人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆研究

人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆研究发表时间：2014-08-01T17:32:41.840Z 来源：《中外健康文摘》2014年第21期供稿作者：杨勇1 林琳2[导读] 过表达的蛋白酶抑制因子或者人工合成的蛋白酶抑制因子都能有效地阻断蛋白酶活性。

杨勇1 林琳2(1大连市妇幼保健院检验科辽宁大连 116033；2大连市友谊医院心内科辽宁大连 116001)【摘要】目的：阐明人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆过程，获得人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽克隆载体，为后续构建Hespintor原核表达载体奠定基础。

方法：提取pMD19-T Simple Vector-Hespintor克隆质粒后，应用RT-PCR法扩增Hespintor成熟肽基因片段，对Hespintor成熟肽克隆载体进行构建，及双酶切反应鉴定。

结果：琼脂糖凝胶电泳，在约230bp处可见1条特异性条带；蓝斑和白斑斑点数量比对大约为1：1，说明转化效率大约为50%左右；经Bam HⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，约230bp处的条带为所克隆的人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因片段。

结论：重组克隆质粒pMD19-T Simple Vector-Hespintor成熟肽基因构建成功。

【关键词】人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因克隆 RT-PCR【中图分类号】R39 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2014）21-0078-02在肿瘤的生长、血管生成以及侵润和转移过程中，除了生长因子与抑癌基因突变、细胞周期改变等尚有机制的参与外，蛋白酶扮演了最终共同途径的角色，并且在功能性或病理性组织重建过程中起到重要的作用[1]。

蛋白酶的活性可由多个层次进行调控[1-3]，但最直接的方法还是阻断蛋白酶的活性。

过表达的蛋白酶抑制因子或者人工合成的蛋白酶抑制因子都能有效地阻断蛋白酶活性，防止细胞外基质的降解[1,2,4]。

因此，蛋白酶抑制因子的作用被更多的研究和关注，其中对组织金属蛋白酶抑制因子的研究最为深入，遗憾的是其临床应用效果并不理想[2]。

丝氨酸蛋白酶抑制因子是一类丝氨酸蛋白酶活性调节因子，参与血凝、纤溶、炎症、免疫反应、胚胎发生和个体发育过程。

根据它们的序列、二硫键数目和三维结构，至少可以归类为18个非同源蛋白质家族。

其中，Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子是较为保守的家族之一，目前已发现10多种，其成员主要包括PSTI、TATI、RECKA、ECRG2以及鸟类的卵清蛋白、顶体蛋白抑制因子、弹性蛋白抑制因子、溶血酶抑制因子等[5-7]。

应用抑制性差减扣除杂交技术研究了HBV DNA聚合酶反式调节靶基因，从肝母细胞瘤细胞系HepG2中筛选得到一未知功能新基因，经RT-PCR验证后，结合生物信息学确定该新基因属于一种新Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子，命名为hespintor[8]。

同源分析表明，hespintor 具有与食管癌相关基因2高度同源的serpin基本结构。

由于ECRG2具有抑制肿瘤细胞的增值、侵袭及转移等作用，因此提示hespintor可能也具有抑制肿瘤的侵袭与转移的能力，它在细胞中的生物学功能以及抗肿瘤作用有待于深入研究[9-11]。

为了研究hespintor对肿瘤细胞的增值、侵袭和转移的抑制作用，采用基因克隆技术建立hespintor的原核表达体系及纯化方法，观察hespintor重组表达蛋白在体内外是否对肿瘤细胞而行增值具有抑制作用。

本文主要是阐明人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆过程，从而获得人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽克隆载体，为后续构建Hespintor原核表达载体奠定基础。

1.材料与方法1.1材料1.1.1菌株与质粒（1）大肠杆菌菌株E.coil DH5α感受态细胞由本大连大学医学院中心实验室提供。

（2）pMD19-T Simple Vector购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2引物设计与合成根据GenBank上公布的人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因序列, 通过运DNAman version4.0软件设计引物扩增人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因。

引物F1、F2自行设计交由宝生物工程（大连）有限公司合成。

F1 5'-GGATCCGCCTAAGCCCCG-3'F2 5'-GCGCAAGCTTATCACATTTTCCATATTTTTC-3'1.1.3 主要试剂1.1.4主要设备1.2方法1.2.1提取pMD19-T Simple Vector-Hespintor克隆质粒质粒提取试剂盒由TaKaRa公司提供，操作过程严格按照说明书进行,产物置于-40℃保存。

1.2.2 PCR扩增Hespintor成熟肽基因片段采用2×Taq PCR MasterMix，以pMD19-T Simple Vector-Hespintor克隆质粒为模板， F1/F2为引物，扩增Hespintor基因片段。

1.2.3回收纯化Hespintor成熟肽基因片段采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0切胶回收Hespintor成熟肽基因片段，并将其溶解于10μl无菌dH2O中。

1.2.4 Hespintor成熟肽克隆载体的构建采用pMD19-T Simple Vector试剂盒，利用T4 DNA连接酶把Hespintor成熟肽基因和pMD19-T Simple Vector连接在一起，成为一个新的重组分子。

1.2.5 重组子对E.coli DH5α感受态细胞的转染和筛选1.2.6提取Hespintor成熟肽克隆载体双酶切反应鉴定2.结果与分析2.1人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因鉴定取5ulPCR产物，在质量分数为2%琼脂糖凝胶上电泳，在约230bp处可见1条特异性条带（图1），与预期结果相符。

DL500 marker. DNA marker；1-7. Hespintor 成熟肽基因PCR产物.DL500 marker. DNA marker；1-7. PCR products of Hespintor mature peptide gene.图1 PCR产物电泳图2.2蓝白斑筛选鉴定取100-200μl转化混合物涂LB/Amp/X-Gal/IPTG平板，37℃先正置培养30min，后倒置培养过夜。

在LB/Amp/X-Gal/IPTG平板出现了蓝斑（阴性）和白斑（阳性）结果（图2）。

蓝斑和白斑斑点数量比对大约为1：1，说明转化效率大约为50%左右。

①蓝斑（-），培养的E.coli DH5α感受态细胞不含有重组质粒载体；②白斑（+），培养的E.coli DH5α感受态细胞含有重组质粒载体。

① Blue spot(-),E.coli DH5α competent cells Cultured do not contain recombinant plasmid;② White spot(+),E.coli DH5α competent cells Cultured contain recombinant plasmid.图2蓝白斑筛选鉴定图2.3 重组质粒pMD19-T Simple Vector-Hespintor的双酶切反应鉴定抽提重组质粒经Bam HⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，电泳出现2条带，其中1条带为载体质粒，约2692bp，另1条带为所克隆的人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因片段，约230bp（图3），与预期结果一致。

上述结果表明，重组克隆质粒pMD19-T Simple Vector-Hespintor成熟肽基因构建成功。

Marker Ⅲ. DNA marker；1-4. 重组载体的双酶切反应电泳图：①为pMD19-T克隆载体，②为Hespintor成熟肽基因片段。

Marker Ⅲ. DNA marker；1-6. Electrophoresismap for DNA double restriction of recombinant vector: ①pMD19-T Simple Vector,②The fragment of Hespintor mature peptide gene.图3重组载体的双酶切反应电泳图3.讨论乙型肝炎病毒(HBV)基因组及其编码蛋白与肝细胞基因及蛋白之间的相互作用过程中涉及复杂的反式调节机制[12]。

某些HBV基因的编码蛋白具有反式激活细胞内相关基因表达的作用，而抑制性差减扣除杂交技术可有效分离扩增低丰度特异表达的基因，是目前较为成熟的筛选反式调节新基因的技术途径。

应用该技术研究了HBV RT/DNA 聚合酶反式调节靶基因，从肝母细胞瘤细胞系HepG2 中筛选得到一未知功能新基因，经RT-PCR 验证后，结合生物信息学确定该新基因属于一种新Kazal 型丝氨酸蛋白酶抑制因子，命名为Hespintor。

蛋白质序列比较分析表明，hespintor的结构[8]可分为3部分：N端1-23氨基酸残基编码信号肽，表明其具有跨膜分泌的特点；C 端35-93 氨基酸残基编码一个典型的Kazal 结构域，具有与ECRG2 高度同源的serpin 基本结构；在信号肽与Kazal 结构域之间的24-34 氨基酸残基即构成了连接区。

因此，Hespintor 属于Kazal 型丝氨酸蛋白酶抑制因子家族中的一个分泌型新成员。

经Unigene数据库搜索分析发现，Hespintor基因定位于人类5号染色体长臂3区3带1亚带（5q33.1），在多种正常组织中均有表达，但在肿瘤细胞（除生殖细胞瘤外）中不表达。

同源分析表明[8]，hespintor具有与食管癌相关基因2（esophageal cancer related gene 2,ECRG2）高度同源的serpin基本结构。

由于ECRG2具有抑制肿瘤细胞的增值、侵袭及转移等作用，因此强烈提示hespintor的表达缺失可能与瘤的侵袭与转移相关。

为成功构建Hespintor表达载体，表达结构完整和有功能的Hespintor成熟肽，通过设计特意的PCR引物，PCR产物去除了位于N端1-23氨基酸残基编码信号肽的序列，仅仅保留Hespintor成熟肽基因序列，成功构建pMD19-T Simple Vector-Hespintor成熟肽克隆载体，为后续Hespintor成熟肽基因原核表达载体构建及蛋白的表达与纯化提供个良好的条件。

本实验采用的pMD19-T Simple Vector属于一种T载体。