀浆，用80%丙酮10mL洗匀浆器，用80%丙酮定容到25mL，避光静置5min。用移液管吸取上面的绿色清液1mL置于一大试管中，加入丙酮4ml稀释，摇动试管，作测定用。
测量光密度值 取上述提取液以80%丙酮作为空白对照，于663及645nm下读取光密度值
计算结果代入公式求出各来自绿素的含量（单位mg/L）最后计算时需考虑稀释因子
叶绿素a含量（mg/g鲜重）=CA*5 *25*2/1000 =0.25CA
叶绿素b的含量（mg/g鲜重）=0.25CB
研钵、吸管、小烧杯、试管、培养皿等
01
95%酒精、石油醚
02
碳酸钙
03
（二）仪器和药品
（三）步骤
用天平称取15g鲜叶，剪碎放入研钵中，加少量的CaCO3粉末及95%酒精5-10mL研成糊状，再加95%酒精20mL，充分混匀以提取叶片匀浆中的色素，5-10分钟后，过滤入三角烧瓶中加塞待用。
取一张色层分析纸或定性滤纸代用，剪成圆形，直径应略大于培养皿的直径；将圆形滤纸平放在培养皿上，用滴管吸取叶绿素提取液，滴在滤纸的中心位置，稍干后，再重复操作几次；然后取另一滴管吸取石油醚，慢慢地推动叶绿素提取液，不久即可看到分离的各种色素的同心圆环,由内到外依次为：叶绿素a为蓝绿色、叶绿素b为黄绿色、叶黄素呈鲜黄色、胡萝卜素为橙黄色。
叶绿素a、b在长波方面的最大吸收峰分别为为663nm和645nm。
叶绿素的提取与分析测定
叶绿素的提取与分析测定叶绿素的提取与分析测定是一项重要的生物技术实验，主要用于研究植物光合作用中的重要色素——叶绿素。
下面将详细介绍实验的步骤、方法和数据分析。
一、实验目的本实验旨在提取和分析测定叶绿素，了解其在植物光合作用中的重要作用，并为进一步研究植物生长和发育提供基础数据。
二、实验原理叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，它能够吸收太阳光能，并将其转化为化学能，为植物的生长和发育提供能量。
叶绿素广泛存在于植物的绿色组织中，尤其在叶片中含量最为丰富。
本实验将采用有机溶剂（如乙醇、丙酮等）从植物组织中提取叶绿素。
提取后的叶绿素可通过分光光度法进行定量分析。
三、实验步骤1.样品准备：选取新鲜植物组织（如叶片），用蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，称取一定质量（m）的样品备用。
2.叶绿素提取：将样品放入研钵中，加入适量有机溶剂（如乙醇-丙酮混合液），研磨成匀浆。
将匀浆转入离心管中，于低温下离心（如4℃、10000 r/min），收集上清液备用。
3.叶绿素定量分析：取一定体积（V）的上清液，加入适量蒸馏水稀释，用分光光度计在663nm和646nm波长下测定吸光度（A）。
根据朗伯-比尔定律，叶绿素的浓度（C）可由吸光度计算得出。
公式如下：C = (11.77A663 -2.59A646) / m / V4.数据记录：记录每个样品在各波长下的吸光度，并计算出叶绿素浓度。
5.数据分析：对所得数据进行统计分析，比较不同样品间的叶绿素含量差异，并绘制柱状图或饼图等图形表示结果。
四、实验结果与数据分析假设我们选取了三种不同植物的叶片进行实验，以下是实验所得的数据：1.三种植物叶片中叶绿素的含量存在差异，其中样品1的叶绿素含量最高，样品3的含量最低。
这可能与不同植物的生物学特性有关。
2.根据所得数据绘制柱状图或饼图等图形，可以直观地展示不同样品间的叶绿素含量差异。
这有助于我们进一步了解植物间的差异以及叶绿素在植物生长和发育中的作用。
提取测定大型海藻叶绿素a的新方法研究1 (1)
20040601
提取测定大型海藻叶绿素ａ的新方法研究
捅姜
本文从提取手段、提取溶剂和检测方法等几个方面综述了大型海藻叶绿素ａ 提取测定方法进展，并在此基础上选择青岛近海有代表性的十余种大型海藻作为 研究对象，使用浸提和研磨等手段，对不同溶剂提取测定这些大型海藻叶绿素ａ 的能力进行了对比分析，以此为基础分析了有机溶帮分子结构对大型海藻叶绿素 ａ提取能力的影响，并提出了新的提取测定大型海藻叶绿素ａ的方法。同时以褐 藻裙带菜为代表使用高效液相色谱分析了其在不同溶剂和提取手段下的色素组 成和含量的差异，并将分光光度法和高效液相色谱法的结果进行了对比分析。
尖锐，洗脱时间接近的色素能够实现基线上的分离，易于定性和定量，是优秀的 提取溶剂。
所选的８种溶剂对裙带菜进行浸提和研磨所获得的ＨＰＬＣ色索分析结果表 明：在浸提方法中，以Ｅｔｈａｎｏｌ浸提所褥的Ｃｈｌ－ａ结果最高，其次是ＤＭＡＣ浸提。 但是Ｅｔｈａｎｏｌ浸提极性色素（Ｃｈｌ－ｃｌ和Ｃｈｌ—ｃ２）的结果琨显低于ＤＭＡＣ和其它溶 剂，同样，ＡＣＥ和９０％ＡＣＥ对Ｃｈｌ—ｃｌ和Ｃｈｌ．ｃ２的结果也比ＤＭＡＣ差。在所研 究的试剂范围内，ＤＭＡＣ是提取大型海藻色素能力最优秀的溶剂。
对绿藻：叶绿素ａＯ＿ｇ／ｍ］）＝１１．５８Ｅ６６４—１．８８风４７ 对褐藻：叶绿素ａ０Ⅲｇ／ｍ１）＝１１．１４Ｅ６６４—０．４０ Ｅ６３０ 对红藻：叶绿素ａ（肛ｇ／ｍ１）＝１１．５０Ｅ６６４·１．５０ Ｅ６４７—０．０８ Ｅ６３０ 选择了８种溶剂提取裙带菜中色素并用于高效液相色谱分析。在选定的溶 剂中，ⅡⅡ、ＩＳＰ和ＳＢＡ会造成色素峰的变形，对色素的定性定量分析带来困难， 不适用于高效液相色谱分析藻类色素。根据峰形对溶剂性能进行排序： ＤＭＡＣ＞９０％ＡＣＥ＞ＭＥＮ＞ＡＣＥ＞Ｅｔｈａｎｏｌ＞ＴＨＦ＞ＩＳＰ＞ＳＢＡ。ＤＭＡＣ中的色素峰峰形
叶绿素的提取分离及含量测定
叶绿素a 、b 含量测定含量测定【实验目的】熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a 和b 的方法及其计算。
的方法及其计算。
【实验原理】 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer 定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。
到两种组分的含量。
如图3-3叶绿素a 和b 的吸收光谱曲线，叶绿素a 的最大吸收峰在663nm ，叶绿素b 在645nm ，吸收曲线彼此又有重叠。
，吸收曲线彼此又有重叠。
根据Lambert-Beer 定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C 与光密度OD 之间有如下的关系：之间有如下的关系：OD 1=C a ·k a1+C b ·k b1 （1）OD 2=C a ·k a2+C b ·k b2 （2）式中：C a 为组分a 的浓度，g/L ；C b 为组分b 的浓度，g/L ；OD 1为在波长λ1（即组分a 的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD 值；值；OD 2为在波长λ2（即组分b 的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD 值；值；k a1为组分a 的比吸收系数，即组分a 当浓度为1g/L 时，于波长λ1时的光密度OD 值；值；k b2为组分b 的比吸收系数，即组分b 当浓度为1g/L 时，于波长λ2时的光密度OD 值；值；k a2为组分a （浓度为1g/L ），于波长λ2时的光密度OD 值；值；k b1为组分b （浓度为1g/L ），于波长λ1时的光密度OD 值；值；从文献中可以查到叶绿素a 和b 的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L 时，比吸收系数k 值如下：值如下：波 长（nm ）叶绿素a 叶绿素b 66382.04 9.27 645 16.75 45.60将表中数值代入上式（1）、（2），则得：），则得：OD 663=82.04×=82.04×C C a +9.27×+9.27×C C bOD 645=16.75×=16.75×C C a +45.60×+45.60×C C b经过整理之后，即得到下式：经过整理之后，即得到下式：C a =0.0127 OD 663-0.00269 OD 645C b =0.0229 OD 645-0.00468 OD 663如果把C a ，C b 的浓度单位从原来的g/L 改为mg/L ，则上式可改写为下列形式：，则上式可改写为下列形式： C a =12.7 OD 663-2.69 OD 645 （3）C b =22.9 OD 645-4.68 OD 663 （4）C T = C a + C b =8.02 OD 663+20.21 OD 645 （5）（5）式中C T 为总叶绿素浓度，单位为mg/L 。
叶绿素a和叶绿素b的快速鉴定
叶绿素a和叶绿素b的快速鉴定目录一、内容概括 (2)1. 叶绿素简介 (2)2. 叶绿素a与叶绿素b的重要性 (3)二、实验原理 (4)1. 叶绿素a与叶绿素b的光谱特性 (5)2. 鉴定原理 (5)三、材料与方法 (6)1. 实验材料 (7)样品来源 (8)样品处理 (8)2. 实验仪器与试剂 (9)萃光仪 (10)分光光度计 (10)缓冲液 (11)3. 实验步骤 (12)样品提取 (12)测定波长 (13)重复测定 (14)四、结果分析 (15)1. 叶绿素a与叶绿素b的吸收光谱图 (16)2. 数据处理与结果解读 (17)3. 结果讨论 (18)五、结论 (20)1. 快速鉴定叶绿素a与叶绿素b的效果 (21)2. 实验的局限性及改进方向 (21)一、内容概括本文档旨在介绍叶绿素a和叶绿素b的快速鉴定方法。
内容将涵盖叶绿素a和叶绿素b的基本性质、特点及其在生物体系中的重要性。
本文还将详细阐述快速鉴定叶绿素a和叶绿素b的流程和步骤，包括实验前的准备、实验操作的具体步骤以及结果的解析。
还将提及一些可能出现的问题以及解决策略，以确保实验的准确性和可靠性。
本文档旨在为研究人员、学生及叶绿素相关领域的从业者提供一种便捷、高效的鉴定方法，以推动相关领域的研究进展。
1. 叶绿素简介又称植物色素，是植物中一类重要的绿色色素，广泛存在于高等植物、藻类和某些微生物中。
它们是植物进行光合作用的关键色素，通过吸收和转化光能，将二氧化碳和水转化为有机物质，并释放氧气。
叶绿素的结构中包含一个镁原子，其骨架由两个吡咯环和一个碳链组成，这使得叶绿素具有特定的光谱特性，能够在特定波长下吸收光。
叶绿素a和叶绿素b是叶绿素中最主要的两种类型，它们在结构上有所不同。
叶绿素a的分子结构中除了镁原子外，还包含一个长链的碳链和一个醛基，这使得它呈现出蓝绿色的特征。
而叶绿素b的分子结构中则不含醛基，因此它呈现出黄绿色。
尽管这两种叶绿素在颜色上有所差异，但它们在光合作用中的作用却是相同的。
叶绿素a测定
实验三富营养化湖中藻量的测定（叶绿素a法）一、实验目的富营养化湖由于水体受到污染，尤以氮磷为甚，致使其中的藻类旺盛生长。
此类水体中代表藻类的叶绿素a浓度常大于10微克/升。
本实验通过测定不同水体中藻类叶绿素a浓度，以考查其富营养化情况。
二、器材与用品1、分光光度计（波长选择大于750nm，精度为0.5－2nm）。
2、比色杯（1cm；4cm）。
3、台式离心机（3500r/min）4、离心管（15ml具刻度和塞子）；冰箱5、匀浆器或小研钵。
6、蔡氏滤器；滤膜（0.45微克，直径47mm）。
7、真空泵（最大压力不超过300kpa）。
8、MgCO3悬液：lg MgCO3细粉悬于100ml蒸馏水中。
9、90％的丙酮溶液：90份丙酮＋10份蒸馏水。
10、水样：两种不同污染程度的湖水水样各2L.三、方法和步骤1、按浮游植物采样方法，湖泊、水库采样500ml，池塘300ml。
采样点及采水时间同“浮游植物”。
2、清洗玻璃仪器：整个实验中所使用的玻璃仪器应全部用洗涤剂清洗干净，尤其应避免酸性条件下而引起的叶绿素a分解。
3、过滤水样；在蔡氏滤器上装好滤膜，每种测定水样取50－500ml减压过滤。
待水样剩余若干毫升之前加入0.2ml MgCO3悬液、摇匀直至抽干水样。
加入MgCO3可增进藻细胞滞留在滤膜上，同时还可防止提取过程中叶绿素a被分解。
如过滤后的载藻滤膜不能马上进行提取处理，应将其置于干燥器内，放冷（4℃）暗处保存，放置时间最多不能超过48小时。
4、提取；将滤膜放于匀浆器或小研钵内，加2－3ml90％的丙酮溶液，匀浆，以破碎藻细胞。
然后用移液管将匀浆液移入刻度离心管中，用5ml90％丙酮冲洗2次，最后向离心管中补加90％丙酮，使管内总体积为10ml。
塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分振荡，放冰箱避光提取18－24小时。
5、离心：提取完毕后，置离心管于台式离心机上3500r/min，离心10min，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞上塞子，3500r/min在离心10min。
水质 叶绿素a的测定
水质叶绿素a的测定1. 定义叶绿素是植物光合作用中的重要光合色素。
通过测定浮游植物叶绿素，可掌握水体的初级生产情况，在环境监测中，可将叶绿素a含量作为湖泊富营养化的指标之一。
2. 水样的采集与保存可根据工作的需要进行分层采样或混合采样。
湖泊、水库采样500mL，池塘300mL，采样量视妇幼植物分布而定。
若浮游植物数量较少，也可采样1000mL。
采样点及采样时间同“浮游植物”。
水样采集后应放在阴凉出，避免日光直射。
最好立即进行测定的预处理，如需经过一段时间（4~48h）方可进行预处理，则应将水样保存在低温（0~4℃）避光处。
在每升水样中加入1%碳酸镁悬浊液1mL，以防治酸化引起色素溶解。
水样在冰冻情况下（-20℃）最长可保存30d。
3. 仪器和设备3.1 分光光度计。
3.2 真空泵。
3.3 离心机。
3.4 乙酸纤维滤膜（孔径0.45µm）。
3.5 抽滤器。
3.6 组织研磨器或其他细胞破碎器。
3.7 碳酸镁粉末。
3.8 90%丙酮。
4. 试验程序4.1 以离心或过滤浓缩水样，在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜。
倒入定量体积的水样进行抽虑，抽虑时负压不能过大（约为50kPa）。
水样抽完后，继续抽1~2min，以减少滤膜上的水分。
如需短期保存1~2d时，可放入普通冰箱冷冻，如需长期保存（30d），则应放入低温冰箱（-20℃）保存。
4.2 取出带有浮游植物的滤膜，在冰箱内低温干燥6~8h后放入组织研磨器中，加入受凉碳酸镁粉末及2~3mL 90%丙酮，充分研磨，提取叶绿素a。
用离心机（3000~4000r/min）离心10min。
将上清液倒入5mL或10mL容量瓶中。
4.3 在用2~3mL的90%的丙酮，继续研磨提取，离心10min，并将上清液再转入容量瓶中。
重复1~2次，用90%的丙酮定容为5mL或10mL，摇匀。
4.4 将上清液在分光光度计上用1cm光程的比色皿，分别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。
叶绿素的提取及含量测定实验报告
叶绿素的提取及含量测定实验报告一、实验目的1、掌握叶绿素提取的原理和方法。
2、学会使用分光光度计测定叶绿素的含量。
3、了解叶绿素的性质和在植物光合作用中的重要作用。
二、实验原理叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，包括叶绿素 a 和叶绿素 b两种类型。
叶绿素不溶于水，易溶于有机溶剂，如丙酮、乙醇等。
在提取过程中，利用有机溶剂将叶绿素从植物叶片中溶解出来。
叶绿素溶液在特定波长下有吸收峰，叶绿素 a 在 663nm 波长处，叶绿素 b 在 645nm 波长处。
根据朗伯比尔定律，吸光度与溶液中物质的浓度成正比。
通过测定提取液在这两个波长下的吸光度，并利用公式计算，可以得出叶绿素a 和叶绿素b 的含量，进而计算总叶绿素含量。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜菠菜叶2、实验仪器电子天平、研钵、漏斗、玻璃棒、容量瓶（25ml、50ml）、分光光度计、移液管（1ml、2ml、5ml）、剪刀3、实验试剂丙酮、无水乙醇、石英砂、碳酸钙四、实验步骤1、材料准备选取新鲜的菠菜叶，洗净擦干，去除叶柄和中脉，剪碎备用。
2、叶绿素提取称取 2g 剪碎的菠菜叶放入研钵中，加入少量石英砂和碳酸钙，再加入 5ml 丙酮和 5ml 无水乙醇，充分研磨成匀浆。
用漏斗过滤，将滤液收集到 25ml 容量瓶中，并用少量丙酮和无水乙醇冲洗研钵和漏斗，将冲洗液也倒入容量瓶中，最后用丙酮和无水乙醇定容至刻度，摇匀。
3、吸光度测定以丙酮和无水乙醇的混合液为空白对照，用分光光度计分别测定叶绿素提取液在 663nm 和 645nm 波长下的吸光度。
每个波长重复测定 3 次，取平均值。
4、计算叶绿素含量根据以下公式计算叶绿素 a、叶绿素 b 和总叶绿素的含量（单位：mg/g）：叶绿素 a 含量＝ 127×A663 269×A645叶绿素 b 含量＝ 229×A645 468×A663总叶绿素含量＝叶绿素 a 含量＋叶绿素 b 含量式中，A663 和 A645 分别为在 663nm 和 645nm 波长下的吸光度。
2-4叶绿素a测定
实验题目: 湖塘水体叶绿素a测定姓名：学号：班级：组别：第一组指导教师：1.实验概述1.1实验目的及要求(1)初步了解叶绿素a测定的原理和常规测定方法;(2)通过实验，掌握叶绿素。
的测定方法及富营养化水样的前处理方法;(3)熟练掌握抽滤装置及分光光度计的使用。
1.2实验原理浮游植物的主要光合色素是叶绿素((Chlorophyll)，常见的有叶绿素a、b和c。
叶绿素a (chl-a >存在于所有的浮游植物中，大约占有机物干重的1-2%，是估算浮游植物生物量的重要指标，因此浮游植物叶绿素a含量的测定成为浮游植物生物量的重要指标而被广泛应用。
浮游植物叶绿素a的测定方法有许多种，根据所使用的仪器可以分为高效液相色谱法<HPLC法)、荧光光度计法和分光光度计法等。
高效液相色谱法能够很精确地测定各种光合色素的含量，但由于仪器昂贵，分析操作步骤繁琐，一般不能用于野外大量样品的快速分析。
荧光光度计也能够精确地测定叶绿素a的含量，特别是能够测定叶绿素a含量较低的样品，但由于分析过程中容易受其他色素或色素衍生物的干扰，也不利于快速分析各类不同的野外样品。
因此，分光光度计法成为最常用的浮游植物叶绿素a含量的测定方法。
在所有分光光度计法中，根据所用的色素萃取液分为了丙酮法、甲醇法和乙醇等，再根据比色所用的，又分为单色法和多色法(例如单色丙酮法和四色丙酮法)等。
主要的细胞破碎法有研磨、低温冻融、超声破碎等。
尽管丙酮现在仍厂泛用于实际分析中，但由于丙酮的萃取效率比较差，特别是对蓝藻的叶绿素a的萃取效率比较低，使得甲醇和乙醇成为替代丙酮的色素萃取剂。
不过，甲醇对人体毒害性大，且在酸化过程中容易产生误差，于是，乙醇成为现在广泛应用的叶绿素a的萃取剂。
超声破碎法因快速、提取效率高等特点也被研究者所青睐。
本实验介绍一种以热乙醇为萃取溶剂，结合超声细胞破碎法为基础的叶绿素a含量侧定方法。
2.实验内容2.1实验方案设计每组选择一个池塘，实地取水样，测定水样的叶绿素a含量。
富营养化水体中藻类的测定叶绿素a法
（7）
CT为叶绿素的总浓度
（5） （6）
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实验仪器及材料
• 实验材料： • 富营养化水体中的藻类
• 实验仪器及试剂： • UV-1700分光光度计；天平；剪刀；打孔器；研钵；移液管；漏斗；量筒；培养皿；滤纸；丙酮；石 英砂；CaCO3；
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实验步骤
1. 提取叶绿素
于天平上称取0.5g藻体，（也可用打孔器打取一定数量的 叶圆片，计算总的叶面积），剪碎后置于研体中，加入 5ml 80%丙酮，少许CaCO3和石英砂。仔细研磨成匀 浆，用滤斗过滤到10ml量筒中，注意在研钵中加入少量 80%丙酮将研钵洗净，一并转入研钵中过滤到量筒内， 并定容至10ml。将量筒内的提取液混匀，用移液管小心 抽取5ml转入25ml量筒中，再加入80%丙酮定容至 25ml（最终植物材料与提取液的比例为W：V＝0.5： 50＝1：100，叶色深的植物材料比例要稀释到1： 200）。
在海岸或海湾中，引起“赤潮”的藻类主要是甲 Ceratium ）、环沟藻属
（Gymnodinium）、膝沟藻属（Gonyaulax
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水体富营养化
•评价水体富营养化的指标
❖ 测定水域中光合作用强度与呼吸作用强度之比
❖测定藻类生产潜在能力（AGP） ❖黑❖其它评价富营养化的方法
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水体富营养化
水体形成富营养化的指标是：水体中含氮量大于0.2-0.3 mg/L ，含磷 量大于0.01~0.02mg/L ，生化需氧量（BOD5 ）大于10mg/L。在pH值7~9 的淡水中细菌总数达到105个／ml，标志藻类生长的叶绿素a大于10g／L。
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水质 叶绿素 a 的测定 分光光度法
水质叶绿素 a 的测定分光光度法以水质叶绿素 a 的测定分光光度法为标题叶绿素是植物和藻类等光合生物中的一种重要色素，它在光合作用中起到接收和转换光能的作用。
因此，叶绿素的测定对于研究光合作用、水质监测以及环境保护等方面具有重要意义。
本文将介绍一种常用的测定叶绿素 a 含量的方法——分光光度法。
分光光度法是通过测量样品在不同波长下的吸光度来确定其中叶绿素 a 的含量。
首先，我们需要准备一定浓度的叶绿素 a 标准溶液作为参照物。
然后，将待测样品中的叶绿素 a 提取出来，通常采用酒精提取法或醚提取法。
提取后的溶液中，叶绿素 a 会表现出特定的吸光度谱，即在特定波长下吸收特定的光线。
接下来，我们需要使用分光光度计来测定叶绿素 a 的吸光度。
首先，调节分光光度计到叶绿素 a 吸收峰值波长，通常为665 nm。
然后，将标准溶液和待测样品溶液分别放入光度计的比色皿中，设置比色皿为空白。
在特定波长下测量样品的吸光度，并记录下数值。
在得到吸光度数值后，我们可以利用标准曲线来计算出样品中叶绿素 a 的浓度。
标准曲线是通过制备一系列已知浓度的叶绿素 a 标准溶液，并测定它们的吸光度得到的。
通过绘制标准曲线，我们可以根据待测样品的吸光度数值，在曲线上找到相应的浓度值。
需要注意的是，分光光度法测定叶绿素 a 的时候，样品中可能存在其他物质的干扰，这会导致测定结果的误差。
为了减小干扰，我们可以采用去色处理，即利用活性炭或其他吸附剂去除样品中的色素。
此外，为了保证测定结果的准确性，我们需要进行多次测定，并计算平均值。
总结起来，分光光度法是一种常用的测定叶绿素 a 含量的方法。
通过分光光度计测量样品在特定波长下的吸光度，并利用标准曲线计算出叶绿素 a 的浓度。
该方法简单、快速，并且具有较高的准确性和重复性。
在水质监测、环境保护和光合作用研究等领域，分光光度法都发挥着重要的作用。
通过准确测定叶绿素 a 的含量，我们可以更好地了解光合生物的生长状况和环境状况，为相关研究和应用提供可靠的数据基础。
叶绿素的提取的实验方案研究
实验叶绿体色素的提取分离一、目的通过对叶绿素的提取方法的研究，找出最方便、最简单可行的实验方法。
二、材料用具及仪器药品（1）层析液配方：①石油醚20ml+丙酮2 ml +苯1ml②93号汽油③9 ml95%乙醇+1ml苯（2）天平、研钵、烧杯、量筒、滤纸、脱脂棉、粉笔、表面皿、剪刀、漏斗、滴管、90- 95%乙醇（3）紫鸭趾草、菜心、韭菜、菠菜等叶子三、原理叶绿体含有叶绿体色素，叶绿体色素主要包括有Chla、Chlb、叶黄素和胡萝卜素，可用有机溶剂乙醇、丙酮等将它们提取出来（因为丙酮有毒，所以这里可以用酒精代替）。
纸层析法是分离叶绿体色素最简单的方法。
它的原理是利用混合色素中各个成分物理、化学性质的差别，分别以不同程度分布于两相中（即固定相和流动相）。
由于它们以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
叶绿体色素容易受光的破坏，变成褐色。
叶绿体色素具有荧光现象。
四、方法1、纸层析法分离叶绿体色素（方法1）（1）称取新鲜叶片（紫鸭趾草、菜心、菠菜对比效果）1克，剪碎，放在研钵中，加乙醇5m1，加入少许碳酸钙，共研磨成匀浆。
（2）提取叶绿素：①用滤纸过滤。
②静置匀浆5分钟，用滴管直接吸取上面的色素提取液4～5滴。
③用脱脂棉过滤。
（3）取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将它剪成长约10cm ，宽约1cm 的滤纸条。
用毛细管吸取色素提取液。
在滤纸条的一端（约距这一端的1cm处）划出一条滤液细线，等滤液干燥后，再重复划4～5次。
（4）将滤纸条的另一端（约距这一端1cm处）拆成“V”字形，并将它挂在放有层析液的烧杯壁上（注意：色素线要略高于层析液面，且滤纸条下端最好不要碰到烧杯壁），盖上培养皿。
（5）经几分钟后，观察色素带的分布，最上端为胡萝卜素，其次是叶黄素，再次是叶绿素a，最后是叶绿素b。
把色素提取液一滴一滴地滴在滤纸的中央（滤纸要平放在表面皿或培养皿上）。
待色素点风干后，向该色素点上慢慢滴加层析液，使四种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）在滤纸上分离出来，形成4个圆圈。
植物组织叶绿素的提取及分离
植物组织中叶绿素的提取及分离一、实验目的1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；2、通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。
二、实验原理绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。
叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)，其差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。
它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。
植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。
尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。
胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。
它有三种异构体，即a-,β-和γ-胡萝卜素，其中β-异构体含量最多，也最重要。
在生物体内，β-体受酶催化氧化即形成维生素A。
目前β-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。
叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。
与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。
本实验从菠菜中提取上述几各色素，并通过柱层析进行分离。
三、主要仪器与试剂仪器：研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸试剂：硅胶G，中性氧化铝，甲醇，石油醚（60-90℃），丙酮，乙酸乙酯，菠菜叶。
四、实验流程五、操作步骤1、菠菜色素的提取称取2g洗净后的新鲜（或冷冻）的菠菜叶，用剪刀剪碎并与10mL甲醇拌匀，在研钵中研磨约5min然后用布氏漏斗抽滤菠菜汁，弃去滤渣。
将菠菜汁放回研钵，每次用10mL 3:2（体积比）的石油醚-甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨并且抽滤。
合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用5mL水洗涤两次，以除去萃取液中的甲醇。
洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化。
弃去水-甲醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥后滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为1mL 为止。
叶绿素的提取和分离
考点1 绿叶中色素的提取和分离
题组一：考察实验选材、试剂的作用和实验操作：
(2013·江苏单科，5)关于叶绿体中色素的提取和分离实验的操作，正确的是 ( )。
A．使用定性滤纸过滤研磨液 B．将干燥处理过的定性滤纸条用于层析 C．在划出一条滤液细线后紧接着重复划线2～3次 D．研磨叶片时，用体积分数为70%的乙醇溶解色素
(2017全国Ⅲ)植物光合作用的作用光谱是通过测 量光合作用对不同波长光的反应（如O2的释放） 来绘制的。下列叙述错误的是( )
类胡萝卜素在红光区吸收的光能可用于光反应中 ATP的合成
叶绿素的吸收光谱可通过测量其对不同波长光的
A
吸收Байду номын сангаас来绘制
光合作用的作用光谱也可用CO2的吸收速率随光 波长的变化来表示
(2) 研磨时加无水乙醇
溶解色素
提取色素
(3) 加少量SiO2 (4) 加少量CaCO3
研磨充分
保护色素，防止叶绿素被破 坏
(5) 迅速、充分研磨
防止乙醇挥发，充分溶解色 素
(6)
盛放滤液的试管管口加棉 塞
防止乙醇挥发和色素氧化
(1) 滤纸预先干燥处理
使层析液在滤纸上快速扩散
分离色素
(2) 滤液细线要直、细、匀
解析 本题可排除错误选项。色素易被滤纸吸附，故用纱布过滤，A错 误；每次重复画色素滤液细线时，需等干燥后再进行，C错误；由于叶 绿体中的色素不溶于水，因此研磨叶片时需用无水乙醇或丙酮，D错误。 答案 B
易错警示！ 1、实验中的注意事项及操作目的
过程
注意事项
操作目的
(1) 选新鲜绿色的叶片 使滤液中色素含量高
使分离出的色素带平整不重 叠
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盘星藻叶绿素a的检测方法
1、实验器材：紫外-可见分光光度计、比色皿、抽滤器、微孔滤膜、直径为47mm孔径为0.7um 的玻璃纤维滤膜、真空泵、低温冰箱（能控制在-40+1度）、电子天平、电热恒温水浴锅、温度计、离心管（10ml）
实验药品及试剂：95 % 乙醇
2、实验步骤
⑴样品富集：将微孔滤膜放置在连接有真空泵的抽滤器上，准确量取定量体积的混匀水样进行抽滤，抽滤时负压不应超过20kpa ，逐渐减压，在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤。
用镊子小心将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干剩余水分如样品不能及时提取，应将吸干水分的滤膜放入培养皿中，外面包裹一层铝箔，放入以下的冰箱中保存
⑵叶绿素a的提取：准确称取0 . 5 g新鲜样品于10 m L具塞离心管中，置冰箱中冷冻1 h , 取出后加入10 m L在水浴锅中加热至50度的95%乙醇中，充分振摇后于暗柜中静置3h , 取上清液测定。
⑶含量测定：分别以相应的提取液为空白, 扫描测定各种叶绿素提取液在645 n m和663 n m的吸收值A 645、A 6 63, 利用 A r no n 法计算叶绿素含量。
叶绿素a浓度( m g /L )：
C h la = 12 . 7 A 663 - 2 . 69 A 6 45
①双波长分光光度法同时测定叶绿素 a 、b 汪志国, 王静, 李国刚(中国环境监测总站,北京10 002 9)
②测定浮萍叶绿素含量的方法研究黄 帆, 郭正元, 徐 珍(湖南农业大学农业环保研究所, 湖南长沙41 012
8 )
③分光光度法测定水体中叶绿素含量的改进戴欣，杨航，石岩，鲁雪，王玲静，李聪（松辽流域水资源保护局松辽流域水环境监测中心，吉林长春130021 ；河海大学，江苏南京210098 ）。