氨基酸总量的测定

氨基酸总量的测定

(茚三酮比色法)

一、方法原理：

氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，可产生二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，据此可以比色测定氨基酸含量。

二、试剂：

1．2％茚三酮溶液：1g茚三酮(C9H403·2H2O)溶于25ml热水中，加入40mg氯化亚锡；(SnCl2·2H2O)，搅拌溶解，滤去残渣，滹液放在冷暗处过夜，用水定容为50ml，保存声冷暗处。

如茚三酮有微红色，配成的溶液也带红色，将影响比色测定，需将茚三酮重结晶后再用方法是：取5g茚三酮溶于20ml热水中，加入0.2g活性炭，轻轻摇动，放三十分钟后过滤，滤液置冰箱中过夜，次日过滤，用1ml冷水淋洗结晶，然后放在干燥器中干燥，装瓶保存。2。磷酸盐缓冲液(pH8.0)：

①1／15mol/l磷酸二氢钾溶液：取KH2P04 0.9070g溶于lOOml水中。

②1／15mol/l磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)23.876g溶于水，加水至1000ml。

取①50ml与②95ml混匀即得。

3．10％醋酸：取lOml冰醋酸加水至lOOml。

4，氨基酸标准溶液(200ppm)：称取干燥的氨基酸(白氨酸，或其它的氨基酸)0.2000g溶解于水，定容为1000ml。

三、仪器：

水浴，721分光光度计。

四、操作步骤：

(一)标准曲线绘制：

分别吸取氨基酸标准溶液(200ppm)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml各置于25ml容量瓶中,加水补充至4.0ml，各加入缓冲液lml，加入茚三酮lml，摇匀。置沸水浴中加热15分钟，取出迅速冷却至室温，—用水定容。放置15分钟，在570nm波长下测定，绘制标准曲线。氨基酸浓度分别为0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.Oppm。

(二)样品测定：

l提取样品：称取1.0 ~2.0g植物样品(新鲜样或干样)，加5m1 10％醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入lOOml容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。

2．样品液测定：移取样品待测液l ~4毫升，放人25ml容量瓶中，加水至4.Oml，加缓冲液1ml，加茚三酮1ml，摇匀。置沸水浴中加热15分钟，取出用冷水迅速冷却至室温，加水定容。放置15分钟后，测定。

同时测定待测液空白值，扣除空白值后，从标准曲线上查得氨基酸的浓度。

五、结果计算：

氨基酸总量(mg％) =(ppm * l00 * 25 * 100)/(W * V * 1000)

= (ppm * 250)/(W * V)

式中：ppm--由标准曲线查得样品测定液氨基酸浓度；

W——称样品重(g)

V——吸取样品待测液体积(ml)

六。注意事项：

1．配制茚三酮溶液的茚三酮和SnCl2都应该用五色晶体，配成的溶液一般应在10天内用完。2．应控制反应溶液的pH才能得到重现性好的结果，反应液pH在6.2 ~ 6.4之间为宜，所加试液和缓冲液的量的比例可为2：1或1：1。

3．要控制加热温度和时间，温度过高容易褪色，温度低发色不全。沸水浴中加热发色快，但可能受热不均匀及容易褪色，可以降低温度(80O C)，延长加热时间，使发色均匀。也可以在

烘箱中加热，105O C烘10分钟。。

4．茚三酮与氨萋酸反应生成的颜色在1小时内稳定，浓度高时褪色较快，应在发色稳定、加水定容后，在半小时内比色。

5．明显带色的试样，可以用活性炭脱色，但某些氨基酸(酪氨酸等)也被活性炭吸附，会使结果降低。

6．茚三酮与氨、胺类、氨基糖类、尿素、蛋白质等也发生反应，这些物质会干扰测定。7．植物样品处理方法不同，游离氨基酸组成会有变化，应用分析结果时应说明样品处理