氨基酸总量的测定
食品氨基酸总量的测定(精)
第八章 食品氨基酸总量的测定【教学目标】：1.掌握氨基酸、含氮量等的概念和相关知识；2.掌握氨基酸液氮的测定方法和操作技能；3.了解比色法的原理，基本方法及仪器使用和维护的知识。
一、甲醛滴定法1原理氨基酸具有酸性的一COOH 基和碱性的一N 2H 基。
它们互相作用使氨基酸成为中性的内盐。
加入甲醛溶液时，一N 2H 基与甲醛结合，其碱性消失。
这样就可能用碱来滴定一COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸的量。
用碱完全中和一COOH 基时的pH 值为8.4~9.2。
2试剂（1）40%中性甲醛：用百里酚酞作指示剂，将甲醋用碱溶液中和至淡蓝色。
（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。
（3）0.1N 氢氧化钠标准溶液。
3操作方法称取粉碎样品5.00~10.00g 或液体样品5~10mL,置于烧杯中，加入50mL 水和活性碳约5g ，加热煮沸，过滤，用30~40mL 热水洗涤活性碳，收集滤液于三角瓶中，加入3滴百里酚酞指示剂，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。
加入中性甲醛20mL ，摇匀，静置1min ，此时蓝色已经消失，再用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。
记录第二次滴定时消耗的碱液毫升数。
4计算氨基酸态氮（%）=100014.0⨯⨯⨯WV N 式中：N----氢氧化钠标准溶液的当量浓度；V----氢氧化钠钠标准溶液的消耗量（第二次）（g ）;W----样品溶液相当于样品的量（g ）;0．014----氮的毫克当量。
5说明（1）用碱性溶液第一次滴定时，用pH 计控制滴定到溶液pH7.5后，然后加入中性甲醛继续用碱液滴定，又用pH 计控制用碱液滴定样液至pH9.2为终点较为正确。
（2）取相同2份样品溶液，其中1份加入中性红指示剂3滴，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至琥珀色为终点，另1份加入百里酚酞指示剂3滴和中性甲醛20mL ，静置1min 后，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。
按下列、公式计算：100014.0)((%)12⨯⨯-⨯==WV V N X 氨基酸 式中： 2V ------用百里酚蓝作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL ）；1V ------用中性红作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL ）；N ------标准氢氧化钠溶液的当量浓度；W------样品重量（g ）；0.014----氮的毫克当量。
8第六章 氨基酸定量测定
1.原理： 强离子交换树脂－二乙烯苯树脂： 交联度大，8-12％。 树脂的结构紧密，孔隙度小，适用于分子较小的氨 基酸的分离。选用Na型的树脂。
吸附：一般在pH2.2溶解样品，由于pH比较低，氨 基酸的H＋解离被抑制，氨基酸带正电荷，可以与阳 离子交换树脂发生交换。
样品 液
分离 柱
M
Na+
pK1
COOCH2(CH2)4+NH3
+NH 3
pK2 9.0
COO CH2(CH2)4+NH3 NNH2 NH2
赖氨酸的等当电＝（ pK1＋pK2）/ 2 = 9.75
洗脱：当pH2.2，3.3，4.9等缓冲液相继流经树脂时， 随着pH逐渐升高，氨基酸失去正电荷，与树脂结合 减弱，从树脂上脱落下来。由于氨基酸的氨基不同， 因此与柱子的结合能力不同。 酸性氨基酸带的正电荷少，等电点比较低，碱性氨 基酸带的正电荷多，被置换下来的pH比较高。
吹数分钟(或置于70～80℃烘
箱中烘干)即可观察到紫红色
的氨基酸斑点，脯氨酸例外，
为黄色斑点。
用铅笔圈出氨基酸斑点，量出溶剂前沿的距离及 各斑点中心与起点之间的距离，并计算各氨基酸 的Rf值。
原点到层析点中心的距离
Rf＝ 原点到溶剂前沿的距离
标准氨基酸薄层层析色谱
氨基酸的性质与Rf之间的关系
层析的分离是基于氨基酸的非极性性质。 物质的极性越小（即非极性越大）,在有机溶剂中分 配就越多，迁移率Rf就越大；
混合样
加样
洗脱剂
分离结果
影响电离的基团：氨基、羧基、胍基、咪唑基、酚基。
洗脱顺序： 酸性氨基酸，中性氨基酸，芳香族氨基 酸，碱性氨基酸 日立832型氨基酸分析仪的洗脱顺序： 天门冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，半胱，缬，蛋， 异亮，亮，酪，苯丙，赖，氨，组，精
样品前处理-酸水解
样品前处理
一、前处理方法
氨基酸总量的测定需要三种方法。
通常我们使用酸水解法测定
天冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，谷氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丙氨
酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，组氨酸，精氨酸等15种氨基酸，用氧化水解法测定胱氨酸和蛋
氨酸，用碱水解法测定色氨酸。
在酸水解过程中色氨酸被全部
破坏，无法测定，含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸）会被部分氧
化，无法侧准。
二、采样
样品须具有代表性，用四分法缩减分取25克左右，粉碎并通过
0.25mm孔径（60目）筛，充分混匀后待测。
由于氨基酸在氧
及碳水化合物存在下易破坏，所以样品粉碎时温度不能过高，
需低于50度。
对于粗脂肪含量大于或等于5%的样品，需先脱
脂，然后风干，混匀备用。
酸水解的样品应先测定粗蛋白的含
量。
样品的称量需用万分之以上天平。
三、前处理步骤
1、酸水解
A、称取含蛋白7.5-25mg的样品于20ml安培瓶中（切勿贴壁）
B、加入10ml 6mol/L盐酸，抽真空至小于7Pa后，冲氮气，再
抽真空充氮气，如此重复三次后，在充氮气情况下封口或拧紧螺丝盖。
C、封口后的安培瓶放入110度恒温干燥箱内水解22-24小时
D、冷却、混匀、开管、过滤，定容于25毫升容量瓶，取适量
滤液置于旋转蒸发仪中，60度以下抽真空，蒸干，加少
许水，反复1-2次
E、加入3-5ml PH2.2稀释液，使浓度达到50-250nmol/ml。
混
匀后过0.45微米滤膜，或10000转离心10分钟，后取上清，待上机用。
实验一 氨基酸总量的测定(发园艺.设施等)
实验一植物组织中氨基酸总量的测定(茚三酮比色法)一、目的意义和要求：二、原理：三、植物材料：1、发芽水稻种子：用水(对照)、50mmol/L NaCl和500mmol/L NaCl溶液分别浸种２天后，室温（28℃）下萌发２天。
2、每组用２种材料，即１种对照和１种NaCl处理。
四、试剂配制 :1.水合茚三酮试剂: 称取0.6克再结晶的茚三酮置烧杯中，加入15毫升正丙醇，搅拌使其溶解。
再加入30毫升正丁醇及60毫升乙二醇，最后加入9毫升pH5.4的乙酸—乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，置冰箱中保存备用，10天之内有效。
2. 乙酸—乙酸钠缓冲液（pH为5.4）：称取化学纯乙酸钠54.4克，加100毫升无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至原体积的一半。
冷却后加30毫升冰乙酸，用无氨蒸馏水稀释至100毫升。
3. 标准氨基酸：称取80℃下烘干的亮氨酸46.8毫克，溶解在10%的异丙醇中，并用10%异丙醇稀释至100毫升。
取此液5毫升，用蒸馏水稀释至50毫升，即为每毫升含氮5微克的标准液。
4.0.1%抗坏血酸：称取50毫克抗坏血酸溶于50毫升无氨蒸馏水中，随用随配。
五、操作步骤：1、样品制备：称取水稻萌发种子1克于研钵中，加入2ml10%乙酸、石英砂，充分研成匀浆，再加入3ml10%乙酸，研磨均匀后用蒸馏水洗入100ml容量瓶并用蒸馏水定容至100ml。
混匀后用干燥滤纸过滤到三角瓶中备用。
2、标准曲线的绘制：取8支试管，按下表编号、加试剂。
2、样品测定：取3支20ml刻度试管，按下表编号、加试剂。
加完试剂后，混匀，盖上玻塞，置沸水浴中加热15分钟，然后取出放在冷水浴中迅速冷却并经常摇动，使加热时形成的红色逐渐被空气氧化而褪色，直至溶液呈蓝紫色时，用60%的乙醇定容至20毫升，摇匀，用光径为1厘米的比色杯，在波长570nm下测定其消光值，制作标准曲线。
3、样品测定：取2支试管，分别加入2亳升过滤液，加入0.1%抗坏血酸0.1毫升，水合茚三酮3ml,混匀加盖，置沸水浴加热15min，取出后用冷水迅速冷却，用60%乙醇定容至20ml。
氨基酸总量的测定
氨基酸总量的测定(茚三酮比色法)一、方法原理：氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，可产生二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，据此可以比色测定氨基酸含量。
二、试剂：1．2％茚三酮溶液：1g茚三酮(C9H403·2H2O)溶于25ml热水中，加入40mg氯化亚锡；(SnCl2·2H2O)，搅拌溶解，滤去残渣，滹液放在冷暗处过夜，用水定容为50ml，保存声冷暗处。
如茚三酮有微红色，配成的溶液也带红色，将影响比色测定，需将茚三酮重结晶后再用方法是：取5g茚三酮溶于20ml热水中，加入0.2g活性炭，轻轻摇动，放三十分钟后过滤，滤液置冰箱中过夜，次日过滤，用1ml冷水淋洗结晶，然后放在干燥器中干燥，装瓶保存。
2。
磷酸盐缓冲液(pH8.0)：①1／15mol/l磷酸二氢钾溶液：取KH2P04 0.9070g溶于lOOml水中。
②1／15mol/l磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)23.876g溶于水，加水至1000ml。
取①50ml与②95ml混匀即得。
3．10％醋酸：取lOml冰醋酸加水至lOOml。
4，氨基酸标准溶液(200ppm)：称取干燥的氨基酸(白氨酸，或其它的氨基酸)0.2000g溶解于水，定容为1000ml。
三、仪器：水浴，721分光光度计。
四、操作步骤：(一)标准曲线绘制：分别吸取氨基酸标准溶液(200ppm)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml各置于25ml容量瓶中,加水补充至4.0ml，各加入缓冲液lml，加入茚三酮lml，摇匀。
置沸水浴中加热15分钟，取出迅速冷却至室温，—用水定容。
放置15分钟，在570nm波长下测定，绘制标准曲线。
氨基酸浓度分别为0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.Oppm。
(二)样品测定：l提取样品：称取1.0 ~2.0g植物样品(新鲜样或干样)，加5m1 10％醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入lOOml容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。
氨基酸的定量测定
6、三硝基苯磺酸法
原理： 三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。 TNBS 在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成中间络合物。 中间络合物在光谱上有2个吸收值相近的高峰，分别位于355nm 和420nm 附近。然而溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯 -氨 基酸（TNP-氨基酸），420nm 处的吸收值显著下降，而350nm 附近 的吸收峰则移至340nm 处。 利用 TNBS 与氨基酸反应的这一特性，可在420nm 处（偏碱性 溶液中）或在340nm（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。在 340nm 处，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 处的吸光度因 2 氨基酸种类而异；在加入适量 SO3 时，吸收值升高。 本法允许的测定范围是 0.05～0.4μmol 氨基酸。
1、甲醛滴定法
计算结果：
氨基酸态氮含量=
(V2 V1 ) c 0.014 100 % m
式中：c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积， mL m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g 1 0.014—— N2毫摩尔质量，g/mmol
100%
式中：VHClO ——所消耗的高氯酸标准溶液的体积 cHClO ——所消耗的高氯酸标准溶液的浓度 M——被测氨基酸的摩尔质量 m——被测氨基酸的质量
4
4、非水溶液滴定法
②回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨 基酸样品30~40mg 左右，溶解于5mL高氯酸标准溶液中，加2滴甲基紫指示剂，剩 余的酸以醋酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不褪的紫色为 终点。 氨基酸含量=
氨基酸总量的测定
一、单指示剂甲醛滴定法
3.操作步骤
（1）样品称量：称取一定量样品(约含20mg的氨基酸)于烧杯 中(如为固体加水50mL)； （2）滴加指示剂：加2-3滴0.1%百里酚酞乙醇溶液 （3）NaOH标准溶液滴定：用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定至 淡蓝色。 （4）加入甲醛生成羟甲基衍生物：加入中性甲醛20mL，摇匀 ，静置1分钟，此时蓝色应消失。 （5）NaOH标准溶液再次滴定：再用0.1mol/L NaOH溶液滴定 至淡蓝色。记录两次滴定所消耗的碱液体积mL。
7.思考题 ■ 甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么? ■ 为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—NH+3基上的H+，
不能用一般的酸碱指示剂？
氨基酸总量的测定
氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的统称， 氨基酸不是单纯的一种物质，有时多种氨基酸可以共存。 所以不能以氨基酸百分率来表示氨基酸含量，而需要测定 总的氨基酸量，以氨基酸中所含的氮(氨基酸态氮)的百分 率表示。
基衍生物，使上述平衡右移，促使－NH3释放H＋，使溶液 的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内（PH9.0 左右）。因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液 滴定放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
任务一 氨基酸总量的测 定
一、单指示剂甲醛滴定法
R-CH-COONH3+
R-CH-COO+ H+ NaOH
若样品中只含有一种氨基酸，就可以从含氮量计算出 氨基酸的含量。
■ 氨基酸总量测定方法主要有单指示剂甲醛 滴定法、双指示剂甲醛滴定法和茚三酮比色法。
氨基酸总量的测定 二、双指示剂甲醛滴定法测定
氨基酸总量的测定
氨基酸总量(氨态氮)的测定一、目的与原理：1、了解掌握单指示剂与双指示剂甲醛滴定法测氨基酸总量的方法与原理：二、单指示剂甲醛滴定法：(一)原理：氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基显示酸性，又含有-NH2基显示碱性。
由于这二个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。
当参加甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反响式可能以下面三种形式存在。
〔二〕试剂(1)40％中性甲醛溶液，以麝香草酚酞为指示剂，用1N NaOH溶液中和。
(2)0.1％麝香草酚酞乙醇溶液。
(3)0.100N氢氧化钠标准溶液。
(三)操作步骤：称取一定量样品(约含20毫克左右的氨基酸)于烧杯中(如为固体加水50毫升)，加2-3滴指示剂，用0.1OON NaOH溶液滴定至淡蓝色。
参加中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此时蓝色应消失。
再用0.1OON NaOH 溶液滴定至淡蓝色。
记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算计算：氨基酸态氮(％)=( N V×0.014×100)/W式中：N：NaOH标准溶液当量浓渡。
V：NaOH标准溶液消耗的总量(m1)W：样品溶液相当样品重量(克)。
0.014：氮的毫克当量。
三、双指示剂甲醛滴定法：(一)原理：与单色法一样，只是在此法中使用了两种指示剂。
从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂，不作介绍)相近单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液PH值作为麝香草酚酞的终点。
PH值在9.2，而双指示剂是以氨基酸溶液的PH 值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法较为准确。
(二)试剂：(1)三种试剂同单指示剂法(2)0.1％中性红(50％乙醇溶液)(三)操作步骤：取一样的两份样品，分别注入100毫升三角烧瓶中，一份参加中性红指示剂2-3滴，用0.100N NaOHOH准溶液滴定至淡蓝色。
食品中氨基酸总量的测定实验报告
食品中氨基酸总量的测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定食品中氨基酸的总量，了解食品中蛋白质的营养价值，并掌握氨基酸总量测定的基本原理和方法。
二、实验原理氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。
食品中的氨基酸可以通过与某些试剂反应，产生可检测的物质，从而进行定量分析。
本实验采用茚三酮比色法测定氨基酸总量。
茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸加热反应，生成蓝紫色化合物，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比。
通过比色测定吸光度，与标准曲线对照，即可计算出样品中氨基酸的总量。
三、实验材料与设备1、实验材料待测食品样品（如鸡蛋、牛奶、肉类等）标准氨基酸溶液（已知浓度）茚三酮试剂磷酸缓冲液（pH 54）乙醇蒸馏水2、实验设备分光光度计恒温水浴锅容量瓶（100 mL、50 mL、25 mL 等）移液管（1 mL、2 mL、5 mL 等）具塞刻度试管（25 mL）漏斗滤纸四、实验步骤1、样品处理称取适量的待测食品样品，精确至 0001 g，置于研钵中研磨成匀浆。
将匀浆转移至容量瓶中，用蒸馏水多次冲洗研钵，洗液并入容量瓶中，定容至刻度，摇匀。
用滤纸过滤上述溶液，滤液备用。
2、标准曲线的绘制分别吸取 00 mL、02 mL、04 mL、06 mL、08 mL、10 mL 标准氨基酸溶液于 25 mL 具塞刻度试管中，用蒸馏水补充至 10 mL。
向各试管中加入 10 mL 磷酸缓冲液（pH 54）和 10 mL 茚三酮试剂，摇匀。
将试管置于沸水浴中加热 15 min，取出后迅速冷却至室温。
用蒸馏水定容至 25 mL，摇匀。
以蒸馏水为空白对照，在 570 nm 波长处测定各溶液的吸光度。
以氨基酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3、样品测定吸取 10 mL 样品滤液于 25 mL 具塞刻度试管中，按照绘制标准曲线的步骤进行操作，测定样品溶液的吸光度。
五、实验结果与计算1、实验结果记录标准曲线各点的浓度和吸光度。
食品中氨基酸总量的测定实验报告
食品中氨基酸总量的测定实验报告氨基酸含量的测定氨基酸含量的测定标准曲线绘制准确吸取200ug/ml的氨基酸标准溶液0.0，0.6，0.8，1.0,1.2，1.5，2.0ml，分别置于25ml容量瓶或比色管中，各加水补充至溶剂为4.0ml，然后加入茚三酮和磷酸缓冲溶液各1ml，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，再摇匀，加水至标线25ml，摇匀。
静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液夨订其余各溶液的吸光度A。
以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
样品的测定：将虾研磨冷却过滤后稀释10倍，吸取澄清的样品溶液1.5ml，平行三次，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，用测得的A值在标准曲线上即可查得氨基酸的微克数。
公式：氨基酸总量（ug/100g）=(c/m*1000)*100*10式中c是指从标准曲线上查得的氨基酸的ug数；M是指测定的样品溶液相当于样品的质量g；PH计酸度计测量ph的方法：(1)拿下笔帽(2)按on/off键，机器显示运作(3)将ph计放入待测液中(4)轻轻晃动ph计，保证内气泡逸出，使之于溶液充分接触，勿碰撞杯壁(5)ph计会立即显示数值，将笔置入待测液待数值稳定，30秒内将显示正确数值，(特：ph计数值上下浮动或不稳定是正常现象) (6)按hold键锁定数值，可在待测溶液外记录读取，继续按hold 键解除锁定(7)按on/off键关闭ph计(8)轻甩PH计测试笔上多于的水，用蒸馏水或脱离子水冲洗，盖上笔帽测量温度方法在测试模式下，温度数值与ph数值同步显示在液晶面板上，但在校准模式下不显示，数值默认为摄氏温度。
（一）挥发性盐基氮（TVB-N）的测定半微量定氮法（1）原理：蛋白质在酶和细菌的作用下分解后产生碱性含氮物质，有氨、伯胺、仲胺等，此类物质具有挥发性，可在碱性溶液中被蒸馏出来，用标准酸滴定，计算含量。
（2）试剂①氧化镁混悬液(10g/L)称取1.0g氧化镁，加100ml水，振摇成混悬液。
植物组织中游离氨基酸总量的测定
【试剂】1、 3%茚三酮试剂称3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到100ml容量瓶里,贮于棕色瓶中.此试剂应放在冷凉处,不宜久放,使用期约10天.2、氰酸盐缓冲液（按以下方法配制）：（1）NaCN贮备液0.01mol/L（490mg/L）.（2）醋酸缓冲液：称360g醋酸钠（含三分子结晶水）溶于约300ml无氨蒸馏水中,加66.67ml 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至1L.取溶液（1）20ml,用溶液（2）定容到1L.3、标准氨基酸精确称取在80℃下烘干的亮氨酸13.1mg（或α-丙氨酸8.9mg）溶于10%的异丙醇中,并在100ml容量瓶中用10%异丙醇稀释至刻度,混匀, 即为1mmol/L的标准氨基酸贮备液,置冰箱中保存.为了制备工作液,可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合,此液浓度为0.5mmol/L,即1ml含氨基酸0.5μmol,或氨基氮7μg.4、 95%乙醇；5、异丙醇（分析纯）.【操作步骤】1. 标准曲线的制作取20ml刻度试管18支,按下表15-1加入各试剂.加完试剂后混匀,在100℃水浴中加热12min（加热时封口）,取出在冷水中迅速冷却,立即于每管中加入5ml 95%乙醇,塞好塞子,猛摇试管,使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色,此时溶液呈蓝紫色.于570nm波长下测其光密度（以空白管为参比）,以氨基酸浓度为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线,求出直线方程.表15-1 各试管加入试剂量2. 样品提取选取有代表性的植物叶片（或其它组织）,洗净擦干,剪碎混匀,迅速称取0.10~0.20g（视氨基酸含量多少而定）,共称3份,分别加入20ml刻度试管中,再加蒸馏水10ml盖塞（或系上塑料薄膜）,置沸水浴中20min以提取游离氨基酸,到时取出在自来水中冷却,把上清液滤入25ml容量瓶中,之后再往试管中加5ml蒸馏水,置沸水浴上再加热10min,过滤并反复冲洗残渣,最后定容至刻度,摇匀.3. 样品测定另取4支洁净干燥的试管,其中3支分别加入0.5ml提取液,另一支加0.5ml蒸馏水,然后在上述4支试管中分别加入NaCN缓冲液、水合茚三酮各 0.5ml,加完试剂后盖塞,置沸水浴上加热12min,冷却后,再分别加5ml 95%乙醇,摇匀,以空白作参比,在波长570nm下测其光密度.根据光密度查标准曲线（或用回归方程计算）即可求出提取液中氨基酸的浓度.4. 计算游离氨基酸含量式中 C-由直线方程计算的值,即0.5ml试样中氨基酸的微摩尔数（μmol）；V-样品提取液经稀释后的总体积（ml）；W-样品重（g）.测定结果按表15-2记录.表15-2 游离氨基酸总量测定记载表测定日期：。
氨基酸总量测定方法
氨基酸总量测定方法咱今儿就来讲讲氨基酸总量测定方法，这可是个很有意思的事儿呢！你想想啊，氨基酸就像是我们身体里的小宝贝，它们的数量和状态对我们可重要啦！要说测定氨基酸总量，那方法可不少呢。
就好像我们要去一个地方，有好多条路可以走。
比如说茚三酮比色法，这就像是走一条大家都比较熟悉的大道，可靠又实用。
把样品和茚三酮试剂一混合，经过一系列反应，就能通过颜色的变化来大致知道氨基酸的量啦。
这多神奇呀！还有甲醛滴定法，这就好比是找到了一个特别的窍门。
利用甲醛和氨基酸的反应，然后通过滴定来确定数量。
是不是感觉很有意思呢？就像解开一个小小的谜题。
再说说电位滴定法吧，这就像是有个特别精准的仪器在帮我们把关，能非常准确地测量出氨基酸的量呢。
那我们在实际操作的时候可得注意一些小细节哦！就像做饭要掌握好火候一样，不能马虎。
比如试剂的选择，一定要挑质量好的呀，不然怎么能得出准确的结果呢？还有操作步骤，一步都不能错哦，不然就像走在路上迷路了一样。
你说，要是我们不认真对待这些方法，那不是就像闭着眼睛走路吗？能走到目的地才怪呢！所以呀，我们得好好琢磨这些方法，就像对待宝贝一样。
在测定的过程中，每一个环节都很关键呢。
从样品的处理到最后的数据分析，都需要我们细心再细心。
这可不是闹着玩的事儿呀！而且呀，不同的样品可能需要不同的方法来测定氨基酸总量呢。
这就好像不同的人穿不同的衣服才合适一样。
你总不能给一个大人穿小孩的衣服吧？总之呢，氨基酸总量测定方法是个很有学问的事儿，我们可得好好研究研究。
只有这样，我们才能真正了解氨基酸的奥秘，才能更好地为我们的健康服务呀！这可不是开玩笑的哦！。
食品氨基酸总量的测定(精)
第八章 食品氨基酸总量的测定【教学目标】：1.掌握氨基酸、含氮量等的概念和相关知识；2.掌握氨基酸液氮的测定方法和操作技能；3.了解比色法的原理，基本方法及仪器使用和维护的知识。
一、甲醛滴定法1原理氨基酸具有酸性的一COOH 基和碱性的一N 2H 基。
它们互相作用使氨基酸成为中性的内盐。
加入甲醛溶液时，一N 2H 基与甲醛结合，其碱性消失。
这样就可能用碱来滴定一COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸的量。
用碱完全中和一COOH 基时的pH 值为8.4~9.2。
2试剂（1）40%中性甲醛：用百里酚酞作指示剂，将甲醋用碱溶液中和至淡蓝色。
（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。
（3）0.1N 氢氧化钠标准溶液。
3操作方法称取粉碎样品5.00~10.00g 或液体样品5~10mL,置于烧杯中，加入50mL 水和活性碳约5g ，加热煮沸，过滤，用30~40mL 热水洗涤活性碳，收集滤液于三角瓶中，加入3滴百里酚酞指示剂，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。
加入中性甲醛20mL ，摇匀，静置1min ，此时蓝色已经消失，再用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。
记录第二次滴定时消耗的碱液毫升数。
4计算氨基酸态氮（%）=100014.0⨯⨯⨯WV N 式中：N----氢氧化钠标准溶液的当量浓度；V----氢氧化钠钠标准溶液的消耗量（第二次）（g ）;W----样品溶液相当于样品的量（g ）;0．014----氮的毫克当量。
5说明（1）用碱性溶液第一次滴定时，用pH 计控制滴定到溶液pH7.5后，然后加入中性甲醛继续用碱液滴定，又用pH 计控制用碱液滴定样液至pH9.2为终点较为正确。
（2）取相同2份样品溶液，其中1份加入中性红指示剂3滴，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至琥珀色为终点，另1份加入百里酚酞指示剂3滴和中性甲醛20mL ，静置1min 后，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。
按下列、公式计算：100014.0)((%)12⨯⨯-⨯==WV V N X 氨基酸 式中： 2V ------用百里酚蓝作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL ）；1V ------用中性红作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL ）；N ------标准氢氧化钠溶液的当量浓度；W------样品重量（g ）；0.014----氮的毫克当量。
氨基酸测定方法
氨基酸测定方法一、引言氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，对于生命体的生长和发育起着重要的作用。
因此，准确测定氨基酸的含量和组成对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
本文将介绍一些常用的氨基酸测定方法，包括色谱法、光谱法和化学法等。
二、色谱法测定氨基酸2.1 气相色谱法气相色谱法是测定氨基酸含量和组成的常用方法之一。
该方法通过将氨基酸样品转化为易挥发的衍生物，然后使用气相色谱仪进行分析。
气相色谱法具有分离效果好、灵敏度高和操作简便等优点。
2.1.1 衍生化反应在气相色谱法中，常用的氨基酸衍生化反应包括酯化、酰化和取代反应等。
这些反应能够将氨基酸转化为易挥发的衍生物，便于后续的气相色谱分析。
2.1.2 气相色谱仪气相色谱仪是进行气相色谱分析的关键设备。
它由进样系统、色谱柱和检测器等部分组成。
进样系统用于将样品引入色谱柱，色谱柱用于分离氨基酸衍生物，检测器用于检测分离后的化合物。
2.2 液相色谱法液相色谱法也是测定氨基酸含量和组成的常用方法之一。
该方法通过将氨基酸样品溶解在溶剂中，然后使用液相色谱仪进行分析。
液相色谱法具有分离效果好、灵敏度高和选择性强等优点。
2.2.1 色谱柱选择在液相色谱法中，选择合适的色谱柱对于分离氨基酸非常重要。
常用的色谱柱包括离子交换柱、反相柱和手性柱等。
不同的色谱柱具有不同的分离机理和选择性，可以根据需要选择合适的色谱柱。
2.2.2 梯度洗脱条件在液相色谱法中，通过调整洗脱溶剂的组成和流速等参数，可以实现对氨基酸的有效分离。
梯度洗脱条件可以根据氨基酸的亲水性和极性等特性进行优化。
三、光谱法测定氨基酸3.1 紫外-可见光谱法紫外-可见光谱法是测定氨基酸含量和组成的常用方法之一。
该方法通过测量氨基酸在紫外-可见光波段的吸收特性，来推断其含量和组成。
紫外-可见光谱法具有操作简便、灵敏度高和选择性强等优点。
3.1.1 吸收峰特征不同氨基酸在紫外-可见光谱中具有不同的吸收峰特征。
通过测量氨基酸的吸收峰强度和位置，可以推断其含量和组成。
实验20植物组织中游离氨基酸总量的测定
实验20植物组织中游离氨基酸总量的测定（茚三酮显色法）氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。
植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输。
所以，测定植物组织中不同时期、不同部位游离氨基酸的含量对于研究根系生理、氮素代谢有一定意义。
一、原理氨基酸与茚三酮共热时，能定量地生成二酮茚胺。
该产物显示蓝紫色，称为 Ruhemans 紫。
其吸收峰在 570 nm ，而且在一定范围内吸光度与氨基酸浓度成正比。
氨基酸与茚三酮的反应分两步进行，第一步：氨基酸被氧化形成 CO 2 、 NH 3 和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步：所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和一分子氨脱水缩合生成二酮茚–二酮茚胺（ Ruhemans 紫），反应式如下：在一定范围内，反应体系颜色的深浅与游离氨基的含量成正比，因此，可用分光光度法测定其含量。
二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料各种植物组织。
（二）试剂1. 水合茚三酮试剂：称取 0.6 g 再结晶的茚三酮置烧杯中，加入 15 mL 正丙醇，搅拌使其溶解。
再加入 30 mL 正丁醇及 60 mL 乙二醇，最后加入 9 mL pH5.4 的乙酸–乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，置 4 ℃下保存备用， 10 d 内有效。
2. 乙酸–乙酸钠缓冲液（ pH 5.4 ）：称取乙酸钠 54.4 g 加入 100 mL 无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至 60 mL 左右。
冷却后转入 100 mL 容量瓶中加 30 mL 冰醋酸，再用无氨蒸馏水稀释至 100 mL 。
3. 标准氨基酸：称取80 ℃下烘干的亮氨酸 46.8 mg ，溶于少量 10 ％异丙醇中，用 10 ％异丙醇定容至 100 mL 。
取该溶液 5 mL ，用蒸馏水稀释至 50 mL ，即为含氨基氮 5 μ g/mL 的标准氨基酸溶液。
4. 0.1 ％抗坏血酸：称取 50 mg 抗坏血酸，溶于 50 mL 无氨蒸馏水中，随配随用。
氨基酸的含量测定方法
氨基酸的含量测定方法
氨基酸的含量可以用不同的方法进行测定，以下是其中几种常用的方法：
1. 紫外吸收法（UV法）：氨基酸分子中存在芳香族环和烯烃键，可以吸收紫外光，根据吸收的强度来确定氨基酸的浓度。
2. 高效液相色谱法（HPLC法）：这是一种常用的测定氨基酸含量的方法，通过将样品中的氨基酸溶解后注入液相色谱仪中，利用氨基酸在不同条件下的保留时间和峰面积来测定其含量。
3. 伯里特法：伯里特试剂能与氨基酸发生比色反应，该方法适用于测定含有酪蛋白、皮质素等色泽较重的氨基酸的含量。
4. 显色法：该方法将氨基酸和特定试剂反应，生成显色产物，根据产物的颜色深浅来测定氨基酸含量。
常用的显色试剂有二。
实验7——茚三酮法测定氨基酸总量
（2）标准曲线的绘制及样品测定
1 水 氨基酸标准溶液 茚三酮 1.6 0 0.4 2 1.3 0.3 0.4 3 1.2 0.4 0.4 4 1.1 0.5 0.4 5 1.0 0.6 0.4
单位：mL
6 0.9 0.7 0.4
7、8、9 1.0 0.6样品 0.4
磷酸盐缓冲液
0.4
0.4
0.4
0.4
2标准曲线的绘制及样品测定16131211100910氨基酸标准溶液030405060706样品茚三酮04040404040404磷酸盐缓冲液04040404040404各种试剂加到比色管后混匀于水浴锅上沸水浴15min取出冷却至室温后加水至10ml刻度线静置15min后在570nm处测定吸光值以氨基酸含量为横坐标吸光值为纵坐标绘制标准曲线
1．实验原理
凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽
、氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚
三酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在
570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基
酸含量成正比，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：
2. 实验材料、仪器与试剂 材料：酱油 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶， 移液管，具塞刻度试管。 试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸 氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
5. 注意事项 （1）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄 色，最大吸收波长在440nm处。 （2）有颜色的样品必需经脱色处理至无色 后方可使用。
试剂配制：讲义P32
（1）2%茚三酮溶液
（2）pH8.04的磷酸缓冲液 （3）氨基酸标准溶液：200μg/mL异亮 氨酸标准溶液。
3. 实验步骤 （1）样品的处理：量取0.5mL酱油于50mL 烧杯中，加入5g活性炭和40mL的蒸馏水，在 电炉上加热至80℃左右，保持半小时后过滤 至100mL容量瓶中，用蒸馏水将滤渣清洗数 遍后转移容量瓶中，定容至刻度线备用。
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氨基酸总量的测定
(茚三酮比色法)
一、方法原理：
氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，可产生二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，据此可以比色测定氨基酸含量。
二、试剂：
1．2％茚三酮溶液：1g茚三酮(C9H403·2H2O)溶于25ml热水中，加入40mg氯化亚锡；(SnCl2·2H2O)，搅拌溶解，滤去残渣，滹液放在冷暗处过夜，用水定容为50ml，保存声冷暗处。
如茚三酮有微红色，配成的溶液也带红色，将影响比色测定，需将茚三酮重结晶后再用方法是：取5g茚三酮溶于20ml热水中，加入0.2g活性炭，轻轻摇动，放三十分钟后过滤，滤液置冰箱中过夜，次日过滤，用1ml冷水淋洗结晶，然后放在干燥器中干燥，装瓶保存。
2。
磷酸盐缓冲液(pH8.0)：
①1／15mol/l磷酸二氢钾溶液：取KH2P04 0.9070g溶于lOOml水中。
②1／15mol/l磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)23.876g溶于水，加水至1000ml。
取①50ml与②95ml混匀即得。
3．10％醋酸：取lOml冰醋酸加水至lOOml。
4，氨基酸标准溶液(200ppm)：称取干燥的氨基酸(白氨酸，或其它的氨基酸)0.2000g溶解于水，定容为1000ml。
三、仪器：
水浴，721分光光度计。
四、操作步骤：
(一)标准曲线绘制：
分别吸取氨基酸标准溶液(200ppm)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml各置于25ml容量瓶中,加水补充至4.0ml，各加入缓冲液lml，加入茚三酮lml，摇匀。
置沸水浴中加热15分钟，取出迅速冷却至室温，—用水定容。
放置15分钟，在570nm波长下测定，绘制标准曲线。
氨基酸浓度分别为0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.Oppm。
(二)样品测定：
l提取样品：称取1.0 ~2.0g植物样品(新鲜样或干样)，加5m1 10％醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入lOOml容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。
2．样品液测定：移取样品待测液l ~4毫升，放人25ml容量瓶中，加水至4.Oml，加缓冲液1ml，加茚三酮1ml，摇匀。
置沸水浴中加热15分钟，取出用冷水迅速冷却至室温，加水定容。
放置15分钟后，测定。
同时测定待测液空白值，扣除空白值后，从标准曲线上查得氨基酸的浓度。
五、结果计算：
氨基酸总量(mg％) =(ppm * l00 * 25 * 100)/(W * V * 1000)
= (ppm * 250)/(W * V)
式中：ppm--由标准曲线查得样品测定液氨基酸浓度；
W——称样品重(g)
V——吸取样品待测液体积(ml)
六。
注意事项：
1．配制茚三酮溶液的茚三酮和SnCl2都应该用五色晶体，配成的溶液一般应在10天内用完。
2．应控制反应溶液的pH才能得到重现性好的结果，反应液pH在6.2 ~ 6.4之间为宜，所加试液和缓冲液的量的比例可为2：1或1：1。
3．要控制加热温度和时间，温度过高容易褪色，温度低发色不全。
沸水浴中加热发色快，但可能受热不均匀及容易褪色，可以降低温度(80O C)，延长加热时间，使发色均匀。
也可以在
烘箱中加热，105O C烘10分钟。
4．茚三酮与氨萋酸反应生成的颜色在1小时内稳定，浓度高时褪色较快，应在发色稳定、加水定容后，在半小时内比色。
5．明显带色的试样，可以用活性炭脱色，但某些氨基酸(酪氨酸等)也被活性炭吸附，会使结果降低。
6．茚三酮与氨、胺类、氨基糖类、尿素、蛋白质等也发生反应，这些物质会干扰测定。
7．植物样品处理方法不同，游离氨基酸组成会有变化，应用分析结果时应说明样品处理。